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2020年 第53卷 第12期 刊出日期：2020-06-16

  

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中国农业科学. 2020, 53(12):  0. 

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作物遗传育种·种质资源·分子遗传学

小麦PIN基因家族的鉴定及表达分析

刘培勋,万洪深,郑建敏,罗江陶,蒲宗君

中国农业科学. 2020, 53(12):  2321-2330.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2020.12.001

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【目的】PIN（puroindoline）是植物所特有的一类蛋白家族,对控制小麦籽粒硬度有重要功能。分析小麦PIN家族成员在全基因组的分布、结构及进化,研究其在不同组织的表达特异性以及在不同硬度种子的表达模式,为阐明小麦PIN基因家族的生物学功能奠定基础。【方法】根据已报道的小麦PIN基因和大麦HIN基因,利用BLASTP和HMM方法,在最新发布的小麦中国春参考序列中鉴定小麦PIN基因家族成员。利用UniProt、URGI、PFAM、CDD、expVIP等数据库,采用Clustal X、MEGA 7.0、ExPASy、MEME、GSDS、TB tools、GraphPad Prism5等软件进行生物信息学分析。采用qRT-PCR方法检测TaPIN基因家族在不同籽粒硬度小麦样品中的表达情况。【结果】共鉴定出19个小麦PIN基因,集中成簇分布于第1、5和7染色体同源群,编码148—327个氨基酸,编码蛋白相对分子量为16.39—37.19 kD,等电点为6.35—9.34。通过结构域和系统发育分析,可将19个TaPIN基因分为A和B两大类。大部分TaPINs基因仅有1个外显子,没有内含子,顺式作用元件分析发现其上游序列包含大量抗逆和种子发育相关的调控元件。转录组分析表明该基因家族在小麦籽粒中相对表达量很高,而在根茎叶等其他组织几乎不表达。实时荧光定量PCR表明,各基因间相对表达量差异显著,TaPIN9和TaPIN10表达量较高。随着小麦籽粒硬度降低,TaPIN9和TaPIN10表达上调,且表达比例增加,而TaPIN16和TaPIN6则呈现相反的趋势。【结论】小麦籽粒硬度的调节以Pina和Pinb为主,该基因家族其他成员也具有相同结构域,推测也具有相似功能,但受表达量低的限制,对籽粒硬度影响较小。从该基因的进化关系看,粗山羊草与小麦亲缘关系最近,其次是燕麦、黑麦和大麦。

绿小米和白小米谷子籽粒叶绿素合成途径结构基因的表达分析

张彬,李萌,刘晶,王俊杰,侯思宇,李红英,韩渊怀

中国农业科学. 2020, 53(12):  2331-2339.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2020.12.002

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【目的】不同种类色素积累使小米呈现出不同的颜色性状。通过对比绿色小米和白色小米间的米色表型差异、不同色差指标值、叶绿素含量、籽粒内部超微结构和叶绿素合成途径结构基因的表达差异,找出导致绿色和白色小米颜色差异的关键酶基因,探索绿色小米米色形成的分子机制。【方法】利用色差仪对米色（L*、a*、b*）值进行测定;采用紫外分光光度计法分别对绿小米和白小米籽粒中叶绿素a、b及总叶绿素含量进行测定;通过透射电镜观察分析处于灌浆中期的小米籽粒内部淀粉体和质体小球的大小和数量;同时采用qRT-PCR方法对叶绿素合成途径上游和下游共18个结构基因在不同米色表型的3个品种中的表达模式进行了分析;并以谷子幼苗叶片DNA为模板,对不同米色品种谷子中SiCAO全长进行克隆及序列比对分析。【结果】大青谷和露米青谷脱壳后的小米颜色为绿色,牛毛白的小米颜色为白色,且色差仪检测结果显示绿色小米的绿度指标a*值低于白色小米;2个绿色小米籽粒中的Chla、Chlb和Chl含量均显著高于白色小米籽粒,且在白色小米籽粒中仅检测到0.006 mg·g^-1的Chlb;qRT-PCR结果显示,SiCAO在白米品种籽粒中几乎不表达,而其在2个绿小米品种籽粒中都有高峰度表达,SiCAO在不同米色品种中的极显著差异表达是它们呈现米色表型差异的主要原因;从3个品种中分别克隆出开放阅读框架为1 626 bp的SiCAO,它们分别在第171、184、195、286、318个氨基酸处存在差异;超微结构观察表明,谷子籽粒胚乳层主要由单粒淀粉体构成,绿小米较白小米中的淀粉体个体较大、着色深,且绿小米淀粉体周围充满了质体小球及圆球体,这种差异可能对籽粒中色素积累产生影响。【结论】SiCAO在绿米品种籽粒中的过量表达和在白米品种籽粒中的不表达是导致绿色和白色小米籽粒叶绿素含量差异,进而使得它们分别呈现绿色和白色表型的主要原因之一。

一种CRISPR-Cas9介导的拟南芥高效基因编辑系统的构建与应用

张成,何明亮,汪威,徐芳森

中国农业科学. 2020, 53(12):  2340-2348.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2020.12.003

