【目的】 探索基于数字PCR的小麦基因拷贝数分析技术,提高目标基因拷贝数的分析通量,促进小麦基因组研究及基因工程研究。【方法】 采用中国农业科学院作物科学研究所小麦抗逆分子育种课题组创制的高抗小麦黄花叶病转nib8小麦为试验材料,使用小麦D基因组中的单拷贝纯合内源基因PINb-D1b（籽粒硬度基因）为内参基因,根据转化的抗病基因nib8序列设计4对特异性引物及相应探针,通过试验确定探针和引物的最优浓度,优化体系的退火温度,寻找最合适的模板浓度。然后用数字PCR检测转nib8小麦中外源基因的拷贝数;同时用Real-time PCR和Southern blot 2种不同方法分析的拷贝数结果,验证上述采用数字PCR方法分析拷贝数的准确性;以PINb-D1b内参基因检测Wx012（蜡质基因）和SSII（淀粉合成基因）2个内参基因的拷贝数,以Wx012和SSII为内参基因检测转nib8小麦中外源基因的拷贝数,验证以PINb-D1b内参基因的检测结果准确性;在nib8的不同区段设计特异性引物来检测转nib8株系拷贝数分析结果是否有差异。最终,建立基于数字PCR技术的高通量检测小麦目标基因拷贝数的分析方法。【结果】 通过试验最终确定了基于数字PCR方法的小麦目标基因拷贝数的检测体系。试验确定引物和探针的最佳终浓度分别为500和250 nmol·L^-1,确定体系反应最佳退火温度为59℃,最佳DNA模板量为40 ng。以PINb-D1b作为内参基因检测转nib8小麦中nib8的拷贝数,拷贝数检测结果显示第12、16、17、23、29、30株系中nib8拷贝数分别为7个、1个、1个、1个、1个、7个;同时通过比较发现此结果与Real-time PCR以及Southern blot结果一致;在转基因株系中,以PINb-D1b为内参基因,对Wx012和SSII 2个基因进行拷贝数进行分析,同时发现采用这3种内参基因分析转nib8小麦中nib8基因拷贝数的结果一致,说明这3个内参基因都适合用于数字PCR方法;在nib8上游、中游和下游不同区段的设计引物分析拷贝数检测结果一致。【结论】 优化了基于数字PCR方法的小麦目标基因拷贝数分析方法和反应体系,确立了基于数字PCR方法的小麦目标基因拷贝数的检测体系,数字PCR分析结果稳定、可靠,检测通量明显提高,具有一定的应用前景。

【目的】 以6份不同地理来源的糜子资源为试验材料,基于前期转录组测序获得的1 000对SSR引物,选出200对进行多态性检测,以期构建一批可以准确评估糜子种质遗传差异的分子标记。【方法】 用Primer Premier 5.0软件设计引物,改良CTAB法提取DNA,PCR扩增DNA和聚丙烯酰胺凝胶电泳筛选引物多态性;用PowerMarker 3.25和PopGen 1.32计算遗传多样性参数。【结果】 200对引物中97对呈单态性,80对呈多态性。单碱基序列重复引物有20对,10对具多态性,其重复基元是A（50%）和T（50%）。二碱基序列重复引物有36对,15对具多态性,其碱基重复类型有7种（AG最多,TC、GC和GA次之,CA、TA和AC最少）。三碱基序列重复引物有144对,55对具多态性,其碱基重复类型有24种（GGC、GCG和GCC最多,GAA、GCT和CGC等次之,ACC、AGG、CAG、CGT、AAG、AAC、TCG、CGA、ATT、CAA和CCA最少）。就引物分辨率(Rp)值而言,1—3碱基序列重复引物分别为0.67—4.67（平均2.07）、1.33—4.33（平均2.73）和0.67—4.00（平均1.83）。基于Rp值分析SSR分布频次,发现80个标记分布在5个区间：0—1、1—2、2—3、3—4和4—5,分别包含17（21.25%）、36（45.00%）、11（13.75%）、14（17.50%）和2个（2.50%）。就$\overline{\text{Rp}}$值而言,1—3碱基序列重复引物分别为0.33—0.67（平均0.51）、0.40—0.78（平均0.59）和0.33—0.83（平均0.59）。单碱基序列重复标记共检测到22个等位变异,每个位点为2—3个（平均2.2000）,其中8个和2个位点分别具2和3个变异;二碱基序列重复标记共检测到38个等位变异,每个位点为2—3个（平均2.5333）,其中7个和8个位点分别具2和3个变异;三碱基重复标记共检测到136个等位变异,每个位点为2—3个（平均2.4727）,其中29个和26个位点分别具2和3个变异。就多态性信息含量而言,1—3碱基序列重复引物分别为0.3750—0.5355（平均0.4293）、0.2392—0.7438（平均0.4293）和0.2392—0.7438（平均0.3989）。就多样性指数而言,1—3碱基序列重复分别为0.6365—1.0776（平均0.7497）、0.5623—1.0986（平均0.8339）和0.5623—1.0889（平均0.8312）。【结论】 基于转录组测序结果,检测200对SSR引物的多态性,发现177对（88.5%）可以扩增出完整条带,其中80对具多态性,多态率为40%。

