中国农业科学

中国农业科学. 2021, 54(5): 0.

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过量表达OsRRK1对水稻叶片发育的影响

马银花,莫凯琴,刘璐,李萍芳,金晨钟,杨芳

中国农业科学. 2021, 54(5): 877-886. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.05.001

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【目的】OsRRK1（rop-interacting receptor-like kinase 1）属于胞质类受体激酶RLCK Ⅵ家族成员,通过对OE-OsRRK1转基因水稻的叶片形态观察,明确OsRRK1在水稻叶片发育中的作用。【方法】依据水稻基因组数据库公布的目标序列设计引物并构建OsRRK1超量表达载体,利用农杆菌介导的遗传转化转入到粳稻品种合江19,通过PCR分析鉴定阳性植株,Southern blot鉴定转基因植株插入外源基因的拷贝数,Northern blot杂交和qRT-PCR鉴定转基因植株在RNA水平的表达情况;选取T₂代纯合植株抽穗期的剑叶进行叶片卷曲指数（leaf rolling index,LRI）测定;通过石蜡切片和苯胺蓝染色观察水稻横切后泡状细胞的变化情况,用Image J软件统计泡状细胞的面积;采用叶绿素测定计测量植株叶片叶绿素含量。【结果】共获得OE-OsRRK1转基因阳性植株44株,随机选取17株,经Southern blot鉴定8株为单拷贝株系,9株为多拷贝株系;随机选取2份多拷贝株系（OE-1和OE-4）和5份单拷贝株系（OE-5、OE-21、OE-22、OE-24和OE-25）用于后续试验。经分析发现OsRRK1在不同的转基因株系中具有不同程度的过表达情况,其中OE-1、OE-4和OE-25株系超量表达程度高,OE-5株系超量表达程度低,OE-21、OE-22和OE-24株系超量表达程度居中。从中选取OE-5、OE-22和OE-25共3份单拷贝转基因株系和WT对照经Northern blot鉴定后与qRT-PCR结果一致。统计选取的7个株系和WT对照的叶片卷曲指数发现：卷曲程度与OsRRK1表达量呈正相关,表达量越高卷曲程度越高。水稻叶片经切片和染色后发现OE-OsRRK1转基因植株叶片中泡状细胞发生了明显变化,转基因株系中泡状细胞数目都小于对照中泡状细胞均值4.6个。叶片卷曲得越明显,泡状细胞退化得越严重,数目更少,面积更小。经叶绿素含量测定发现,OE-22、OE-24和OE-25转基因的水稻叶片的叶绿素含量比野生型水稻叶片叶绿素含量高。【结论】过量表达OsRRK1会影响泡状细胞的数目和面积,从而使水稻叶片发生卷曲,且卷曲程度与表达量呈正相关;OsRRK1在水稻中的过量表达导致叶绿素含量增高。

基于近红外光谱的大豆茎秆化学组分含量检测模型构建与应用

李佳佳,洪慧龙,万明月,储丽,赵敬会,汪明华,徐志鹏,张阴,黄志平,张文明,王晓波,邱丽娟

中国农业科学. 2021, 54(5): 887-900. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.05.002

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【目的】大豆茎秆化学组分（纤维素、半纤维素、木质素和粗纤维等）与其茎秆抗倒伏能力密切相关,但由于目前大豆茎秆化学组分检测多采用传统的化学分析技术,测定过程操作复杂、耗时耗力、成本昂贵且易造成环境污染,不适合大规模育种应用,因此,通过构建一套低成本、快速、科学、无污染的大豆茎秆化学组分检测方法,为大豆种质资源茎秆组分分布规律及其与大豆生长习性和倒伏性关系的研究提供方法基础。【方法】通过建立一套基于近红外光谱检测技术的大豆茎秆化学组分检测模型,并利用该模型对大豆种质资源茎秆中的中性洗涤纤维（neutral detergent fiber,NDF）、酸性洗涤纤维（acid detergent fiber,ADF）和粗纤维（crude fiber,CF）等化学组分进行检测分析,通过方差分析、多重比较和小提琴图分析,明确大豆茎秆CF含量与其生长习性及抗倒伏性之间的内在关系。【结果】基于构建的大豆茎秆化学组分近红外光谱快速检测模型对茎秆NDF、ADF和CF组分检测数值的校正相关系数（R_C）均在0.90以上。利用16份模型外大豆茎秆样本对模型的有效性进行验证发现,常规化学检测与该模型检测结果之间无显著性差异（P > 0.05）。利用该模型对2017年和2018年种植的393份大豆茎秆CF含量及其生长习性之间的关系进行分析,结果表明,大豆茎秆CF含量符合正态分布规律,在CF含量50.00%以上的材料中,2年数据均表现出直立型（91.67%和86.14%）显著高于蔓生型（8.33%和13.86%）,表明大豆茎秆CF含量与其生长习性呈极显著正相关（P < 0.01）。【结论】构建的近红外光谱模型具有低成本、快速高效、无污染的特点。此外,茎秆中CF含量高的大豆品种植株具有更强的抗弯曲度,可作为大豆抗倒伏育种亲本筛选的重要指标。

色差分析在优质小米选育中的应用

张婷,王根平,罗焱杰,李琳,高翔,程汝宏,师志刚,董立,张喜瑞,杨伟红,许立闪

中国农业科学. 2021, 54(5): 901-908. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.05.003