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【背景】近些年兴起的CRISPR-Cas9基因编辑技术在多种植物中实现了高效的基因打靶,为基因功能研究提供了一种高效快速的方法,但一些CRISPR-Cas9载体编辑效率很低。【目的】通过构建一种由RIBOSOMAL PROTEIN S5 A（RPS5A）启动子启动Cas9并带有红色荧光蛋白筛选标记的CRISPR-Cas9载体,提高拟南芥CRISPR-Cas9编辑效率,并利用这套系统对拟南芥木葡聚糖内糖基转移/水解酶基因TOUCH4（TCH4）进行编辑。【方法】在pKSE401载体的基础上,以从胚胎发育早期就表现出高转录活性的RPS5A启动子替换35S启动子、以DsRed2替换潮霉素抗性基因,构建拟南芥中使用的CRISPR载体pRSE-WH;以AtTCH4为靶基因,使用CRISPR-P 2.0（http://crispr.hzau.edu.cn）设计靶位点,将所设计的靶点序列在拟南芥参考基因组中比对分析以排除非特异性靶位点,最终筛选出2个靶位点target 1和target 2。化学合成带有接头的靶位点寡核苷酸序列,退火后分别与pRSE-WH载体连接,构建TCR1和TCR2表达载体,采用农杆菌介导的沾花法侵染野生型拟南芥Col-0,以红色荧光蛋白为标记筛选获得T₁代转基因阳性植株。通过靶位点扩增测序法判断T₁代转基因植株在预期靶位点是否发生编辑,根据测序结果的峰图对编辑情况进行解码,进一步分析突变类型及基因型。【结果】构建了一个在拟南芥中高效编辑的CRISPR载体pRSE-WH。TCR1和TCR2成功地实现了对TCH4的定点编辑,靶点一的编辑效率为80%,靶点二的编辑效率为100%,总编辑效率为86%。根据测序结果的峰图解码了T₁代植株的突变结果,纯合编辑、杂合编辑、双等位编辑均有出现。对不同的编辑类型进行统计发现,59株T₁代阳性植株中,无编辑8株,占比13.56%,纯合编辑9株,占比15.25%,双等位编辑40株,占比67.80%,杂合编辑2株,占比3.39%。在T₁代发生纯合编辑以及双等位编辑的株系中选择了无红光种子进行繁种,并对T₂代植株编辑情况进行测序检测,结果发现T₁代中的突变成功遗传到了T₂代无Cas9株系中。【结论】pRSE-WH在拟南芥中展现了极高的编辑效率,并且通过对种子进行红色荧光筛选,能够简便地获得无Cas9且稳定遗传的T₃代突变体。

耕作栽培·生理生化·农业信息技术

地膜覆盖条件下黄土高原玉米产量及水分利用效应分析

徐佳星,封涌涛,叶玉莲,张润泽,胡昌录,雷同,张树兰

中国农业科学. 2020, 53(12):  2349-2359.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2020.12.004

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【目的】综合评价地膜覆盖玉米的产量以及水分利用效应,为黄土高原地区玉米生产合理利用地膜覆盖技术提供指导。【方法】本文在中国知网（CNKI）,Web of Science与EI Compondex文献数据库,收集了从2000—2017年间已发表的黄土高原地膜覆盖玉米产量及水分利用文章数据,综合分析了地膜覆盖对玉米产量、水分利用及水分利用效率的影响。【结果】黄土高原半膜覆盖平均产量为9 348 kg·hm^-2,较对照产量7 059 kg·hm^-2增产33%,全膜覆盖平均产量为9 191 kg·hm^-2,较对照产量5 910 kg·hm^-2增产56%,半膜覆盖或者全膜覆盖均显著提高了玉米产量,但是全膜覆盖和半膜覆盖之间玉米产量相近,没有显著差异。另外,半膜覆盖海拔高度超过630 m时或全膜覆盖海拔高度超过900 m时,玉米增产率随海拔高度的增加而呈增加的趋势,可能与覆膜提高土壤温度有关。半膜覆盖平均蒸散量为385 mm,较对照蒸散量389 mm减少1.0%,全膜覆盖平均蒸散量为366 mm,较对照蒸散量357 mm增加2.8%,半膜覆盖玉米蒸散量较不覆膜有所减少,但是全膜覆盖显著增加了玉米蒸散量,不过2种覆膜措施的蒸散量之间差异不显著。半膜覆盖平均水分利用效率为17.3 kg·hm^-2·mm^-1,较对照水分利用效率13.2 kg·hm^-2·mm^-1增加31%,全膜覆盖平均水分利用效率为17.5 kg·hm^-2·mm^-1,较对照水分利用效率11.7 kg·hm^-2·mm^-1增加50%,半膜覆盖与全膜覆盖均显著提高了玉米水分利用效率,但是全膜覆盖和半膜覆盖之间玉米水分利用效率相似,没有显著差异。覆膜显著增加玉米产量及水分利用效率与其降低土壤无效蒸发量（57 mm）,提高玉米潜在的蒸腾效率有关（11.2 kg·hm^-2·mm^-1）。【结论】在区域尺度上半膜覆盖与全膜覆盖对玉米产量、蒸散量及水分利用效率具有等效性,考虑到地膜的环境污染与经济成本等因素,推荐黄土高原玉米栽培选用半膜覆盖。

基于区域亮度自适应校正算法的脐橙表面缺陷检测

张明,王腾,李鹏,邓烈,郑永强,易时来,吕强,孙荣荣

中国农业科学. 2020, 53(12):  2360-2370.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2020.12.005