【目的】 油菜生产受菌核病危害严重,但油菜中缺乏抗源,严重限制了油菜抗菌核病育种进程。萝卜胞质不育系（Ogu cytoplasmic male sterility,Ogu CMS）是生产油菜杂交种最好利用的授粉控制系统之一,但目前还没有抗菌核病油菜Ogu CMS恢复系选育的报道。野生甘蓝中存在高抗菌核病的资源,以抗病野生甘蓝为抗源,拟将野生甘蓝的菌核病抗病遗传成分转入Ogu CMS材料中,发展优质抗菌核病的油菜Ogu CMS恢复材料,为进一步发展抗菌核病的油菜Ogu CMS恢复系提供资源。【方法】 首先采用抗菌核病野生甘蓝Brassica incana与白菜种间杂交,经胚挽救及染色体加倍技术发展人工合成甘蓝型油菜;然后将人工合成甘蓝型油菜与含Ogu CMS的油菜杂交,后代自交,并利用与甘蓝抗病QTL连锁的marker进行分子标记辅助选择（marker-assisted selection,MAS）,筛选携带主效抗病位点C1-QTL和C9-QTL的材料;MAS选中的材料通过侧枝离体接种鉴定评价其菌核病抗性,选择相对感病度S（susceptibility）显著低于甘蓝型油菜中双9号（耐病对照）的材料进行籽粒硫苷和芥酸含量测定,选择籽粒品质相对较好的材料进行恢保测定,筛选含抗病位点、抗菌核病、且结实率较好的Ogu CMS恢复材料。【结果】 成功获得抗病甘蓝与白菜杂交发展的人工合成甘蓝型油菜AC1-4,其菌核病抗性显著高于甘蓝型油菜中双9号;AC1-4与Ogu CMS甘蓝型油菜4Q292杂交产生了146个F₁单株,从中选择到含有甘蓝C1-QTL和C9-QTL、结实正常、相对感病度S分别为0.66和0.40的2个单株4C99和4C115发展F₂世代;并从124个F₂植株中筛选出8份材料自交发展了982个F_2:3单株,并从中筛选到50株含有抗病位点C1-QTL和C9-QTL的植株,其相对感病度S介于0.34—0.89;其中有2份籽粒品质接近单低的材料5X82-2（硫苷含量为45.38 μmol·g^-1饼粕）和5X82-7（芥酸含量为6.5%）。【结论】 改良了油菜Ogu CMS恢复材料的菌核病抗性。

【目的】 黄土旱塬半湿润易旱区属于雨养农业区,水分亏缺为主要限制因素,因此,有必要筛选适于黄土旱塬半湿润易旱区春玉米综合栽培模式,从而提高旱地春玉米水分利用效率和产量。【方法】 2017—2018年玉米生长季,探讨不同耕作方式（翻耕、免耕、深松）、施氮（0、150、225 kg·hm^-2）和种植密度（52 500、67 500 株/hm²）对春玉米田土壤水分动态、水分利用效率、春玉米生长、产量及其构成因素的互作效应,提高玉米综合生产力。【结果】 （1）2017—2018年春玉米播种期0—200 cm土层土壤蓄水量均表现为免耕>深松>翻耕,2年平均免耕与深松播种期0—200 cm土层土壤蓄水量较翻耕分别提高6.1%和4.1%。2年春玉米水分利用效率均在深松高密高氮（STH2）处理最高。（2）深松与免耕处理较翻耕处理显著提高叶面积指数与干物质积累量,随密度与施氮量的增加,春玉米叶面积指数与干物质积累随之增加,耕作×密度对拔节、抽雄期叶面积指数有显著影响,密度×施氮对灌浆中期叶面积指数有显著影响。STH2处理下,玉米成熟期干物质积累量较其他处理提高3.3%—32.9%。（3）穗粒数和百粒重与施氮呈显著正相关关系（P<0.05）,深松与免耕处理玉米产量显著高于翻耕。STH2处理产量最高,2017年STH2产量较其他处理增幅为1.4%—63.3%;2018年增幅为2.9%—39.6%。【结论】 在黄土旱塬半湿润易旱区,深松耕配施150—225 kg·hm^-2施氮量与67 500株/hm²种植密度,不仅可以提高春玉米水分利用效率,还可获得较高的玉米产量效益;免耕配施225 kg·hm^-2施氮量与67 500株/hm²种植密度,可获得较高的经济效益。

【目的】 间作是提高土地利用率和作物产量的重要农作措施,通过对不同行比玉米大豆间作模式中作物干物质积累速率和积累量以及产量的计算,分析2种作物干物质分配规律、种间竞争能力以及边际效应的强度和范围,探讨间作种植提高土地生产力的机理。【方法】 试验以4种不同行比的玉米大豆间作（6M6S、6M3S、3M6S、3M3S）为研究对象,设置2种作物的单作（CKM、CKS）为对照,分析干物质积累分配规律、间作系统产量和生物量组成,采用每一行（依次从玉米和大豆的交接行向内记为第I行、第II行和第III行）取样的方法,计算边际效应和茎叶输出量、输出率和贡献率。【结果】 在2年试验中,4个间作处理的玉米单株干物质积累量均高于CKM,其中6M6S、3M6S处理的大豆单株干物质积累量高于CKS。间作提高了玉米全生育期和大豆分枝前期、分枝后期、鼓粒期、成熟期时的干物质积累速率。2年试验中,6M6S、6M3S、3M6S和3M3S处理的玉米产量分别达到CKM的73.9%、88.7%、52.8%、65.5%,大豆产量分别达到CKS的26.1%、11.3%、47.2%、34.5%,其产量土地当量比（LER_YMS）分别为1.31、1.23、1.33、1.13,玉米对大豆的产量种间相对竞争力分别为0.44、0.47、0.45、0.46。间作提高了玉米I行、II行和III行,大豆II行和III行的干物质积累速率与积累量,而降低了I行大豆的干物质积累速率和积累量。2年试验中,间作玉米的I行、II行、III行的单株产量分别为CKM的151.43%、138.51%、130.83%,间作大豆的I行、II行、III行的单株产量分别为CKS的90.22%,104.16%、109.03%。2年试验中作物茎叶干物质积累量均在吐丝期（盛花期）达到最大值,各处理的玉米叶、玉米茎、大豆茎叶的输出量平均分别为15.70 g/plant、27.64 g/plant、7.43 g/plant,输出率平均分别为22.80%、44.23%、19.61%,贡献率平均分别为14.99%、26.28%、27.79%。【结论】 玉米和大豆间作提高了作物干物质积累量和产量,提高了茎叶干物质输出量,提高了土地当量比,其中玉米的贡献大于大豆。不同行比配置对间作的边际效应有影响,间作玉米中I、II、III行的干物质积累量和产量依次降低,间作大豆则依次升高。相比于其他间作处理,3M6S处理土地当量比最高,是最有利于发挥间作优势,提高土地利用率的间作模式。