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【目的】分析近三届参加全国优质米评选谷子品种的色差,并与专家感官评价结果相结合,为提高优质米育种水平提供依据。【方法】统计2015年、2017年、2019年近三届参加优质米评选的谷子品种情况;分析色差测定结果L*值、a*值、b*值,并与商品性得分、蒸饭得分、煮饭得分和总分进行相关性分析;建立一级优质米的回归模型。【结果】近三届参加优质米评选的谷子参试品种数量呈增长的趋势,增加了82.3%,其中,夏谷区增加了60.0%,春谷区增加了100.0%,一级优质米的数量增加了133.3%;87.5%的一级优质米由7家科研单位育成;93.7%的品种杂交选育而成;抗除草剂类型占62.5%。一级优质米类型中,夏谷L*值变异范围为55.05—66.03,春谷L*值变异范围为53.12—68.84;夏谷a*值变异范围为1.63—8.74,春谷a*值变异范围为2.13—8.59;夏谷b*值变异范围为54.50—75.35,春谷b*值变异范围为40.07—71.40。所有参试品种及一级优质米的L*值、a*值、b*值均呈增加的趋势;与夏谷相比,春谷的b*值变异更大,色彩丰富度更高。总分、商品性得分和L*值、a*值、b*值呈显著相关,蒸饭得分和L*值、a*值呈显著相关,煮饭得分和L*值、a*值、b*值相关性不显著;商品性得分和总分的相关性最高,相关系数达0.7528;商品性得分和蒸饭得分极显著正相关,和煮饭得分不相关。一级优质米的回归模型中,L*值、a*值、b*值决定了总分74.3%的变异。夏谷区商品性和总分前10名的品种主要分为2种类型：一种是a*值较低,L*值和b*值较高的金黄色品种,如冀谷39、豫谷33;一种是a*值较高,L*值和b*值较低的浅黄偏红品种,如济谷19、冀谷42。春谷区商品性和总分前10名的品种主要分为3种类型：一种是L*值较低,a*值和b*值较高的深黄品种,如2015KM826F7-75、峰红4号;一种是L*值较高,a*值和b*值较低的浅黄品种,如榆谷抗1、赤红1号;一种是a*值较高,L*值和b*值较低的浅黄偏红品种,如张杂谷13、晋汾106。【结论】近三届参加优质米评选的谷子品种呈增长趋势,优质将成为谷子品种改良的重要目标。商品性得分和总分的相关性最高。通过L*值、a*值、b*值对米色进行选择是一种直观、便捷的方法。外观品质与L*值、a*值、b*值都有关系,在品质育种中,要根据品种特点进行米色选择。

辽西半干旱区玉米大豆间作模式对作物干物质积累分配、产量及土地生产力的影响

蔡倩,孙占祥,郑家明,王文斌,白伟,冯良山,杨宁,向午燕,张哲,冯晨

中国农业科学. 2021, 54(5): 909-920. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.05.004

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【目的】通过分析玉米大豆间作模式作物干物质积累与分配规律及种间竞争关系,探讨玉米大豆间作的增产机理,提出适合辽西半干旱区的最优玉米大豆间作模式。【方法】试验于2018—2019年在国家农业环境阜新科学观测实验站进行,采用田间试验方法,设置2行玉米2行大豆间作（MS2:2）、4行玉米4行大豆间作（MS4:4）、6行玉米6行大豆间作（MS6:6）、玉米单作（M）、大豆单作（S）等5种种植模式,研究作物的干物质积累分配特点、种间竞争力及其对产量和土地生产力的影响。【结果】3种间作模式均提高了玉米拔节期和灌浆期的干物质积累量,比单作玉米分别增加16.58%—20.32%和51.29%—52.56%;间作对大豆分枝期和鼓粒期的干物质积累影响较小,但分枝期MS2:2间作模式干物质积累量显著低于单作大豆。玉米干物质分配比率拔节期叶大于茎,灌浆期穗大于茎、叶,且3种间作模式穗的分配比率比单作玉米增加23.22%—31.70%;大豆干物质分配比率分枝期茎大于叶,鼓粒期茎、叶大于荚果,MS2:2和MS4:4间作模式大豆荚果分配比率比单作大豆分别降低19.30%、17.22%,MS6:6间作模式与单作大豆差异不显著。间作模式下玉米比大豆表现出了更强的种间竞争力（Ams>0）和产量营养竞争比率（CRms>1）。MS6:6和MS4:4间作模式土地当量比LER分别为1.16、1.07,土地生产力提高7%—16%,具有显著的间作优势;MS2:2间作模式土地当量比为0.97,具有间作劣势。【结论】玉米大豆间作模式土地生产能力的提高主要是通过改变作物干物质积累分配及种间竞争关系实现,MS6:6和MS4:4间作模式优势明显。表现最佳的是MS6:6间作模式,该模式能够显著提高土地生产力,在当地农业生产中具有很好的应用价值。

马铃薯生长模型的研究进展及发展前景

唐建昭,王靖,肖登攀,潘学标

中国农业科学. 2021, 54(5): 921-932. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.05.005

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马铃薯是继玉米、小麦和水稻之后的第四大主粮作物,其生产对保障粮食安全具有重要意义。马铃薯生长模型广泛用于指导马铃薯产量差缩减、水肥利用效率提升、栽培管理措施优化以及气候变化适应等方面,本文系统综述了马铃薯生长模型的发展历程、应用领域及发展前景。马铃薯生长模型的研究始于20世纪80年代,将马铃薯生长发育过程表达为数学模型,主要包括生育期和干物质积累模块,该时期马铃薯生长模型多用于马铃薯生产潜力的评价;20世纪90年代为马铃薯生长模型发展和完善阶段,土壤水氮模块逐步加入马铃薯生长模型,该时期马铃薯生长模型开始应用到农业生产系统分析中,具备了优化马铃薯水氮管理措施的性能;21世纪后马铃薯生长模型在第二代模型的基础上,从农业生产系统的角度出发,考虑了气候变化的影响,将马铃薯生长对CO₂的响应模块加入到生长模型中,其机理性进一步加强。此后,马铃薯生长模型的应用更加深入,包括马铃薯产量差解析和缩差措施的提出、品种和播期等栽培管理措施优化以及气候变化影响评估和适应等。尽管马铃薯生长模型得到了广泛应用,但其在胁迫条件下的模拟精度需进一步评价。其次,马铃薯生长模型不能有效模拟马铃薯的大小薯比例,而商品薯的多少显著影响马铃薯的生产价值。此外,当前的马铃薯生长模型普遍缺乏对马铃薯生产有显著影响的病虫害模块。未来,应基于全球大数据、田间和控制试验,进一步提高马铃薯生长模型的机理性,同时加强马铃薯生长模型在育种、管理和环境耦合分析中的应用,并结合遥感数据和功能结构模型,发展新一代马铃薯生长模型,实现马铃薯生产智慧型管理。