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【目的】针对类球型水果表面亮度分布不均现象,传统算法难以有效直接分割水果表面缺陷区域问题,提出一种基于区域亮度自适应校正的脐橙表面缺陷检测算法。【方法】选择区域经济价值较高的纽荷尔脐橙为研究对象,对其采集原始可见光RGB图像。试验中发现R-B融合分量图像灰度呈明显双峰分布,故根据直方图信息利用单阈值法（分割阈值T₁=60）去除图像背景,获得R-B目标图像;基于本文提出的一种区域亮度自适应校正算法对脐橙表面缺陷进行检测,首先设定目标图像邻域窗口大小为w×w（邻域窗口大小w=13）,通过对其窗口大小内较亮像素点的集合提取脐橙表面亮度信息,然后基于此表面亮度信息对去除背景的R-B目标图像进行均一化校正,经亮度校正后的图像发现其表面缺陷区域与正常组织区域灰度对比度大,宜采用单阈值法（分割阈值T=194）直接对亮度校正后的脐橙图像进行表面缺陷分割提取;最后对表面缺陷分割后的二值化图像进行面积滤波以去除杂散点及噪声。【结果】采用双峰法可在有效去除图像背景的同时完好保留目标脐橙表面信息;基于区域亮度自适应校正算法对溃疡病果、蓟马虫果、介壳虫果、虫伤果、黑星病果、风伤果、炭疽病果、裂伤果等8种常见脐橙表面缺陷果,共计356幅样本图像进行亮度校正,采用单阈值法对亮度校正后的图像进行表面缺陷分割,其分割率高,整体缺陷准确识别率达到了95.8%,平均处理每幅图像耗时0.29 s。与直方图均衡化算法、基于Retinex理论算法以及基于照度-反射理论算法得到的亮度校正图像相比,本文算法亮度校正效果最优且算法简单、缺陷识别率高、计算速度快,其运算速度分别减少了0.27、0.14和1.45 s,缺陷识别率提高了2.6%—8.2%。【结论】基于区域亮度自适应校正的脐橙表面缺陷检测算法有效解决了脐橙类水果表面亮度分布不均导致的表面缺陷难分割问题,为脐橙在线精确分级提供了技术支持,也为其他类球型水果表面缺陷快速检测提供了一种新方法。

植物保护

小麦叶锈菌效应蛋白Pt18906激发TcLr27+31的双层防御反应

齐悦,吕峻元,张悦,韦杰,张娜,杨文香,刘大群

中国农业科学. 2020, 53(12):  2371-2384.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2020.12.006

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【目的】由小麦叶锈菌（Puccinia triticina）引起的小麦叶锈病是影响小麦生产的主要病害之一,在小麦与叶锈菌互作的过程中病菌向寄主细胞分泌效应蛋白,以调控寄主防御反应、发挥毒性功能。开展对小麦叶锈菌效应蛋白的研究,探索小麦叶锈菌的致病机制,为病害的持续防控提供依据。【方法】以小麦叶锈菌13-5-72与感病品种Thatcher互作的cDNA为模板扩增效应蛋白Pt18906,通过SignalP 4.1、TargetP 1.1、TMHMM 2.0和EffectorP 2.0软件对Pt18906进行序列特征分析,利用在线软件Swiss-Model预测Pt18906的三级结构,利用在线软件SOPMA预测Pt18906的二级结构。采用实时荧光定量PCR对Pt18906的表达模式进行分析,借助于烟草的异源表达系统对Pt18906进行抑制Bax和INF1诱导的细胞程序性死亡（programmed cell death, PCD）能力验证,利用酵母系统验证Pt18906的信号肽是否具有分泌功能,采用氨基酸逐步缺失的方法缺失突变Pt18906,从而确定其功能毒性motif;通过在烟草中瞬时表达Pt18906-GFP融合蛋白,结合质壁分离技术分析Pt18906的亚细胞定位,得出效应蛋白的作用位点;利用瞬时表达技术在以Thatcher为背景的不含抗病基因和含有不同抗病基因的全套近等基因系上开展Pt18906无毒性功能分析;采用细菌三型分泌系统（Type Ⅲ secretion system）介导的瞬时转化分析Pt18906对寄主防御反应的调控。【结果】从小麦叶锈菌13-5-72与感病品种Thatcher互作6 d的转录组文库中获得一个在接种24 h后显著高表达的、基因全长序列672 bp、编码223个氨基酸的候选效应蛋白Pt18906,该效应蛋白缺乏已知的功能结构域和保守基序,工作环境偏碱性,在烟草细胞中瞬时表达Pt18906,Pt18906能够抑制Bax和INF1诱导的细胞程序性死亡,表明该效应蛋白具有毒性功能,并且通过构建缺失突变体明确其28—47位氨基酸对其毒性功能具有重要作用,该效应蛋白定位于细胞核和细胞质,表明其作用于细胞内。Pt18906在单基因系抗病品种TcLr27+31和TcLr42上能够引起过敏性坏死反应,表明该效应蛋白的无毒性,Pt18906能够引起TcLr27+31中胼胝质的积累和活性氧的迸发,胼胝质随注射时间的增加而逐渐积累,活性氧在注射后的10 min达到最高。【结论】位于28—47位的氨基酸决定Pt18906的毒性主要功能,Pt18906能激发小麦TcLr27+31双层防御反应。

喷嘴类型对植保无人飞机喷雾性能的影响

贡常委,马钰,杨锐,阮彦伟,王学贵,刘越

中国农业科学. 2020, 53(12):  2385-2398.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2020.12.007