【目的】 通过分析水稻根系细菌挥发性有机物（volatile organic compounds,VOCs）组成和对小孢根霉（Rhizopus microsporus）的抑制作用,寻找新的具有潜在抑菌功能的挥发性物质。【方法】 通过对扣熏蒸法测定不同细菌对小孢根霉的抑菌率;采用顶空固相微萃取法收集细菌挥发性有机物,对其进行气相色谱-质谱（GC-MS）检测,测得细菌挥发性有机物质谱,并在NIST/EPA/NIH数据库中进行比对鉴定,根据抑菌效果及各物质在质谱中的峰面积,进行相关性分析,购买与抑菌率具有显著相关性的物质,体外检测这些纯物质对小孢根霉的抑制作用。【结果】 所有菌株均能释放挥发性有机物,并且通过挥发性有机物的非接触性产生不同的抑菌效果,这些菌株共产生14类90种挥发性有机物,分别为酯、烯烃、烷、酮、酸、噻吩、醛、萘、硫化物、酚、醇、吡嗪、吡咯和苯类物质,其中所有菌株都能够释放醇类物质。通过相关性分析,发现有6种物质具有潜在的抑菌活性,分别为2-庚酮、5-甲基-2-己酮、2-壬酮、5-甲基-3-己酮、3-甲基丁酸和甲基异丁基酮,其释放量与抑菌率呈显著正相关,其中3种（2-庚酮、2-壬酮和甲基异丁基酮）是前期研究已经报道过具有抑菌活性的物质,其余3种物质（5-甲基-2-己酮、5-甲基-3-己酮和3-甲基丁酸）暂未被报道具有抑菌活性,通过购买其中2种物质3-甲基丁酸和5-甲基-2-己酮进行体外熏蒸试验验证,发现3-甲基丁酸严重抑制小孢根霉生长,5-甲基-2-己酮对小孢根霉具有致死作用。5-甲基-2-己酮主要由菌株麦克默多生孢八叠球菌、短短芽孢杆菌和阿氏芽孢杆菌释放,5-甲基-3-己酮主要由菌株假单胞菌、阿氏芽孢杆菌和麦克默多生孢八叠球菌释放,3-甲基丁酸主要由菌株神户肠杆菌、假单胞菌和阿氏芽孢杆菌释放。【结论】 水稻根系细菌能释放种类丰富的挥发性有机物,部分挥发性有机物对水稻病原菌小孢根霉具有显著抑制作用。经过相关性分析及体外验证确定了2种新型的具有抑菌活性的物质（5-甲基-2-己酮和3-甲基丁酸）以及1种可能具有抑菌活性的物质（5-甲基-3-己酮）,这些菌株和挥发性有机物均具有作为新型药物和抗真菌代谢物生物资源的潜力。

【目的】 了解柑橘不同品种CitMYB20对柑橘溃疡病菌（Xanthomonas citri subsp. citri,Xcc）和外源植物激素的应答情况,评价转基因植株对柑橘溃疡病的抗性,验证CitMYB20的生物学功能。【方法】 根据柑橘基因组序列设计引物,PCR法同源克隆柑橘溃疡病抗性品种金弹金柑（Fortunella japonica）和敏感品种枣阳小叶枳（Poncirus trifoliata）的CitMYB20基因序列和启动子序列,利用在线软件PlantCARE对启动子序列进行顺式作用元件预测。以针刺法对金弹金柑和枣阳小叶枳离体叶片接种柑橘溃疡病菌,用外源激素水杨酸、茉莉酸甲酯和乙烯利处理金弹金柑和枣阳小叶枳的叶片,在处理的不同时期收集材料,利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测CitMYB20的表达水平。分别构建CitMYB20的过表达载体和抑制表达载体,根癌农杆菌法转化枳上胚轴,随机摘取转基因株系成熟叶片进行柑橘溃疡病离体抗性评价。【结果】 金弹金柑和枣阳小叶枳中CitMYB20（GenBank登录号分别为MN689609和MN689608）序列高度保守,相似度达到99%;两者的启动子序列（GenBank登录号分别为MN689611和MN689610）虽然都具有脱落酸和茉莉酸甲酯的响应元件,但金弹金柑中还具有水杨酸响应的顺式作用元件,而枣阳小叶枳中缺少该元件。在体外接种柑橘溃疡病菌5 d时,金弹金柑成熟叶片中CitMYB20表达量显著上升,达到对照的2.5倍;而枣阳小叶枳叶片CitMYB20在整个接菌周期内表达量未发生显著变化。外源激素处理时,CitMYB20对水杨酸和茉莉酸甲酯的响应相似,即在金弹金柑中呈现出先升高后降低的趋势,而在枣阳小叶枳中表达量降低,随后又恢复正常。乙烯利处理时,CitMYB20在金弹金柑中表达量略有下降,在枣阳小叶枳中表达量先升后降。遗传转化共获得7株过表达植株和5株抑制表达植株,转基因植株与对照植株相比在形态发育上未见明显差异。CitMYB20过表达植株能够在一定程度上减弱柑橘溃疡病的症状,而抑制CitMYB20表达植株对柑橘溃疡病菌的敏感性增强。【结论】 CitMYB20在柑橘溃疡病抗性品种中受柑橘溃疡病菌的诱导表达;CitMYB20是防御柑橘溃疡病菌入侵的一种正向调控转录因子,其抗柑橘溃疡病功能可能需要水杨酸和茉莉酸信号途径的作用;CitMYB20可作为柑橘抗溃疡病分子育种的候选基因。