智能手机原位牧草生物量估算

陶海玉,张爱武,庞海洋,康孝岩

中国农业科学. 2021, 54(5): 933-944. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.05.006

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【目的】生物量是草地生态系统物质和能量基础,是最基本的生态参量。以往基于卫星和航空遥感定量反演草地生物量过于专业化,难以在牧民间推广。因此,本文提出一种用手机近距离拍摄的真彩色图像估算牧草生物量方法,构建牧草生物量估算模型,为牧民方便、快捷、无损地掌握牧场牧草长势提供理论依据和技术支撑。【方法】首先,利用手机超高分辨率真彩色图像,分别基于植被指数、纹理特征以及联合植被指数和纹理特征构建牧草生物量估算特征集合。其次,为防止过多的特征提取带来维度灾难,提出一种XGBoost与序列前向选择相结合的特征选择算法（XGB-SFS）,进行特征筛选及最优子集构建。最后,使用随机森林回归和留一法交叉验证对比不同特征集合构建模型的生物量估算效果,分析不同类型特征及XGB-SFS算法在牧草地上生物量（Above Ground Biomass,AGB）估算中的作用。【结果】（1）对比单类型特征构建的模型,基于空间纹理特征的估算模型（R²=0.76）要优于基于光谱植被指数估算模型（R²=0.73）,表明纹理特征在超高分辨率牧草AGB估算中具有一定作用;（2）对比特征选择后的模型,联合空谱多类型特征构建模型优于任何一种单类型特征模型（R²=0.83,RMSE=127.57 g·m^-2,MAE=81.25 g·m^-2）,表明使用多类型特征构建模型,可一定程度上提高牧草AGB估算精度。（3）对比特征选择前后构建的模型,特征选择后的模型估算AGB效果要明显好于未进行特征选择的模型,且筛选出的特征与牧草生物量之间都存在较高的相关性,表明XGB-SFS能够很好降低数据维度的同时提高牧草AGB估算精度。【结论】手机超高分辨率真彩色图像可以对牧草生物量进行准确估算,本文提出的XGB-SFS算法也能从众多特征中筛选出与牧草生物量相关性较高的特征并提高模型估算精度。与以往专业遥感定量反演草地生物量相比,本文方法具有面向大众、成本低廉、使用方便等优势,研究将手机现场采集的数据与遥感和机器学习方法相结合,可开辟新的视角,支持农业信息化发展。

桃小食心虫化学感受蛋白CSP16配体结合特性

刘孝贺,仇贵生,佟兆国,张怀江,闫文涛,岳强,孙丽娜

中国农业科学. 2021, 54(5): 945-958. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.05.007

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【目的】桃小食心虫（Carposina sasakii）是我国北方果树生产中的重要害虫之一,本文通过体外表达桃小食心虫化学感受蛋白CsasCSP16,明确其与寄主挥发物分子和性信息素分子的结合特性,并通过生物信息学预测CsasCSP16与挥发物分子结合的关键氨基酸位点,为揭示桃小食心虫嗅觉的分子机理提供理论依据。【方法】通过原核表达系统获得CsasCSP16蛋白,并使用Ni-NTA柱纯化重组蛋白。采用荧光竞争结合的方法,以N-苯基-1-萘胺（N-pheny-1-naphthylamine,1-NPN）为荧光探针,从33种寄主挥发物和2种性信息素分子中筛选出与CsasCSP16结合亲和性高的配体分子。通过对CsasCSP16进行同源建模获得其三维结构模型,以CSPMbraA6（PDB ID：1N8U）为模板成功构建CsasCSP16的三维结构模型。使用Autodock Vina软件将CsasCSP16与亲和性高的配体分子进行对接,构建蛋白-配体复合物。然后使用GROMACS（2019.3）软件对复合物进行动力学模拟,从动力学模拟的平衡状态中选取100个构象,使用g_mmpbsa软件计算CsasCSP16与气味分子的结合能,并通过能量分解的方法预测关键氨基酸残基。【结果】成功构建了CsasCSP16的克隆表达载体,通过大肠杆菌原核表达系统获得高纯度的重组蛋白。与35种配体分子的荧光竞争结合表明,CsasCSP16与水杨酸甲酯、6-甲基-5-庚烯-2-酮、十五烷、庚酸丁酯和α-蒎烯有较强的结合活性,其Ki值分别为6.59、6.25、3.50、6.73和4.47 μmol·L^-1。分子对接的结果表明,CsasCSP16与水杨酸甲酯、6-甲基-5-庚烯-2-酮、十五烷、庚酸丁酯和α-蒎烯的Vina Score值分别为-6.1、-5.3、-5.8、-5.2和-6.6。动力学模拟结果表明,CsasCSP16与气味分子复合物在50 ns内达到平衡状态,通过g_mmpbsa计算复合物的结合能,CsasCSP16-水杨酸甲酯、CsasCSP16-6-甲基-5-庚烯-2-酮、CsasCSP16-十五烷和CsasCSP16-庚酸丁酯的结合自由能分别为-50.264、-65.551、-136.035和-93.805 kJ·mol^-1;最后,通过分解每个氨基酸贡献的结合自由能表明异亮氨酸49（Ile49）、缬氨酸71（Val71）、异亮氨酸72（Ile72）和酪氨酸90（Tyr90）贡献的结合能>3 kJ·mol^-1,因此推测这4种氨基酸在CsasCSP16结合气味分子的过程中发挥关键作用。【结论】桃小食心虫CsasCSP16能与寄主植物的多种气味分子结合,推测其可能在桃小食心虫对寄主植物的定位过程中发挥重要作用。异亮氨酸49（Ile49）、缬氨酸71（Val71）、异亮氨酸72（Ile72）和酪氨酸90（Tyr90）可能是CsasCSP16与配体分子结合的关键氨基酸位点。