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【目的】植保无人飞机具有喷雾效率高、适用性好、作物损伤小和操控人员安全系数高等特点,但飘移严重制约着其推广应用,喷嘴作为核心组件,是影响雾滴飘移的关键因素。本文旨在明确不同类型喷嘴对植保无人飞机喷雾的雾化性能及雾滴飘移的影响,为选择合适喷嘴提供理论依据。【方法】筛选20种常见的扇形、气吸型和圆锥形喷嘴,采用激光粒度仪系统测定并计算喷嘴的分布跨度、体积中径（D₅₀）及尺寸<150 μm的雾滴占全部雾粒体积的百分比（ΦVol_{<150 μm}）等表征雾化性能的参数,在开放式风洞中首先测定不同喷嘴在0.3 MPa下的流量,然后采用相片纸法和麦拉片法评价喷嘴型号对喷雾飘移和飘移沉积雾滴粒径特征的影响。【结果】在0.3 MPa喷雾压力下测定不同喷嘴雾化性能表明,在常规扇形喷嘴中,F110-01、F110-015、F110-02和F110-03随着型号的增加,分布跨度和D₅₀显著增加,而ΦVol_{<150 μm}显著减低,气吸型扇形喷嘴AFC-01—AFC-05和圆锥形喷嘴HCC80-0075—HCC80-025具有相同的规律,但相同型号的气吸型扇形喷嘴,ΦVol_{<150 μm}均显著小于扇形喷嘴和圆锥形喷嘴,而分布跨度和D₅₀均大于扇形喷嘴和圆锥形喷嘴;在气吸型扇形喷嘴中,AFC-01及IDK120-015分布跨度和D₅₀显著小于其他类型;IDK120-015 ΦVol_{<150 μm}极显著低于HCC80-02、F110-015和F110-03,分布跨度和D₅₀显著高于HCC80-02和F110-015,HCC80-02的流量分别与IDK120-015、F110-015之间差异不显著,均显著低于F110-03。进一步采用麦拉片和相片纸法评价地面飘移沉积雾滴粒径特征和飘移量,喷嘴类型和飘移距离对飘移沉积雾滴D₅₀和分布跨度的影响均达到极显著,飘移距离3 m的D₅₀和分布跨度均显著低于1 m和2 m的,Depositscan软件计算预估飘移量的趋势和实测飘移量一致,均为HCC80-02>F110-015>F110-03>IDK120-015。计算不同喷嘴防飘移效果可知,IDK120-015的防飘移效果最好,达72.02%,F110-03次之,HCC80-02最差。【结论】麦拉片和相片纸均可收集地面飘移量作为评估雾滴飘移的方法;合理选择喷嘴可降低小雾滴的百分比和扩大相对雾滴粒径,显著减少植保无人飞机施药作业过程中的雾滴飘移。

山东省小麦田播娘蒿对双氟磺草胺抗性水平及靶标抗性机理

高兴祥,张悦丽,李美,李健,房锋

中国农业科学. 2020, 53(12):  2399-2409.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2020.12.008

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【背景】播娘蒿（Descurainia sophia）是一种冬小麦田分布广泛且危害严重的阔叶杂草,双氟磺草胺则是目前冬小麦田防除阔叶杂草应用面积最大的一种ALS抑制剂类除草剂。双氟磺草胺经多年应用后,对部分区域冬小麦田播娘蒿防治效果下降,可能与当地播娘蒿对双氟磺草胺产生抗药性有关。【目的】明确山东省冬小麦田播娘蒿对双氟磺草胺的抗性水平和抗性机理,为制定小麦田播娘蒿等阔叶杂草精准区域防控提供理论依据。【方法】以播娘蒿为研究对象,在温室内采用整株生物测定法测定40个播娘蒿种群对双氟磺草胺和对比药剂苯磺隆、2甲4氯共3种除草剂的抗性水平,同时根据播娘蒿ALS基因序列,设计引物,提取对双氟磺草胺高抗的播娘蒿单株基因组DNA,测序获得序列与敏感型基因进行比对,查找突变位点,明确靶标抗性机理。【结果】抗性水平测定结果表明,40个播娘蒿种群中有32个对双氟磺草胺敏感,占80.00%,低抗、中抗和高抗种群分别有3、3和2个,JN-1、JNI-2、LY-2为低抗种群,LC-3、LY-4、YT-1为中抗种群,相对抗性指数（RI）分别为49.00、26.44、21.09,BZ-1和DZ-3属于高抗种群,RI分别为52.00和194.00。对BZ-1和DZ-3进行的ALS基因检测结果表明,BZ-1种群ALS基因第197位氨基酸发生CCT（Pro）到TCT（Ser）或CTT（Leu）突变,DZ-3种群ALS基因第574位氨基酸发生TGG（Trp)到TTG（Leu）突变。另外,40个种群中对对比药剂苯磺隆产生抗性的种群有19个,占总样点数的47.50%,低抗种群有11个,中抗种群有6个,RI分别为38.05、13.55、11.54、10.45、11.50、11.02,高抗种群为DZ-3和LY-4,RI分别为244.75和68.50;40个播娘蒿种群对另一种对比药剂2甲4氯没有产生抗药性。【结论】山东省小麦田采集的40个播娘蒿种群中已有20.00%的种群对双氟磺草胺产生抗性,且高抗双氟磺草胺的播娘蒿种群发生不同位置氨基酸取代。播娘蒿对苯磺隆的抗性仍很严重,但对激素类除草剂2甲4氯未产生抗药性。针对播娘蒿发生区域,不能单一使用双氟磺草胺,应推广多种作用机理的除草剂交替、混和使用,从而延缓和控制杂草产生抗药性,同时扩大杀草谱、降低除草剂使用量。

土壤肥料·节水灌溉·农业生态环境

中国稻田土壤有机质时空变化及其驱动因素

李冬初,黄晶,马常宝,薛彦东,高菊生,王伯仁,张杨珠,柳开楼,韩天富,张会民

中国农业科学. 2020, 53(12):  2410-2422.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2020.12.009

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【目的】评价中国稻田土壤有机质时空变化特征,为提高耕地质量,应对种植结构调整及气候变化等提供支撑。【方法】基于1988—2017年开展的338个国家级定位监测点,分析稻田耕层土壤有机质含量变化特征、驱动因素以及对土壤容重影响。【结果】近30年全国稻田耕层土壤有机质平均提高了3.49 g·kg^-1,年均增速0.09—0.12 g·kg^-1。稻田耕层土壤有机质含量年均增速高低依次为东北、长江下游、长江中游、华南和西南。目前,全国稻田耕层土壤有机质平均含量32.4 g·kg^-1,从高到低依次为长江中游、华南、东北、西南和长江下游。气候、土壤类型、氮肥投入以及种植制度等对土壤有机质产生影响。西南稻区和高纬度的东北稻区,稻田土壤有机质含量与年均气温显著负相关（P<0.05）,东部地区和低纬度的地区稻田土壤有机质含量与年均气温显著正相关（P<0.05）。潜育型水稻土有机质平均含量显著高于其他类型水稻土。合适的氮肥投入量（200—300 kgN·hm^-2·a^-1）有利于土壤有机质累积。土壤容重及耕层深度与土壤有机质存在显著响应关系（P<0.01）。【结论】我国稻田耕层土壤有机质含量整体呈上升趋势,年均增速呈现从南到北依次增加的趋势。年均气温和降水量,土壤类型,氮肥用量和种植制度等管理措施是区域土壤有机质含量分异的主要驱动因子。