【背景】 莲草直胸跳甲（Agasicles hygrophila）是世界恶性入侵杂草空心莲子草（Alternanthera philoxeroides）的专一性生防天敌;莲草直胸跳甲种群动态呈季节性波动趋势,在我国湖南地区其夏季种群数量骤减,导致对空心莲子草的防控效果大大降低。而Halloween基因家族参与昆虫蜕皮激素的合成,影响昆虫生长和繁殖,进而对昆虫种群动态具有一定影响。【目的】 揭示Halloween基因家族在莲草直胸跳甲不同发育时期和不同组织中的表达模式,为进一步探究Halloween基因家族在莲草直胸跳甲中的功能打下基础,进而为生防天敌的扩繁提供新思路。【方法】 通过筛选莲草直胸跳甲卵巢转录组数据并结合生物信息学分析,找到并克隆其体内Halloween基因家族成员;使用NCBI在线分析其保守结构域,利用MEGA6.0对Halloween家族基因进行多序列比对并构建系统发育树;通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术检测各基因在莲草直胸跳甲不同发育时期（卵、幼虫、蛹、雌成虫）和雌成虫不同组织（头、胸、中肠、卵巢、脂肪体）中的表达水平。【结果】 莲草直胸跳甲中存在6个Halloween基因家族成员,分别为AhCYP302A1、AhCYP306A1、AhCYP307A1、AhCYP307A2、AhCYP314A1和AhCYP315A1;分析发现其均属于P450超家族且具有一定保守性,其中AhCYP306A1、AhCYP307A1、AhCYP307A2聚为一支,属于P450超家族中CYP2集团,AhCYP302A1、AhCYP314A1、AhCYP315A1聚为一支,属于线粒体集团;同时,AhCYP306A1、AhCYP314A1、AhCYP315A1在5′端存在跨膜区域。6个Halloween基因在莲草直胸跳甲整个生活史及各个组织中均有不同程度的表达。其中,AhCYP302A1在蛹期第6、7天表达量最高,成虫期表达量整体较低;AhCYP306A1在整个生活史中波动表达,以幼虫期第10天表达量最高;AhCYP307A2在末龄幼虫和化蛹初期的表达量较高;以上3个基因在幼虫期和蛹期的表达量较高。AhCYP307A1在卵期高表达,此后各个时期呈波动下降;AhCYP314A1、AhCYP315A1在成虫期和卵期的表达量相对高于其他两个时期。在头、胸、中肠、卵巢、脂肪体5种组织中,除AhCYP307A1外,Halloween家族其他基因在卵巢中表达量均较高;AhCYP307A1在雌成虫头部显著性高表达。【结论】 克隆并鉴定得到6个莲草直胸跳甲Halloween基因家族成员,其在不同发育时期及不同组织中的表达具有一定差异。通过其表达模式推测Halloween基因家族在莲草直胸跳甲幼虫发育及成虫繁殖过程中可能发挥重要作用,对其幼虫蜕皮与成虫卵巢发育均有一定影响。

【目的】 当前国内已有的小麦氮肥用量推荐方法,尤其是基于测土进行的推荐施肥方法,都存在取样量大、测试工作量大和成本较高的问题,难以被农技推广工作者和小农户接纳与应用推广。为此,本文就一种至少2—3年有效的氮肥用量推荐方法进行研究。【方法】 以低有机质含量土壤维持或提高土壤肥力、高有机质土壤降低环境风险为目的,建立基于土壤有机质含量的旱地小麦施氮量推荐方法,施氮量（kg N·hm^-2）=目标产量需氮量（kg N·hm^-2）×施氮系数（N_f）。施氮系数（N_f）由表层土壤有机质含量高低确定。应用这一方法在渭北旱塬冬小麦种植区6县进行了3年田间试验。【结果】 基于有机质推荐氮肥施用量平均为161 kg N·hm^-2,比农户习惯施肥（平均为190 kg N·hm^-2）减少了15.3%;而相应的冬小麦平均籽粒产量为5 817 kg·hm^-2,比农户习惯施肥显著提高了9.0%。此外,与农户习惯施肥相比,基于有机质含量推荐施肥的经济效益增加了1 451元/hm²,提高19.3%,小麦收获期1 m土层的硝态氮残留降低了39 kg·hm^-2,显著降低28.3%。【结论】 基于土壤有机质含量推荐施肥降低了氮肥施用量并提高了冬小麦籽粒产量,增加了经济效益,降低了土壤硝态氮残留量和施肥的环境风险,可在旱地小麦区推广应用。