单头饲养和群体饲养的西花蓟马实验种群生命表比较

李欣华,王登杰,雷仲仁,王海鸿

中国农业科学. 2021, 54(5): 959-968. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.05.008

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【目的】对西花蓟马（Frankliniella occidentalis）实验种群生命表的研究大多采用单头饲养（individual-rearing,IR)的方式,研究结果可用于田间自然情况下种群发生的预测。然而西花蓟马在自然情况下常常是群聚发生,而非单头发生。论文旨在比较单头饲养和群体饲养（group-rearing,GR）两种方式建立起的西花蓟马实验种群的生命表参数,探讨何种方式建立起的生命表用于预测自然条件下西花蓟马的发生情况可能更为准确。【方法】分别用单头饲养和群体饲养的方式构建西花蓟马实验种群在菜豆豆荚上的年龄-阶段两性生命表,比较两种饲养条件下西花蓟马的生活史和种群参数;采用bootstrap方法计算种群生长参数的平均数和标准误;应用U 检验（Mann-Whitney test）（Sigmaplot 12.5）估计单头饲养和群体饲养条件下西花蓟马种群参数、发育历期和繁殖力间的差异。【结果】单头饲养和群体饲养对若虫期、蛹期、雄虫寿命、总产卵前期、单雌产卵量、蛹重、成虫体长有显著影响, 对卵期、成虫期、成虫产卵前期、雌虫寿命、蛹长、蛹宽、成虫体宽的影响不显著。单头饲养西花蓟马的若虫期（4.49 d）、蛹期（4.03 d）、雄虫寿命（22.82 d）、总产卵前期（11.37 d）显著长于群体饲养（3.05、3.32、18.64、10.00 d）;单头饲养西花蓟马的蛹重（0.03 mg）、雌成虫体长（203.72 μm）、雄成虫体长（149.74 μm）、单雌产卵量（48粒）显著低于群体饲养（0.07 mg、288.81 μm、203.39 μm、133.39粒）。内禀增长率（r）、周限增长率（λ）、净增殖率（R₀）、总生殖率（GRR）和平均世代时间（T）在单头饲养的情况下分别为0.161 d^-1、1.175 d^-1、20.730、35.699、18.70 d,在群体饲养情况下分别为0.242 d^-1、1.274 d^-1、60.499、102.342、16.88 d。群体饲养的西花蓟马种群增长比单头饲养的快。【结论】相对于单头饲养的西花蓟马,群体饲养的西花蓟马种群增长速度更快、单位时间内产生后代数更多,若使用单头饲养方式建立生命表对西花蓟马种群发生动态进行预测预报可能会延误最佳防治时机,以群体饲养的方式建立的生命表对田间种群的动态预测应该更准确。

节节麦在山东省冬小麦田的扩散蔓延及对甲基二磺隆抗性测定

高兴祥,李健,张帅,张悦丽,房锋,李美,柏连阳,张双应

中国农业科学. 2021, 54(5): 969-979. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.05.009

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【背景】节节麦（Aegilops tauschii）是小麦的野生近缘植物,是世界公认的十大恶性杂草之一,可安全有效防除节节麦的除草剂品种很少,目前只有ALS抑制剂类除草剂甲基二磺隆作为苗后茎叶处理剂能够应用,该药剂在小麦田应用多年,部分区域发现效果下降,这可能与抗性有关。【目的】明确山东省冬小麦田节节麦扩散蔓延规律以及对甲基二磺隆的抗性水平和抗性机理,为制定山东省冬小麦田节节麦精准区域防控策略提供理论依据。【方法】分别于2009—2010、2013—2014、2018—2019年3次田间调查节节麦在山东省冬小麦田的分布,分析其扩散蔓延规律,室内采用整株生物测定法测定62个节节麦种群对甲基二磺隆的抗性水平,对中等抗性种群进行靶标基因序列检测。【结果】节节麦在山东省冬小麦田10年间呈现快速增长趋势,分布区域逐渐扩大,相对优势度逐渐增大。2009—2010年度,节节麦主要分布在山东西北平原区、中部山区和北部滨海区,平均相对优势度为3.18,在所有杂草中位列第8位;2013—2014年度,节节麦已在山东西北平原区等5个区域广泛分布,平均相对优势度达到7.33,位列第5位;2018—2019年度,节节麦在山东省全境大面积发生,平均相对优势度为11.38,位列第4位。62个节节麦种群中有20个种群对甲基二磺隆产生一定程度的抗性,这些抗性种群分布在节节麦发生早且用药时间长的西北平原区、西南平洼区和中部山区,其他区域未见抗性种群。其中低抗、中抗种群分别为16个（相对抗性指数在5.00—10.00）、4个（相对抗性指数在10.00—15.00）,分别占种群总数的25.81%和6.45%,最高相对抗性指数达到12.63,无高抗种群。对4个中抗种群进行靶标位点突变测定,未检测到位点突变。【结论】节节麦已在山东省7大种植区域大面积分布,且分布区域和相对优势度逐年提高。未有对甲基二磺隆高抗的节节麦种群产生,但已有32.26%种群产生低等或中等程度的抗性,未检测到靶标位点突变,可能是代谢酶引起的非靶标抗性。生产中应避免过分依赖甲基二磺隆进行节节麦防控,建议推广深翻、土壤封闭和苗后茎叶处理相结合的节节麦综合防控策略,延缓节节麦抗性发展。