施氮量对农田土壤有机氮组分及酶活性的影响

焦亚鹏,齐鹏,王晓娇,武均,姚一铭,蔡立群,张仁陟

中国农业科学. 2020, 53(12):  2423-2434.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2020.12.010

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【目的】探讨不同施氮量条件下土壤氮素转化酶活性和有机氮组分含量的变化规律,并分析氮素转化酶活性与各有机氮组分之间的关系,为陇中黄土高原旱作农业区合理制定施肥量和施肥方案提供参考依据。【方法】基于设置在陇中黄土高原定西市李家堡镇麻子川村的不同施氮量（0（CK）、52.5（N1）、105（N2）、157.5（N3）、210（N4）kg N·hm^-2）春小麦长期定位试验,收获后使用Bremner法测定0—40 cm土层中有机氮组分含量,以及4种氮素转化相关酶的活性。【结果】土壤有机氮组分分配比例顺序为氨基酸态氮>酸解铵态氮>酸解未知态氮>氨基糖态氮,同一土层随着施氮量的增加土壤有机碳、全氮、酸解总氮、氨基酸态氮、酸解铵态氮和脲酶活性、蛋白酶活性均呈先增大后降低的趋势,除全氮外其余都在N2处理时最大,全氮含量在N3处理时达到最大;同一处理不同土层间均随土层加深而降低。冗余分析结果表明,全氮含量和蛋白酶活性是影响陇中黄土高原农田有机氮组分分布与转化的关键因子;碳氮比与所有有机氮组分均呈负相关,蛋白酶、有机碳和脲酶与氨基酸态氮呈极显著正相关。【结论】综合而言,N2处理土壤供氮潜力最高,全氮和蛋白酶是影响该区春小麦土壤有机氮组分转化的关键因子。氮肥合理施用能明显提高土壤有机氮含量,不同施氮量条件下土壤有机氮组分变化差异明显,改变了氮素相关转化酶的活性。

中国北方新增耕地的时空变化及驱动因素分区

王鸣雷,史文娇

中国农业科学. 2020, 53(12):  2435-2449.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2020.12.011

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【目的】新增耕地的时空变化格局受气候变化和人类活动的双重影响,明确新增耕地时空格局变化及其驱动因素,为保障耕地资源和农业可持续发展提供指导。【方法】基于1980s—1990s、1990s—2000s、2000s—2010s 3个时段中国北方的新增耕地数据,利用重心转移模型和区域统计等方法,探讨中国北方新增耕地的重心变化以及时空格局变化;基于气候数据计算3个时段≥10 ℃积温（AAT10）以及标准化降水蒸散指数（SPEI）,分析气候因素对耕地开垦的驱动作用;基于1980s以来的社会经济统计数据,结合空间叠加模型、区域统计模型等分析人为因素对耕地开垦的促进作用;综合气候和人为因素,结合地理分区的方法对中国北方的新增耕地进行分区。【结果】1980s以来,中国北方新增耕地重心呈现由东北向西北转移的态势;大多数耕地开垦地区的气候有暖干化趋势,2000年以来具有暖湿趋势的耕地开垦区比例逐渐增加;农业为主人口的增加、农业技术进步以及国家政策的影响为东北、新疆等地耕地资源扩张提供了必要的基础;新疆、黑龙江、吉林等地丰富的耕地后备资源以及平坦的地势条件为耕地开垦提供了可能;基于对气候和人为驱动因素分析,将中国北方分为7个分区,即东北北部气候驱动林草-耕地转换区、东北气候+人为驱动林草-耕地转换区、东北中部气候+人为驱动水旱转换区、北方气候+人为驱动林草-耕地转换区、黄土高原人为驱动生态恢复区、西北人为驱动荒地-耕地转换区以及新疆人为驱动绿洲农业开垦区。【结论】1980s以来,中国北方新增耕地时空格局表现出明显的差异性;暖干气候并未成为耕地开垦的限制因素,而较为湿润的气候在一定程度上促进了耕地的开垦;农业人口的增加、农业技术的进步以及国家政策的影响,对耕地开垦起到重要作用。

园艺

打蜡处理对温州蜜柑果实异味物质积累的影响

邹运乾,张立,吴方方,许让伟,徐娟,胡世全,谢合平,程运江

中国农业科学. 2020, 53(12):  2450-2459.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2020.12.012