【目的】 冬油菜是我国重要的油料作物,合理施肥是保证冬油菜产量的重要措施。明确当前冬油菜的施肥现状和存在问题指导科学施肥。【方法】 以安徽省冬油菜种植为例,于2017—2018年在全省冬油菜主产区进行农户抽样调查,调查内容包括：肥料品种、肥料用量、施肥方式、种植面积和产量水平。根据调查结果进行统计分析当前油菜种植过程中的施肥情况,并以全省冬油菜平均产量和平均施肥量为基准,采用Cate-Nelson方法（十字交叉法）评估冬油菜氮、磷和钾肥施用与油菜产量的关系,以此探索冬油菜种植中施肥增产增效的主要途径。【结果】 调查结果表明,安徽省油菜种植中均施用了化肥,施用有机肥农户比例为59.0%。全省化学氮、磷和钾肥平均用量为160、63和65 kg·hm^-2。总的来说,全省化肥平均用量更加趋于合理化,但是施肥分级结果表明全省依然存在氮、磷和钾肥施肥不足和过量的现象。全省化肥施用方式以人工施肥为主,机械化施肥比例较低。Cate-Nelson分析方法结果表明,全省仅有23.8%、20.2%和21.0%农户在冬油菜种植中实现了氮、磷、钾肥高产高效。这说明全省冬油菜种植中增产增效还有很大的空间。【结论】 总的来说,安徽省冬油菜种植中化肥平均用量趋于合理化,但是在施肥方式、养分运筹和肥料品种上面还存在问题。在施肥方式上机械化施肥比例不足,仅为38.8%;在养分运筹上,虽然氮肥用量普遍实现了分次施用,但是以施用两次为主,与油菜养分吸收规律不匹配。除此之外,在施肥品种上存在偏施化肥,有机替代和轻简化施肥比例较低。

【目的】 比较不同菌种发酵对藜麦蛋白质水解及脂质变化的影响,为藜麦发酵食品的开发提供理论参考。【方法】 以藜麦为原料,加入不同菌种（酵母菌、植物乳杆菌及其混合菌）进行发酵,通过测定蛋白水解指数、蛋白质各组分、游离氨基酸、游离脂肪酸及脂质构成来判定发酵效果,确认哪种微生物更有利于藜麦营养成分的转化。【结果】 经酵母、植物乳杆菌、酵母和植物乳杆菌混合菌发酵后,藜麦蛋白质水解指数均有所升高,且主要是清蛋白和球蛋白发生了水解。发酵后藜麦中的游离氨基酸含量增加显著,尤其是必需氨基酸。酵母发酵藜麦更有利于蛋白质、多肽等水解成氨基酸。通过发酵处理,藜麦中的游离脂肪酸含量显著增加,且饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸、多不饱和脂肪酸的比例更为接近1﹕1﹕1;甘油三酯、甘油二酯含量降低,但磷脂等功能脂的含量有所提高,且有酵母菌参与更有利于上述转化。【结论】 酵母菌、植物乳杆菌发酵过程中主要水解藜麦清蛋白和球蛋白成氨基酸等小分子化合物,且游离必需氨基酸含量显著升高;两种菌发酵后都有利于增加游离脂肪酸含量,降低甘油三酯、甘油二酯含量,且提高磷脂的含量。经酵母发酵,更有利于改善藜麦营养。

【目的】 建立全麦粉标记物烷基间苯二酚（ARs）的高效液相检测方法,对全麦粉和小麦粉中ARs同系物组成进行分析,实现全麦粉真伪品质评价。【方法】 探究高效液相条件,建立ARs同系物5-十七烷基间苯二酚（C17:0）、5-十九烷基间苯二酚（C19:0）、5-二十一烷基间苯二酚（C21:0）、5-二十三烷基间苯二酚（C23:0）和5-二十五烷基间苯二酚（C25:0）的高效液相检测方法,并进行方法学评价。以国内外全麦粉、小麦粉及小麦麸皮等共47份样品为研究对象,测定ARs同系物的含量,分析其ARs同系物组成,并进行热图分析和主成分分析。【结果】 选用ZORBAX SB-C18（150 mm×4.6 mm,5 μm,Agilent）色谱柱,流动相选用0.1%甲酸水溶液和0.1%甲酸甲醇溶液进行梯度洗脱,在紫外检测波长280 nm、柱温35℃、流速0.5 mL·min^-1、进样量20 μL条件下,可在35 min内有效分离5种ARs同系物,各个同系物的色谱峰峰形对称,分离度好。经方法学评价,该方法具有良好的精密度和灵敏度,标准曲线线性相关系数均大于0.999,检出限为0.06—0.19 μg·mL ^-1,回收率为81.16%—112.92%,精密度标准偏差为0.02%—4.02%,可作为ARs同系物的测定方法。通过热图聚类分析可知不同检测样品中ARs同系物组成及总量存在显著差异（P<0.05）。麦粉样品ARs同系物组成中C21:0最多,占33%—61%;C19:0次之,占12%—44%;C17:0、C23:0和C25:0的含量占比较小。美国、加拿大全麦粉的ARs同系物组成丰富度和含量相近,国外全麦粉中ARs同系物组成含量高于国内全麦粉。国内全麦粉中的ARs同系物组成比小麦粉中的ARs同系物组成丰富度高,但个别小麦粉除外。小麦麸皮F₁中ARs同系物组成和总含量显著高于全麦粉和小麦粉,其ARs总含量高达1 795.78 μg·g^-1,与其他样品相比差异显著（P<0.05）。经主成分分析得出,麦粉样品间的主要差异指标为ARs同系物组成含量,作为第1主成分,其累积贡献率为98.40%。小麦麸皮与其他麦粉样品的相对分散最远,中国小麦粉的分散度最大。美国全麦粉和加拿大全麦粉几乎重叠,而中国全麦粉和部分小麦粉与美国、加拿大全麦粉部分交叉。【结论】 本研究建立的液相方法能够有效、快速的对全麦粉中ARs同系物进行定量,适用于麦类全谷物产品中ARs同系物含量的测定。同时,通过全麦粉和小麦粉中ARs同系物组成对比分析可知,全麦粉中的ARs同系物组成丰富度优于小麦粉中的ARs同系物组成丰富度。