秸秆添加量对土壤生物固氮速率和固氮菌群落特征的影响

李旭,董炜灵,宋阿琳,李艳玲,卢玉秋,王恩召,刘雄舵,王萌,范分良

中国农业科学. 2021, 54(5): 980-991. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.05.010

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【目的】研究不同秸秆添加量对土壤固氮速率及固氮菌群落结构的影响,为我国秸秆还田及化肥减施增效提供支持。【方法】采用室内培养试验,除对照（C0: 0）外共设5个秸秆添加梯度（C1：0.2 mg·g^-1;C2：1.0 mg·g^-1;C3：2.0 mg·g^-1;C4：4.0 mg·g^-1;C5：10.0 mg·g^-1）,采用¹⁵N₂标记的方法,在黑暗条件下培养28 d后收集土壤样品,进而对生物固氮速率进行定量,利用Illumina PE250高通量测序和荧光定量PCR技术分析固氮功能基因nifH的丰度及群落特征。【结果】随着秸秆添加量的增加,土壤硝态氮含量显著下降,铵态氮含量无显著变化,土壤pH有下降趋势。同时,生物固氮速率显著增加,C3、C4及C5处理在培养期间（28 d）潜在固氮速率为87—96 kg N·hm^-2·a^-1,相比于对照提高了38.1%—52.4%。各处理固氮微生物nifH基因拷贝数变化范围为5.48×10⁷—9.20×10⁷ copies/（g soil）,其中,相比于C0,C4及C5处理固氮微生物nifH基因拷贝数均显著提高（P<0.05）。随着秸秆添加量的增加,C4、C5水平的香农-威尔指数显著低于其他4个处理（P<0.05）,其他4个处理多样性无显著差异。主成分分析（PCoA）结果显示土壤固氮微生物群落结构主要因秸秆添加量差异而聚集为不同组别。固氮微生物在门水平上分为变形杆菌（Proteobacteria）,蓝细菌（Cyanobacteria）,厚壁菌（Firmicutes）和放线菌（Actinobacteria）和螺旋体菌（Spirochaetes）。随着秸秆添加量的增加,蓝细菌相对丰度有先增加再降低的趋势;在属水平上,不同优势菌属对秸秆添加量的响应存在明显差异,慢生根瘤菌（Bradyrhizobium）为数量最丰富菌属,随着秸秆添加量的增加,C5相较于C0、C1、C2、C3水平相对丰度差异显著（P<0.05）,显著增加了12.07%—14.13%。与生物固氮速率呈正相关的贺氏伪枝藻属（Scytonema hofmanni）随着秸秆添加量的增加其相对丰度逐渐增加,但当秸秆添加量达C5水平其相对丰度反而降低（P<0.05）。同时,最小偏二乘路径分析（PLS-PM）,冗余分析(RDA)及相关性分析表明生物固氮速率和土壤固氮微生物群落受秸秆添加量和NO₃^--N含量影响较大。【结论】土壤生物固氮速率随着秸秆添加量的增加而增加,秸秆对固氮的促进作用主要源于秸秆添加降低了土壤NO₃^--N含量,进而促进慢生根瘤菌（Bradyrhizobium）、贺氏伪枝藻属（Scytonema hofmanni）和固氮螺菌属（Azospirillum）等固氮菌属微生物的生长。根据本试验结果计算,相比于不添加秸秆,添加秸秆4.0 mg·g^-1后,土壤生物固氮速率约增加26 kg N·hm^-2·a^-1,可显著降低我国氮肥需求。

灌溉下限对设施土壤N₂O和NO排放特征的影响

张丽媛,吕金东,石欣悦,虞娜,邹洪涛,张玉玲,张玉龙

中国农业科学. 2021, 54(5): 992-1002. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.05.011

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【目的】合理灌溉是设施生产控制N₂O和NO排放,提高氮肥利用率的有效措施。研究不同灌水下限设施土壤N₂O和NO排放动态与土壤水分、无机氮和可溶性有机氮关系,分析N₂O和NO排放特征及影响因素,以期为N₂O、NO减排和设施土壤灌溉管理提供科学依据。【方法】基于连续7年的设施土壤不同灌溉下限的田间定位试验,以番茄为供试作物,设4个土壤水吸力处理,分别为25 kPa（W₁）、35 kPa（W₂）、45 kPa（W₃）和55 kPa（W₄）。采用密闭静态箱-气相色谱和氮氧化物分析仪法,分别对番茄生长季的N₂O和NO进行田间原位同步观测。【结果】番茄生长季不同灌水下限处理土壤N₂O和NO排放通量分别为 -34.46—1 671.78 μg N·m^-2·h^-1和6.83—269.89 μg N·m^-2·h^-1,二者排放峰值期同步且主要发生在施肥和灌溉后,各处理NO/N₂O均小于1。土壤N₂O和NO累积排放量分别为W₂和W₁处理最低（P <0.01）,各处理N₂O+NO总累积排放量表现为W₄处理>W₃处理>W₁处理>W₂处理。W₂处理番茄产量较W₁、W₃和W₄处理分别增加84%、32.4%和12%。单位产量N₂O+NO排放量表现为W₄处理最高（P <0.01）,W₂处理最低。各处理施肥和收获后土壤无机氮和可溶性有机氮含量的重复测量方差分析表明,除灌水下限和观测时间交互对亚硝态氮含量影响不显著外,灌水下限和观测时间及二者交互效应对土壤无机氮和可溶性有机氮均有极显著影响（P <0.01）。冗余分析和相关分析表明,NO₂^--N、NH₄⁺-N和土壤孔隙含水量（WFPS）可分别解释设施土壤N₂O和NO变异的55%、32.5%和20.7%,均是极显著影响不同灌溉下限N₂O和NO排放的主要影响因素。【结论】综合考虑产量和N₂O、NO减排效应,灌水下限35 kPa的W₂处理为本试验最适宜的灌溉管理措施。