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【背景】温州蜜柑（Citrus unshiu）是我国最重要的主栽鲜食宽皮柑橘,经洗果、打蜡、包装等采后商品化处理后,果肉异味物质快速积累,不仅影响果实口感、风味和消费者的购买选择,而且影响到果实的货架期和产品市场竞争能力。【目的】研究打蜡处理对温州蜜柑果实异味物质积累的影响,以期优化宽皮柑橘采后商品化处理技术和工艺,延长果实货架期,提高鲜果的市场竞争能力。【方法】以‘尾张’温州蜜柑成熟果实为试验材料,模拟生产中采用不同固体物含量的果蜡进行打蜡处理;扫描电镜观察各处理果实表面蜡质形态;气相色谱仪检测果实内部气体和异味物质含量;同时对光泽度、异味、风味、出汁量、满意度、甜度、酸度和总体满意度等消费者感官评价指标进行分析。【结果】打蜡处理能增加表面光泽度,同时使果实表面被人工合成蜡液覆盖,扫描电镜观察可见气孔被蜡液堵塞,果实内部O₂含量下降,CO₂含量上升。常温贮藏3周时,402D原液处理温州蜜柑果实内部CO₂浓度增加7.1%,比对照组增加1.0%;O₂浓度从1.6%降到1.4%。果肉乙醇和乙醛含量快速积累,产生异味,402D原液处理的果实内部乙醇含量1 773.8 mg·L^-1,商业果蜡（美国产402D果蜡）经过稀释可提高果心O₂含量,降低CO₂的含量,延缓果肉异味物质的积累速率。而1﹕1稀释后,果实内部乙醇含量560.5 mg·L^-1,感官评价由“高亮”到“较亮”,总体评价得分显著升高。果实打蜡处理后模拟低温冷链（4℃）贮运能有效抑制异味物质的积累,延长果实货架期。【结论】打蜡处理是导致温州蜜柑果实异味物质快速积累的关键原因,402D果蜡按1﹕1用水稀释后打蜡处理温州蜜柑果实在4℃下冷藏,能显著减少果肉异味物质积累,同时使果实货架期延长至4周。

茶树CsWRKYIIcs转录因子的克隆及功能分析

肖罗丹, 唐磊, 王伟东, 高岳芳, 黄伊凡, 孟阳, 杨亚军, 肖斌

中国农业科学. 2020, 53(12):  2460-2476.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2020.12.013

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【目的】以‘陕茶1号’为材料,克隆CsWRKYIIcs转录因子并分析序列特征,了解其在不同组织和非生物胁迫下的表达模式以及转录活性,为深入研究茶树在逆境胁迫中的功能提供理论依据。【方法】根据茶树基因组数据库注释的WRKY序列设计特异性引物,采用RT-PCR技术从‘陕茶1号’中扩增CsWRKYIIcs的cDNA序列,用生物信息工具分析序列的特点,实时荧光定量PCR（qRT-PCR）研究基因的表达模式,用酵母试验验证其转录活性。【结果】获得9条CsWRKYIIcs的cDNA序列,开放阅读框长度分别为561、960、936、978、897、912、720、1 008和969 bp,分别编码186、319、311、325、298、303、239、335、322个氨基酸。除了CsWRKYIIc7缺少锌指序列外,其他CsWRKYIIcs均含有1个WRKY保守结构域和典型的C₂H₂型锌指结构。不同物种中的WRKYIIcs具有相似的保守基序,而茶树CsWRKYIIcs和拟南芥、葡萄等双子叶植物的WRKYIIcs氨基酸序列相似性更高。另外,CsWRKYIIcs启动子区域均预测到多个与非生物胁迫相关的顺式作用元件,意味着其可能参与非生物胁迫响应。qRT-PCR结果表明,9个CsWRKYIIcs在根和花中的表达量高于茎和叶,具有一定的特异性。同时,在干旱、ABA、高温和高盐胁迫下被不同程度的诱导表达,其中CsWRKYIIc1和CsWRKYIIc7的表达量变化显著,与推定的顺式作用元件结果相符。酵母试验表明9个茶树CsWRKYIIcs均具有转录激活活性。【结论】克隆获得9个茶树CsWRKYIIcs转录因子,它们参与了茶树对ABA、干旱、高温和高盐胁迫的响应,也可能发挥转录激活因子的调控作用。CsWRKYIIc1和CsWRKYIIc7可作为候选基因深入研究茶树的抗逆功能。

食品科学与工程

黑芝麻黑色素的分离纯化、结构表征及体外抗氧化活性

李杰,贾栩超,张瑞芬,刘磊,池建伟,黄菲,董丽红,张名位

中国农业科学. 2020, 53(12):  2477-2492.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2020.12.014

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【目的】对黑芝麻黑色素进行分离纯化,并对分离得到的不同级分进行结构表征,评价各级分的体外抗氧化活性,为黑芝麻黑色素的精细结构解析及功能活性研究提供理论依据。【方法】以黑芝麻皮为原料,通过碱提酸沉法得到黑芝麻黑色素。黑芝麻黑色素经HW-40C尺寸排阻色谱柱分离纯化,测定所得不同级分的得率、色价和黑色素含量,并采用紫外可见光谱（UV-Vis）、元素分析（EA）、傅里叶红外光谱（FT-IR）、核磁共振氢谱（¹H-NMR）和碳谱（¹³C-NMR）、X-射线光电子能谱（XPS）、电子顺磁共振（EPR）、X-射线衍射（XRD）等手段表征黑色素不同级分的结构,通过DPPH（2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl）、ABTS（2,2'-Azinobis-(3- ethylbenzthiazoline- 6-sulphonate)）自由基清除率、铁离子还原能力（ferric reducing antioxidant power,FRAP）和氧自由基吸收能力（oxygen radical absorption capacity,ORAC）评价不同级分的体外抗氧化活性。【结果】黑芝麻黑色素经过分离纯化得到黑色的Fr1和棕褐色的Fr2两个级分,得率分别为60％和24％,两个级分的分子量分别为38 800 Da和6 000 Da,Fr1的黑色素含量为782.16 mg SME?g^-1DW,Fr2的黑色素含量为884.66 mg SME·g^-1 DW。元素分析结果表明Fr1为真黑色素而Fr2可能是异黑色素;Fr1和Fr2的紫外可见吸收光谱及红外光谱显示,两个级分均含有苯环、-OH、-NH₂及-COOH等官能团结构;¹H-NMR结果表明Fr1中含有更多的脂肪氢且芳香环上的氢大多数被取代,Fr2的芳香氢含量较Fr1高;固体核磁¹³C-NMR结果表明Fr1结构中含有更多的脂肪碳和羰基,Fr2含有更多的芳香碳;XPS结果显示两个级分黑色素的官能团含量不同,C1s结果表明Fr1的C-C(H)和C=O官能团的比例高于Fr2,但C-OH/C-N和O-C=O的比例低于Fr2;N1s结果表明Fr1的C-NH官能团比例高于Fr2,但芳香N的比例低于Fr2,且Fr1不含C-NH₃⁺;O1s结果表明Fr1的C-OH官能团比例高于Fr2,但C=O官能团的比例略低于Fr2,且Fr1中不含吸收的H₂O。EPR结果显示两个级分均具有较强的顺磁共振特性,Fr1和Fr2的g值分别为2.0078和2.0085,ΔHpp分别为0.7430和0.6950 mT;X-射线衍射表明黑芝麻黑色素的两个级分均为非晶态化合物,Fr1存在平面堆叠结构。Fr1和Fr2的DPPH自由基清除的IC₅₀值分别为83.00和54.00 μg·mL^-1,ABTS自由基清除的IC₅₀值分别为53.00和30.00 μg·mL^-1。Fr1和Fr2的FRAP值分别为1.05和1.62 mmol FeE·g^-1 DW,ORAC值分别为3 141.80和4 143.76 μmol TE·g ^-1 DW。【结论】Fr1是黑芝麻黑色素的主要级分;Fr1主要是真黑色素,而Fr2可能是异黑色素。Fr1和Fr2结构中均含有羰基、羟基、氨基、芳环和氮杂环等官能团,Fr2结构芳香性较Fr1高;Fr2的DDPH和ABTS自由基清除能力、FRAP和ORAC抗氧化能力均高于Fr1。