【目的】 研究枯草芽孢杆菌和雅致放射毛霉混菌静态发酵对双低菜籽粕营养价值和感官特性的影响,并通过体内试验初步评估菜籽粕食用的安全性,为菜籽粕在食品领域广泛利用和深度开发提供理论依据。【方法】 以双低菜籽粕为研究对象,采用静态发酵代替传统的搅拌式发酵。通过测定发酵后菜籽粕的营养成分（粗蛋白、水溶性蛋白、小肽、氨基酸和川芎嗪）、抗营养成分（硫代葡萄糖苷、植酸和粗纤维）及基于电子鼻和电子舌气、味差异,结合相关性分析和主成分分析,评价混菌静态发酵对双低菜籽粕品质的影响;并以大鼠为试验对象,初步研究发酵菜籽粕对大鼠生长性能的影响,为发酵菜籽粕产品的应用提供理论依据。【结果】 结果表明,发酵后可溶性蛋白、多肽和总氨基酸分别增加了96.7%、281.48%和19.58%。大部分菜籽蛋白被降解为分子量在500—108 Da的小分寡肽和氨基酸。发酵后检测到川芎嗪这一新的营养物质,浓度在发酵第5天高达590 mg?kg^-1,硫代葡萄糖苷、植酸和粗纤维含量在发酵后分别降低了45.26%、41.37%和31.16%。电子鼻和电子舌的分析结果表明,发酵前后菜籽粕的气味和滋味发生显著变化,发酵后菜籽粕中酸味明显增加。动物试验表明,发酵菜籽粕等氮代替25%的豆粕添加到大鼠饲粮中可以明显提高大鼠的平均日采食量和平均日增重,并且大鼠的肾脏、胸腺和肝脏未出现损伤现象。【结论】 本研究所采用的菌种和发酵工艺能够提高菜籽粕的营养价值,改善菜籽粕风味,提高大鼠的生长性能。

【目的】 研究热风-真空冷冻联合干燥对脆性龙眼果干品质及益生活性的影响,为高品质龙眼果干工业化节能干燥模式提供理论依据。【方法】 以热风干燥、真空冷冻干燥龙眼果干为对照,比较分析热风-真空冷冻联合干燥对脆性龙眼果干水分含量、水分活度、皱缩率、复水比等理化特性和总糖、多糖等营养品质的影响。同时采用GC-MS测定风味物质变化,电量表测定能源消耗量。并选用植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌发酵龙眼果干,比较发酵过程中活菌数、总糖、还原糖以及短链脂肪酸的变化,评价热风-真空冷冻联合干燥对龙眼体外益生活性的影响。【结果】 热风-真空冷冻联合干燥龙眼果干的水分含量、水分活度和皱缩率显著低于热风干燥,而复水比显著高于热风干燥。在总糖、多糖含量以及挥发性风味物质种类和总量上,热风-真空冷冻联合干燥低于真空冷冻干燥而高于热风干燥。在能源消耗上,热风-真空冷冻联合干燥比真空冷冻干燥节约干燥时间12.16%,节约单位能耗25.40%。在益生活性方面,植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌均能通过发酵龙眼干增加活菌数量,利用龙眼干中的总糖产生短链脂肪酸,降低发酵液pH,且益生效果受干燥方式和菌株种类的影响较大。当植物乳杆菌发酵热风-真空冷冻干燥的龙眼果干48 h后,活菌数生长最多可达12.40 lg cfu/mL,高于真空冷冻干燥、热风干燥和新鲜龙眼。嗜酸乳杆菌发酵48 h后,热风-真空冷冻联合干燥活菌数达11.84 lg cfu/mL,与真空冷冻干燥接近,低于热风干燥,但高于新鲜龙眼。【结论】 热风-真空冷冻联合干燥结合了热风干燥和真空冷冻干燥两种干燥方式的特点,可以显著缩短干燥时间,节约能耗,提高干燥效率和果干品质。