再生农业——基于土地保护性利用的可持续农业

韩明会,李保国,张丹,李颖

中国农业科学. 2021, 54(5): 1003-1016. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.05.012

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在全球生态危机和不断增加的粮食和食品安全需求背景下,如何真正实现农业的可持续发展成了全世界共同关注的问题。再生农业（regenerative agriculture）作为新挑战下应运而生的农业模式。探讨再生农业的内涵、国内外应用的生态和经济效益以及分析在我国的应用情景,能够为我国这一新型农业模式的引入和发展提供理论指导。本文首先通过对相关再生农业定义的梳理,把再生农业概述为是以实现农业可持续发展为目的,基于土地保护性利用,在减少机械作业和化学品投入的基础上,通过基于自然的解决方案实现在提高作物产出的同时,提升土壤有机质和氮元素、促进土壤固碳、改善土壤健康、最大化生物多样性的农业模式。通过与其他可持续农业模式相比,从粮食安全、化石能源、碳封存、土壤健康、生物多样性、净水和净收益多个维度说明了再生农业能够实现粮食安全、土壤健康、生态环境和经济效益的同步改善。通过对国内外再生农业相关研究的分析,表明了再生农业的不同措施能够使得生态和经济效益的多个方面效益得到显著提升。最后,提出了我国未来不同区域发展再生农业模式的建议。

两个番茄品种叶绿体超微结构及光合生理对弱光胁迫的响应

孟宪敏,季延海,孙旺旺,武占会,储昭胜,刘明池

中国农业科学. 2021, 54(5): 1017-1028. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.05.013

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【目的】研究弱光下两个番茄品种叶绿体超微结构及光合生理特性,揭示不同番茄品种对弱光响应的差异,挖掘番茄耐弱光潜力。【方法】以本课题组筛选出的荷兰耐弱光品种‘佳西娜’和国内不耐弱光品种‘京丹1号’为试材,设置正常光照（CK,光强300—350 μmol·m^-2·s^-1）,50%正常光照（弱光,光强70—80 μmol·m^-2·s^-1）处理15 d,观测植株叶绿素荧光成像,测定叶片叶绿素荧光参数和光合参数,并通过扫描电镜和透射电镜观察叶片气孔形态和叶绿体结构。【结果】与对照相比,弱光使2个番茄品种叶片的净光合速率（P_n）、光化学淬灭系数（q_P__Lss）、叶绿素（a+b）含量（chl.（a+b））、超氧化物歧化酶（SOD）活性、气孔密度和气孔规则分布的空间尺度降低,还导致植株干重与壮苗指数降低,叶片光稳态非化学荧光淬灭（NPQ__Lss）、丙二醛（MDA）含量与植株株高、最大节间距提高,而‘京丹1号’的变化幅度显著大于‘佳西娜’,且‘佳西娜’的实际光量子效率（QY__Lss）、实际光化学效率QY（即ΦPSⅡ）及叶绿体结构基本没有改变,其叶片P_n显著高于‘京丹1号’。另外,弱光下,‘佳西娜’通过降低气孔间L(d)值来改善气孔的规则分布,并提高了叶绿素b（chl.b）含量,降低了chl.a/b,而‘京丹1号’chl.b含量却有所降低,chl.a/b提高,气孔规则分布的空间尺度与规则程度降低,叶片受弱光影响较严重。综上,‘佳西娜’捕光能力较强于‘京丹1号’,并将光合色素吸收的较多光能用于光化学传递,减少热耗散且提高了PSⅡ实际光化学速率及光能转化率,以维持其光合系统的运转,光合能力及产出比‘京丹1号’稍高,耐弱光能力强。【结论】2个番茄品种对弱光的响应差异主要表现在chl.b含量、气孔空间分布格局、叶绿体结构、SOD活性与光合荧光特性不同,使得荷兰耐弱光品种‘佳西娜’在弱光下能维持高效率的光合作用。

草莓根系线粒体对外源酚酸胁迫的生理响应

鲁晓峰,杜国栋,邵静,张静茹,孙海龙

中国农业科学. 2021, 54(5): 1029-1042. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.05.014