畜牧·兽医·资源昆虫

里岔黑猪和巴里杂交猪达100 kg体重日龄校正系数研究

郑浩,涂金敏,熊秀萍,张则凯,李龙云,黄黎斌,黄智勇,肖石军,郭源梅

中国农业科学. 2020, 53(12):  2493-2501.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2020.12.015

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【目的】估计里岔黑猪及其与巴克夏杂交猪（巴里猪）达100 kg体重日龄（D100）的校正系数CF和A,并比较两种校正系数的校正效果,为里岔黑猪和其他地方猪种D100的估计提供参考。【方法】以554头里岔黑猪、941头巴里1代和755头巴里2代猪为研究对象,利用润农性能测定系统,收集它们肥育期的体重和日龄数据。根据始测日龄≥60d、始测体重≥25 kg等标准对数据进行质控,质控后的数据用于CF和A的估计。CF是两条直线斜率的比值,其中分子是体重对日龄回归直线的斜率,分母是经过终测点（终测日龄和终测体重）和原点（日龄和体重均为0）直线的斜率。A是体重对日龄一元回归方程的截距,通过拟合体重对日龄的一元回归方程直接得到。校正系数估计出来后,用方差分析来检验性别和群体对校正系数的影响,并把估计的CF和A分别代入各自的校正公式,分别计算D100,即CF和A的校正日龄（D100_CF和D100_A）。通过t检验,比较D100_CF和D100_A之间是否存在显著差异,并计算它们之间的相关系数。然后利用每个个体的体重和日龄,分别建立日龄对体重的回归方程,并根据各自的回归方程计算达100 kg体重的回归日龄（D100_reg）。通过计算D100_CF和D100_A与D100_reg之间的相关系数及其与D100_reg差值的平均数和标准差来比较CF和A的校正效果。最后用另外2个群体的校正系数来校正某个群体,计算D100_CF和D100_A与该群体D100_reg的相关系数来评估校正系数的通用性。【结果】由于性别和群体显著影响校正系数,因此需要分性别和分群体估计校正系数。里岔黑猪、巴里1代和巴里2代阉公猪（母猪）的校正系数CF分别为1.426（1.346）、1.340（1.389）和1.372（1.380）,A分别为60.65（54.15）、49.92（57.00）和54.25（57.53）。D100_CF和D100_A之间差异不显著（P = 0.3071）,它们之间的相关系数为0.9998（P<0.0001）。D100_CF和D100_A与D100_reg的相关系数均≥0.9917（P<0.0001）,它们与D100_reg差值的平均数分别为-0.1385和-0.2741d,标准差分别为2.5532和2.5446d,差异均不显著（P>0.05）。用另外2个群体的校正系数来校正某个群体,D100_CF和D100_A与该群体D100_reg的相关系数均≥0.9793（P<0.0001）。【结论】本研究估计的D100校正系数CF和A与国家生猪产业体系使用的CF和A有较大差异。CF和A的校正效果没有显著差异,在适当的结测体重范围内,它们的校正效果都非常好。在研究的3个群体中,用另外2个群体的校正系数来校正某个群体的校正效果也非常好,说明里岔黑猪D100的校正系数可以为其他地方猪种D100的估计提供参考。

饲粮能量水平对草原红牛代谢及血清指标的影响

刘基伟,张相伦,李旭,王蕾,秦立红,班志斌,吴健,张国梁,万发春

中国农业科学. 2020, 53(12):  2502-2511.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2020.12.016