【目的】 研究蛋白添加剂对双孢菇农艺性状及品质的影响,为工厂化双孢蘑菇蛋白添加剂的开发、应用与评价提供参考。【方法】 以豆粕（SM）、膨化大豆（ES）、玉米蛋白（CP）和羽毛粉（FM）4种单一蛋白原料为添加剂,以1种蛋白型商业添加剂MCSubstradd?（MCS）作为阳性对照、无添加剂为空白对照（CTL）,添加剂的使用量根据其蛋白含量决定,蛋白添加量占发酵料的0.5%。覆土前,添加剂与新鲜3次发酵料混合,栽培菌株为W192,按照工厂化栽培工艺进行菇房管理,采收三潮蘑菇。参照UPOV测定子实体产量、菌盖直径、菌盖厚度、单菇重量、硬度等农艺性状;用凯氏定氮法测定子实体蛋白质含量,用氨基酸自动分析仪测定子实体氨基酸含量。【结果】 SM、ES、CP均能有效提高蘑菇产量。4个试验组中,CP组总产量最高,达到35.24 kg?m^-2,较CTL组增产24.26%,生物学效率达到105.98%,显著高于其他3个试验组和CTL组,略高于MCS组。每t培养料中添加剂产生的经济效益分析显示,CP组增收最高,为785.23元。SM具有很好的缓释作用,三潮菇产量分别占总产量的48.72%、35.09%和16.19%,接近MCS组缓释效果。ES在提高产量的同时,显著提高第一、二潮蘑菇的硬度品质。5种蛋白添加剂均显著提高3个潮次蘑菇子实体的蛋白质含量,含量最高的3种氨基酸均分别为葡萄糖（Glu）、缬氨酸（Val）和天冬氨酸（Asp）。添加FM和CP能显著提高蘑菇子实体的呈味氨基酸含量,提升蘑菇的风味和口感。【结论】 蛋白添加剂均可以有效提高蘑菇产量,对子实体农艺性状和品质影响存在特异性。综合多种添加剂原料的特异性优势,开发复合、缓释型添加剂,实现双孢蘑菇优质高产,是今后双孢蘑菇添加剂的研究方向。

【目的】 研究饲粮中添加大豆异黄酮对早期断奶仔猪生长性能和抗氧化作用及免疫功能的影响。【方法】 选用160只5.5 kg 21日龄断奶的（杜×长×大）三元杂交仔猪,根据体重和性别随机分成5组,每组4个重复（公母各4只）。各处理组饲粮大豆异黄酮添加水平分别为0（空白对照组）、10、20、40、80 mg·kg^-1。试猪饲养至7、42d时每个重复分别选取平均体重的试猪屠宰并取样测定。【结果】 断奶后8—42 d和整个试验期阶段,大豆异黄酮40 mg·kg^-1组平均日采食量显著高于空白对照组、10 mg·kg^-1大豆异黄酮组和20 mg·kg^-1大豆异黄酮组（P<0.05）。断奶后8—42 d时,大豆异黄酮20 mg·kg^-1组料重比显著低于空白对照组和80 mg·kg^-1大豆异黄酮组（P<0.05）。断奶后7d,肝脏中丙二醛（MDA）含量随大豆异黄酮添加水平提高有降低的趋势,其中添加大豆异黄酮40和80 mg·kg^-1 组试验猪肝脏中的MDA含量显著低于空白对照组和10 mg·kg^-1 大豆异黄酮组。添加大豆异黄酮20 mg·kg^-1 组仔猪血清超氧化物歧化酶（SOD）活性显著高于空白对照组、40 mg·kg^-1 大豆异黄酮组和80 mg·kg^-1大豆异黄酮组（P<0.05）。添加大豆异黄酮10 mg·kg^-1 组肝脏组织谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性显著高于对照组和80 mg·kg^-1 大豆异黄酮组（P<0.05）。断奶后8—42 d时,20 mg·kg^-1大豆异黄酮组试验猪料重比显著低于空白对照组和80 mg·kg^-1大豆异黄酮组（P<0.05）。断奶42d时,添加大豆异黄酮40 mg·kg^-1 组血清SOD活性显著高于空白对照组、10 mg·kg^-1 大豆异黄酮组和80 mg·kg^-1大豆异黄酮组（P<0.05）。大豆异黄酮20 mg·kg^-1组肝脏的GSH-Px活性显著高于空白对照组和80 mg·kg^-1 大豆异黄酮组（P<0.05）。断奶后42d,大豆异黄酮40和80 mg·kg^-1组的空肠SOD活性显著高于对照组（P<0.05）;添加大豆异黄酮40 mg·kg^-1组空肠的GSH-Px活性显著高于对照组和10 mg·kg^-1大豆异黄酮组（P<0.05）;饲粮大豆异黄酮对空肠的金属硫蛋白（MT）含量有显著影响作用,其中大豆异黄酮10 mg·kg^-1组空肠的MT含量显著高于空白对照组（P<0.05）。断奶后7、42d对照组仔猪十二指肠绒毛成舌状排列,绒毛顶端凹陷且脱落严重,各处理组与对照组相比,十二指肠绒毛损伤程度降低,其中40 mg·kg^-1组仔猪十二指肠绒毛最完整,成柱状排列。添加大豆异黄酮对断奶仔猪42d的血液中CD4⁺的水平有显著影响作用,对淋巴细胞转化率、CD8⁺、CD4⁺/ CD8⁺无显著影响（P>0.05）,其中大豆异黄酮10和20 mg·kg^-1组血液中CD4⁺水平显著低于空白对照组和80 mg·kg^-1大豆异黄酮组（P<0.05）。【结论】 饲粮中添加大豆异黄酮能够提高断奶仔猪的生长性能,增强机体的抗应激能力,对肠绒毛有一定的保护作用,早期断奶仔猪大豆异黄酮适宜添加量为40mg·kg^-1。