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【目的】连作障碍是设施草莓（Fragaria×ananassa Duch.）生产中遇到的严重问题,根系分泌的酚酸类物质是引起连作障碍的因素之一。本研究旨在探讨连作草莓植株的根系线粒体功能对自毒酚酸物质胁迫的生理响应,为进一步研究草莓连作障碍的生理适应机制奠定基础。【方法】本研究以草莓为试材,分别外源施加27.0 μg·g^-1丁香酸、邻苯二甲酸及两者混合溶液,借助电子显微成像、组织化学染色、液相氧电极等技术,观察根系活性氧含量变化,测定线粒体氧化磷酸化水平、呼吸途径及呼吸关键酶活性等指标的变化,研究自毒酚酸物质诱导的活性氧对根系线粒体功能的影响,探究根系线粒体参与的呼吸复合体代谢和能量代谢等生理功能的影响。【结果】施加2种外源酚酸及混合溶液处理均能导致草莓根系活力明显下降,显著影响根系总根长、总表面积、根系总体积和平均直径,抑制根系的发生和生长,抑制作用表现为丁香酸处理（D）>两种溶液混合处理（D+L）>邻苯二甲酸处理（L）>CK。在草莓根系受到外界酚酸胁迫时,随着胁迫时间的延长,H⁺-ATPase活性前期呈现显著下降趋势,处理第3天时下降幅度最大,处理D、处理L、处理D+L分别比对照下降了38.8%、28.8%、33.7%,阻碍根细胞内外离子的运转能力,后期变化趋于平稳。根系K⁺Na⁺-ATPase及Ca²⁺Mg²⁺-ATPase活性也一定程度降低,变化规律相似。随着处理时间的延长,根系中超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）及抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性均呈现显著下降趋势,H₂O₂和$ \mathrm{O}_{2}^{\mathop{}_{.}^{-}}$含量逐渐升高,根系线粒体MPT增大,降低Δψm及根系线粒体内膜上细胞色素Cyt c/a含量,破坏线粒体内膜细胞完整性和电子传递链,其中D处理效果最为显著。在草莓植株受到外源酚酸胁迫后,根系呼吸途径虽仍以EMP-TCA途径为主,但贡献率却显著降低,而PPP途径呈现出明显的增强趋势。外源酚酸处理后期,随着胁迫时间的延长,各呼吸关键酶活性均受到抑制作用,呼吸途径比例发生改变,进而导致各呼吸途径受阻,变化程度表现为D>D+L>L>CK。【结论】外源酚酸处理可导致植株根系活力降低,阻碍细胞内外各离子的运转能力,降低根系抗氧化酶活性及根系线粒体功能,各呼吸途径关键酶活性均降低,最终导致各呼吸途径受阻。

凤梨草莓与黄毛草莓种间杂种果实香气成分的代谢谱分析

王爱华,马红叶,李荣飞,杨仕品,乔荣,钟霈霖

中国农业科学. 2021, 54(5): 1043-1054. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.05.015

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【目的】通过比较黄毛草莓和凤梨草莓的2个种间杂种PF（具黄毛草莓浓郁的蜜桃香气）和NF（无蜜桃香气）完熟期果实香气成分的代谢谱,为黄毛草莓蜜桃香气特征成分鉴定及野生草莓优异资源的开发利用提供参考。【方法】采用顶空固相微萃取和气相色谱/质谱联用技术（gas chromatograph tandem mass spectrometer technology,GC-MS）,对供试材料的香气成分进行检测。采用偏最小二乘法判别分析（partial least squares discrimination analysis,PLS-DA）模型第一主成分的变量投影重要度（variable importance in the projection,VIP）值和log2FC（Fold Change,FC）,结合T-test的P值来筛选差异性代谢物,PF相对于NF,设置阈值VIP>1.0, log2FC>1.0或log2FC<-1.0且P value<0.05,差异代谢物的相对含量采用峰面积归一化法计算,CAS号（Chemical Abstracts Service Registry Number）在https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov网站查阅。【结果】从检测到的383种总代谢物中筛选出67种差异代谢物,其中58种上调,9种下调,上调幅度较大的差异代谢物为内酯类物质,log2FC排在前3名的依次是(Z)-7-癸烯-5-酸（5.60）、丁位十一内酯（5.33）、δ-癸内酯（5.30）,下调幅度较大的差异代谢物为酯类物质,-log2FC排在前3名的依次是肉桂酸乙酯、亚硫酸（-7.19）,2-乙基己基异己酯（-6.65）和3-羟基丁酸乙酯（-4.14）。从相对含量来看,酯类在PF（37.69%）中大幅低于NF（57.20%）,内酯类在PF（20.91%）中大幅高于NF（6.12%）,酮类在PF（15.30%）中略高于NF（9.12%）,醇类、醛类、酸类、烯烃类和其他代谢物在PF和NF中的含量相当,NF中相对含量最大的酯是丁酸乙酯（17.92%）,PF中相对含量最大的内酯是δ-癸内酯（12.53%）,PF相对含量最大的酮与NF相同,均为2-庚酮。【结论】肉桂酸乙酯、丁酸乙酯和3-羟基丁酸乙酯等酯类可能是NF的关键香气成分,(Z)-7-癸烯-5-酸、丁位十一内酯和δ-癸内酯等内酯类可能是形成PF蜜桃香气的关键物质。

高效液相色谱-荧光检测法检测烤肉制品中5种硝基多环芳烃

白雪,惠腾,王振宇,曹云刚,张德权

中国农业科学. 2021, 54(5): 1055-1062. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.05.016

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【目的】明确烤肉制品中硝基多环芳烃（NPAHs）的含量水平,建立固相萃取柱结合高效液相色谱-荧光检测器测定烤肉制品中5种NPAHs（1-硝基萘、2-硝基芴、3-硝基荧蒽、1-硝基芘和6-硝基苯并[a]芘）的方法。【方法】称取1 g真空冷冻干燥的烤肉样品,加入二氯甲烷超声提取并过滤收集滤液,重复提取3次。将滤液氮吹至近干,加入3 mL正己烷溶解。依次用二氯甲烷和正己烷活化多环芳烃固相萃取柱,上样后用正己烷荡洗样品管然后继续上柱;用正己烷淋洗,二氯甲烷洗脱;将洗脱液氮吹至近干,用乙腈溶解得到NPAHs待测液。向待测液中加入酸化甲醇和铁粉,磁力搅拌水浴加热40 min,离心并过滤膜后通过高效液相色谱-荧光检测器检测,其中色谱柱为Agilent ZORBAX Eclipse PAH柱,设置柱温40℃,进样量20 μL,流动相选用水和乙腈,采用梯度洗脱模式。【结果】5种NPAHs在相应质量浓度范围内线性关系良好,相关系数大于0.9940,检出限为0.12—2.17 μg·kg^-1,定量限为0.38—7.23 μg·kg^-1,平均回收率为53.16%—129.64%,精密度为1.91%—30.73%。利用该方法对我国5类典型的烤肉样品进行检测,测得5种NPAHs总含量为50.19—82.36 μg·kg^-1,其中6-硝基苯并[a]芘含量最高,约为31.01—35.89 μg·kg^-1,其次是3-硝基荧蒽,约为9.99—23.06 μg·kg^-1。【结论】固相萃取柱结合高效液相色谱-荧光检测法适用于烤肉制品中NPAHs的分析;我国烤肉制品中普遍存在NPAHs。