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【目的】探讨饲粮不同能量水平对草原红牛气体代谢、养分消化代谢及血清指标的影响,以期为草原红牛饲养标准的制订和高效饲养提供参考依据。【方法】选用12头体重相近（365.08±2.76）kg、健康的草原红牛公牛,随机分为3组,分别饲喂增重净能为5.65（低能组）、6.05（中能组）和6.43 MJ·kg^-1（高能组）的饲粮。试验期20 d,其中,预试期18 d,正试期2 d。正试期利用“大型动物开放回流式呼吸测热装置”开展呼吸测热试验,采用全收粪尿法开展消化代谢试验,试验结束前颈静脉采集血液样本分离血清,测定血清生化指标。【结果】高能组甲烷产生量、甲烷产生量占干物质采食量比例、氧气消耗量及产热量显著高于其他组,二氧化碳产生量显著高于中能组（P<0.05）,且各项指标均随饲粮能量水平升高而线性升高（P<0.05）。能量代谢参数分析表明,各组消化能采食量、代谢能采食量、总能消化率、总能代谢率、粪能排泄量和尿能排泄量等指标均无显著差异（P>0.05）,但高能组甲烷能排放量、甲烷能占总能比值显著高于其他组（P<0.05）,且随饲粮能量水平的升高而线性升高（P<0.05）。饲粮能量水平对草原红牛氮代谢的各项指标均无显著影响（P>0.05）。饲粮能量水平对干物质、有机物、粗脂肪、中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维的表观消化率均无显著影响（P>0.05）,但干物质和有机物的表观消化率有随饲粮能量水平升高而升高的趋势（P=0.059）。高能组血清总甘油三酯水平显著高于其他两组（P<0.05）,血清尿素氮显著低于其他两组（P<0.05）,且均随饲粮能量水平升高呈线性变化（P<0.05）。其他各组间血清指标无显著差异（P>0.05）。【结论】适宜提高饲粮能量水平可提高草原红牛的养分利用率,但能量供给过高时会以甲烷能形式损失。综合来看以中能组效果最佳,推荐350 kg草原红牛适宜消化能和消化蛋白日供给量分别为128.12 MJ·d^-1、749.50 g·d^-1,代谢能和沉积蛋白日供给量分别为121.78 MJ·d^-1、678.75 g·d^-1,净能日供给量为55.96 MJ·d^-1。

微小RNA及其介导的竞争性内源RNA调控网络在意大利蜜蜂工蜂中肠发育过程中的潜在作用

杜宇,范小雪,蒋海宾,王杰,范元婵,祝智威,周丁丁,万洁琦,卢家轩,熊翠玲,郑燕珍,陈大福,郭睿

中国农业科学. 2020, 53(12):  2512-2526.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2020.12.017

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【目的】微小RNA（microRNA,miRNA）能够通过靶向结合导致mRNA的抑制或降解,从而对基因表达进行负调控。MiRNA在昆虫的生长、发育、免疫和细胞生命活动调控方面扮演关键角色。本研究旨在对意大利蜜蜂（Apis mellifera ligustica,简称意蜂）工蜂中肠的差异表达miRNA（differentially expressed miRNA,DEmiRNA)及其调控网络进行深入分析,并结合前期在mRNA、长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)和环状RNA(circular RNA,circRNA)组学层面的相关研究结果,系统解析中肠发育过程的miRNA差异表达谱及竞争性内源RNA（competing endogenous RNA,ceRNA）调控网络介导的中肠发育机理。【方法】利用small RNA-seq技术对正常的意蜂7日龄和10日龄工蜂中肠（Am7和Am10）进行测序。将质控后的测序数据比对西方蜜蜂基因组,再将比对上的序列标签（tags）比对到miRBase数据库以鉴定已知miRNA。利用每百万标签序列（tags per million,TPM）算法对miRNA表达量进行计算和归一化处理。根据|log₂fold change|≥1且P≤0.05的标准筛选得到显著性DEmiRNA;利用相关软件进行靶mRNA的预测及GO和KEGG数据库注释。根据靶向结合关系及前期研究结果,利用Cytoscape软件对AMPK、PI3K-Akt、Wnt、cAMP、Hippo、mTOR、Toll/Imd、TGF-beta和MAPK 9条信号通路相关的DElncRNA/DEcircRNA-DEmiRNA-DEmRNA网络进行可视化;构建以miR-342-y为核心的ceRNA调控网络,进一步对网络中的靶mRNA进行代谢通路注释。利用茎环实时荧光定量PCR（Stem-loop RT-qPCR）验证测序数据及miRNA差异表达的可靠性。【结果】Am7 vs Am10比较组中共有112个显著性DEmiRNA,包括38个显著上调miRNA和74个显著下调miRNA,分别靶向结合7 434和9 559个mRNA,它们可注释到生物学进程相关的21和23个功能条目,细胞组分相关的16和17个功能条目,以及分子功能相关的10和11个功能条目;此外还能注释到果糖和甘露糖代谢、嘌呤代谢、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢等物质代谢相关的83和86条通路;内吞作用、泛素蛋白水解、黑色素生成等细胞免疫相关的10和10条通路;MAPK、Jak-STAT、NF-κB等体液免疫相关的5和5条通路;以及Hippo、FoxO、Notch等涉及生长发育的13和11条信号通路。进一步构建上述9条信号通路相关的ceRNA调控网络,分析发现意蜂中肠发育过程中DEmiRNA与DElncRNA、DEcircRNA和DEmRNA之间存在复杂的调控关系;DEmiRNA位于网络中心,而DElncRNA、DEcircRNA和DEmRNA位于网络的外周。miR-342-y在意蜂工蜂中肠和幼虫肠道发育过程中均为显著性下调表达,可靶向结合3个DEcircRNA、4个DElncRNA和327个mRNA。Stem-loop RT-qPCR结果显示4个DEmiRNA的差异表达趋势与测序结果一致,说明本研究中测序数据及miRNA差异表达趋势真实可靠。【结论】DEmiRNA可能通过参与调控物质和能量代谢通路、Hippo和Wnt等信号通路以及细胞和体液免疫通路相关基因的表达影响意蜂中肠的生长和发育;miR-182-x、miR-291-y、miR-342-y、ame-miR-6001-3p等关键DEmiRNA介导的ceRNA调控网络可能在意蜂中肠发育过程发挥重要的调控作用。