【目的】 对流产马驹组织进行马流产沙门氏菌的分离和鉴定,以分离株制备凝集抗原,旨在建立一种敏感、特异、操作简便和高通量的微量凝集方法,实现对马流产沙门氏菌抗体进行快速检测。【方法】 利用沙门氏菌显色培养基对流产的马驹脏器进行细菌分离,对紫色菌落进行革兰氏染色鉴定;提取细菌全基因组,利用16S rRNA 进行 PCR扩增和测序鉴定,并对菌株进行生化鉴定和血清型鉴定,对病因进行综合诊断。利用分离获得的阳性菌株进行灭活后作为凝集抗原,以马流产沙门氏菌标准阳性血清作为阳性对照,通过反应条件优化,建立微量凝集试验方法,并对该方法的特异性、敏感性、重复性进行了验证。与国家行业标准中的试管凝集试验方法进行对比,同时利用微量凝集对华北和西北各3个地方的共151份血清样品进行检测,并随机选取30份样品,利用微量凝集和试管凝集进行检测,并对两种方法检测的敏感性进行比较分析。【结果】 各流产马驹组织在沙门氏菌显色培养基上划线结果,均可以获得大量紫色目标菌落;革兰氏染色结果表明,分离的菌株为革兰氏阴性短杆菌,16S rRNA测序证实分离株为沙门氏菌属,生化鉴定结果表明,分离的17株菌均符合马流产沙门氏菌的生化特性,但相比上世纪强毒株马流产沙门氏菌C77-1,均不能发酵鼠李糖;血清型鉴定证实分离株均为马流产沙门氏菌,将分离的17株马流产沙门氏菌分别命名为E.S-1—17。因此证实马匹流产均为马流产沙门氏菌感染所致。利用甲醛对E.S-1菌株进行了灭活处理,成功制备了马流产沙门氏菌凝集抗原,并建立了一种快速敏感的微量凝集检测方法,其中优化了最佳反应凝集抗原浓度为4亿/mL。其敏感性比试管凝集高1个滴度,其特异性与其他常见马传染病病原阳性血清无交叉反应,并且具有良好的重复性。利用微量凝集方法,对华北3个疫情区进行检测,阳性率分别为28.6%、42.9%和27.3%,西北3个无疫情区阳性率均为0%。此外,利用两种方法对相同的30份临床血清进行检测,微量凝集和试管凝集方法阳性份数分别为10份和3份,阳性率分别为33.3%和10%。与试管凝集相比,微量凝集诊断敏感性为100%,诊断特异性为74.1%,总体符合率为76.7%。【结论】 分离鉴定获得了17株马流产沙门氏菌,建立了马流产沙门氏菌微量凝集抗体检测方法,该方法敏感性高、特异性强、重复性好,简便、快速、高通量,可以广泛应用于马属动物中马流产沙门氏菌抗体的检测,是该病诊断及疫苗评估的重要依据之一。

【背景】 长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）是一类长度>200 nt且不具有编码能力的转录本,能够在真核生物的转录水平和转录后水平通过顺式（cis）、反式（trans）或竞争性内源RNA（competing endogenous RNA,ceRNA）机制调控基因的表达,已被证明在生物体的生长和发育等生物学过程中发挥重要的调控作用。【目的】 结合测序得到的东方蜜蜂微孢子虫（Nosema ceranae）纯化孢子的small RNA（sRNA）组学数据和前期获得的lncRNA组学数据对lncRNA的调控方式进行深入细致的分析和探讨,揭示lncRNA在东方蜜蜂微孢子虫孢子中的潜在功能。【方法】 利用small RNA-seq（sRNA-seq）技术对东方蜜蜂微孢子虫纯化孢子进行测序,通过相关的生物信息学软件对测序数据进行质控。根据lncRNA与mRNA的位置关系预测lncRNA的上下游基因;使用Blast软件比对GO和KEGG数据库,对上下游基因进行功能和代谢通路注释;利用Target Finder软件预测lncRNA-miRNA及lncRNA-miRNA-mRNA调控网络,进而通过Cytoscape v3.7.2软件对调控网络进行可视化;利用RT-PCR对调控网络中的部分lncRNA、miRNA和mRNA的表达进行验证。【结果】 东方蜜蜂微孢子虫纯化孢子样品的sRNA-seq分别得到16 597 883、15 451 791和12 248 316条raw reads,经质控分别得到15 608 370、14 249 255和11 440 684条clean reads,各样品的Q30≥98.58%。共预测出lncRNA的上下游基因310个,它们可注释到代谢进程、细胞进程、催化活性、结合和细胞等相关的35个功能条目;此外还可注释到56条代谢通路,涉及嘌呤代谢、碳代谢和丙酮酸代谢等物质代谢通路,以及甲烷代谢、氧化磷酸化和糖酵解/糖异生等能量代谢通路。上述结果表明相应的lncRNA可能通过cis作用调节上下游基因的表达,从而参与调控东方蜜蜂微孢子虫孢子中的物质和能量代谢以及细胞生命活动。进一步构建lncRNA-miRNA调控网络,分析结果显示MSTRG.3636.1、MSTRG.4498.1和MSTRG.4883.1可靶向结合4个miRNA（nce-miR-7729、nce-miR-7502、nce-miR-8639和nce-miR-8565）,说明此3个lncRNA可作为ceRNA在东方蜜蜂微孢子虫孢子中发挥潜在作用。LncRNA-miRNA-mRNA调控网络分析结果显示,三者之间形成较为复杂的调控网络关系,miRNA处于调控网络的中心并联系lncRNA和mRNA,nce-miR-7502和nce-miR-8639结合的mRNA最多,达到28个;与MSTRG.3636.1、MSTRG.4498.1和MSTRG.4883.1存在靶向关系的miRNA结合多个mRNA,表明上述3个lncRNA可能通过ceRNA机制发挥作用,从而影响东方蜜蜂微孢子虫孢子中的新陈代谢和生命活动。【结论】 lncRNA可能通过cis作用调控上下游基因的表达,以及作为ceRNA通过吸附miRNA间接影响靶基因的表达,从而参与调节东方蜜蜂微孢子虫孢子中的物质和能量代谢等基本生命活动。