2017-2019年四川地区猪A群轮状病毒的分子流行病学调查

周群,陈小飞,阚蕊慈,李玉,曹慧,彭艳伶,张斌

中国农业科学. 2021, 54(5): 1063-1072. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.05.017

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【目的】通过对四川地区规模化猪场A群轮状病毒（RVA）的分子检测,从而了解RVA流行情况及分子特征,为猪RVA疫苗研制提供理论基础。【方法】2017—2019年从四川省14个地区40个猪场采集303份仔猪腹泻样本,用荧光定量RT-PCR方法调查RVA的分子流行率,用RT-PCR方法对RVA阳性样本进行分型和VP4和VP7全基因组的扩增,用RotaC^2.0软件确定相应毒株的基因型,用MegAlign软件进行同源性分析,通过MEGA 7.0软件用邻近法构建系统进化树,用SimPlot和RDP4软件进行重组分析。【结果】303份仔猪腹泻样本检出RVA阳性样本98份,阳性率为32.34%（98/303,95%CI=27.1%—37.9%）。从98份RVA阳性样本中扩增出39个VP7片段,G9为优势基因型（41%）,G4、G5、G26和G3各占23%、28.2%、5.1%和2.7%。扩增出的59个P型中以P[13]型为主,占40.7%,其次为P[6]、P[23]和P[1]型,分别占30.5%、23.7%和5.1%。30株毒株成功鉴定出G/P基因型,G9P[23]（23.3%）为优势组合基因型。其他基因型为G4P[6](16.7%)、G9P[13](13.3%)、G5P[23](10%)、G5P[13](10%)、G9P[6](6.7%)、G26P[13](6.7%)、G4P[13](6.7%)、G4P[23](3.3%)和G3P[13](3.3%)。基因型G5P[23]、G4P[13]、G9P[6]、G26P[13]和G4P[23]为国内首次鉴定。此外,重组分析表明4株毒株在VP7或VP4基因上存在重组现象。【结论】四川地区腹泻仔猪粪便中RVA的流行率高且基因型复杂,优势组合基因型为G9P[23]。该结果丰富了四川地区RVA的流行病学资料,对四川地区猪RVA的防控提供了重要参考。

针对非洲猪瘟病毒MGF360-13L基因的TaqMan荧光定量PCR的建立

王涛,韩玉,潘力,王冰,孙茂文,王翌,罗玉子,仇华吉,孙元

中国农业科学. 2021, 54(5): 1073-1080. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.05.018

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【目的】建立一种以MGF360-13L基因为靶标的实时荧光定量PCR检测非洲猪瘟病毒（African swine fever virus, ASFV）的方法,为非洲猪瘟（African swine fever, ASF）的诊断、MGF360-13L基因缺失毒株鉴别、病毒分离鉴定、基因功能研究提供技术支持。【方法】首先,以ASFV中国流行毒株（GenBank: MK333180.1）的MGF360-13L基因序列为靶标设计并筛选了1对特异性引物和探针,建立其荧光定量PCR检测方法。设计引物13L-F/13L-R,扩增MGF360-13L,并将其克隆至pOK12载体,挑取阳性克隆并测序验证,构建重组质粒标准品。将重组质粒标准品连续10倍梯度稀释,以稀释后的各梯度质粒标准品为模板,配制反应体系和设置反应条件后进行荧光定量PCR检测,建立标准曲线,并对其敏感性和重复性进行评价;其次,以连续10倍梯度稀释的重组质粒标准品为模板,利用引物13L-F/13L-R进行常规PCR检测,以比较荧光定量PCR的敏感性。最后,运用本检测方法和本研究组已建立的针对ASFV p72的荧光定量PCR检测方法同时对黑龙江某猪场发生ASF时采集的30份临床样品进行检测,以比较两种检测方法的符合率。另外,应用该方法对感染原代巨噬细胞的ASFV野毒株和MGF基因缺失毒株进行鉴别检测。【结果】利用引物13L-F/13L-R可扩增出一条800 bp左右的特异性目的条带,而阴性对照无条带,成功构建出标准品。本研究建立的实时荧光定量PCR检测方法在质粒标准品为1.56×10¹-1.56×10⁸拷贝/μL时,呈现出良好的线性关系,线性回归方程为：y =-3.295 lg(x) + 45.995,线性相关系数R²为0.997,对ASFV核酸最低检测限为15.6拷贝/μL。在特异性检验中,除ASFV核酸外,猪瘟病毒、伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪圆环病毒1型、猪圆环病毒2型等病毒核酸均未出现扩增曲线,表明该方法的特异性良好。与最低检测限为1.56×10⁴拷贝/μL病毒核酸的常规PCR检测方法相比,本研究建立的TaqMan荧光定量PCR检测方法高出其约3个数量级,具有较高的敏感性。在临床样品检测中,两种检测方法经过McNemar检验,P = 0.5>0.05,表明两种检测方法的结果无统计学差异;经过Kappa检验,Kappa = 0.867>0.75,P<0.001,提示两种检测方法符合率较好,能够有效区分ASFV野毒株和MGF360-13L基因缺失毒株。【结论】建立的TaqMan荧光定量PCR特异、敏感、重复性好,不仅丰富了ASFV现有检测靶标,也为后续MGF360-13L功能、MGF缺失毒株的鉴定及相应基因缺失疫苗株的鉴别诊断提供技术支持。

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