中国农业科学

棉花花药全生育期均一化全长cDNA文库的构建和分析

马建辉., 刘记., 范术丽, 宋美珍, 庞朝友, 魏恒玲, 喻树迅

中国农业科学. 2013, 46(18): 3743-3749. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2013.18.001

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【目的】深入了解棉花花药发育的分子机制，并为其不育机理的研究提供参考序列。【方法】构建棉花花药全生育期的均一化全长cDNA文库并测序获得9 896条高质量的EST，利用生物信息学和荧光定量相结合法对所得数据进行系统分析。【结果】该cDNA文库库容为1.2×107，插入片段分布在1—3 kb。将所测得的高质量EST进行拼接得到6 643条unigenes，平均长度为779 bp。经过序列比对注释和生物信息学分析，得到一系列在棉花花药发育过程中起重要作用的基因，并获得28条参与花粉壁合成的基因。荧光定量结果表明，这些基因均在花药发育前期优势表达，尤其是在四分体时期表达量最高。【结论】获得大量的棉花花药表达基因，并分析得到一些调节棉花花药发育的重要途径以及参与棉花花粉壁合成相关基因。

应用ihpRNA干扰技术创制高支链淀粉马铃薯材料

刘玉汇12, 王丽3, 杨宏羽1, 余斌12, 李元铭4, 张俊莲12, 王蒂12

中国农业科学. 2013, 46(18): 3750-3757. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2013.18.002

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【目的】创造块茎高支链淀粉或纯支链淀粉含量的转基因马铃薯材料。【方法】以构建的由Patatin启动子驱动的pBI121g-PgABI为干扰表达载体，采用农杆菌介导法转化马铃薯优良品种甘农薯2号。用PCR、Southern blotting、半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR技术检测转基因植株，并对转基因植株的微型薯进行淀粉含量的测定。【结果】通过农杆菌介导法获得10个转基因株系。PCR和Southern杂交结果证明，目的基因已被整合到基因组中，通过半定量RT-PCR分析表明，转基因株系中GBSSI的表达均受到明显抑制，且在6个转基因株系中检测不到mRNA的表达。进一步通过real-time PCR分析表明，转基因株系中GBSSI的mRNA沉默效率为66.27%—93.53%；转基因株系微型薯的淀粉含量也发生明显变化，其支链淀粉含量高达90.16%—98.84%，比对照高出10.31%—20.92%。转基因株系GBSSI的mRNA沉默效率与支链淀粉含量呈显著正相关（r=0.937，P<0.01）。【结论】采用ihpRNAi技术可有效抑制马铃薯块茎中内源GBSSI表达，获得高支链或纯支链淀粉含量的马铃薯材料。

玉米叶片蛋白对AM菌根接种和（或）砷胁迫的应答

王真辉1, 袁坤1, 杨礼富1, 张俊伶2

中国农业科学. 2013, 46(18): 3758-3767. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2013.18.003

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【目的】研究接种菌根与砷胁迫条件下玉米叶片组织相关蛋白质的变化。【方法】以玉米植株叶片为材料，采用双向凝胶电泳技术（2-DE）研究玉米叶片蛋白表达谱对丛枝菌根（AM菌根）接种和（或）砷胁迫的应答。【结果】经软件分析并搜索NCBInr数据库，结果显示，砷胁迫植株叶片中有7个蛋白点被成功鉴定，其中有3个未知蛋白，其余4个分别为2-phosphoglycerate kinase、oxidoreductase、MAP3K delta-1 protein kinase和Os06g0262800。接种且加砷处理植株叶片中有11个蛋白点被成功鉴定，有4个未知蛋白，其余蛋白分别为oxygen-evolving enhancer protein 3-1、putative M protein、SNF1-related protein kinase 2.2、ATP synthase CF1 beta subunit、ATP synthase CF1 alpha subunit、pathogenesis-related protein 10、 MAP kinase kinase和MEI1 protein。【结论】菌根接种促进加砷处理玉米植株生长，并显著降低玉米植株地下部砷浓度。玉米植株叶片蛋白表达量及种类的变化，表明砷胁迫条件下菌根接种有可能激发与植物生长、养分吸收以及抗性有关的蛋白产生应答，有助于提高玉米对砷毒的抗性。

盐分条件下棉花相关生理特性的变化及水分胁迫指数模型的构建

张雷, 张国伟, 孟亚利, 陈兵林, 王友华, 周治国

中国农业科学. 2013, 46(18): 3768-3775. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2013.18.004

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【目的】构建盐土棉田棉花水分胁迫指数模型，以确定适宜的棉花水分运筹方式，为提高盐碱地棉花产量和品质提供理论依据。【方法】试验于2008—2009年在江苏南京（118°50′ E，32°02′ N）南京农业大学牌楼试验站进行，以耐盐品种中棉所44和盐敏感性品种苏棉12号为材料，将碳酸钠、重碳酸钠、氯化钠、氯化钙、氯化镁、硫酸镁、硫酸钠7种盐类等摩尔混合，按盐土比掺入基础土壤中，形成5种不同含盐水平的土壤（0：1.25 dS•m-1；0.35%：5.80 dS•m-1；0.60%：9.61 dS•m-1；0.85%：13.23 dS•m-1；1.00%：14.65 dS•m-1），研究土壤盐分对棉花功能叶含水量和温度的影响，明确棉花叶气温差与空气饱和气压差的定量关系。【结果】随土壤盐分水平的升高，棉花功能叶的蒸腾速率、含水量和净光合速率均下降，叶片温度升高。以1.25 dS•m-1盐分处理作为充分灌水（即无水分胁迫）建立了棉花水分胁迫指数模型下基线方程，以此构建了不同土壤盐分下棉花水分胁迫指数模型。【结论】综合分析不同土壤盐分水平下棉花水分胁迫指数与叶片含水量和净光合速率的关系，认为棉花水分胁迫指数模型可以很好地反映盐分条件下棉花的受胁迫程度。用棉花CWSI实时监测盐分条件下棉花的水分胁迫状况，可为盐碱地确定适宜的棉花水分运筹提供理论依据。

枯草芽孢杆菌NJ-18的质粒消解及其在小麦根部的定殖

卢靖乐, 余新燕, 侯毅平, 王建新, 周明国, 陈长军

中国农业科学. 2013, 46(18): 3776-3783. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2013.18.005

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【目的】研究从土壤中分离出来的具有广谱抗菌活性的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）菌株NJ-18与作物互作关系，并观察外源导入绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因的NJ-18菌株在小麦根部的定殖能力。【方法】首先使用十二烷基硫酸钠（SDS）消解NJ-18的质粒，然后采用化学法导入gfp分子标记，并采用激光共聚焦显微镜检测该标记菌株在小麦根部的定殖能力。【结果】获得了NJ-18的质粒消解菌株C136，并采用化学方法成功将外源基因导入野生型菌株NJ-18及其质粒消解菌株C136，C136的转化效率可达到3.42×105 cfu/μg质粒DNA，是NJ-18转化效率的10倍左右。对比NJ-18与C136的生物活性发现，C136能够保持原有的抑菌活性；但是C136的生长曲线第一峰值出现的时间滞后12 h，第一峰值被抑制了29.4%；NJ-18-GFP能够附着在病原菌菌体上，导致其菌丝呈现膨大、畸形等；接种7 d后能够在小麦根部表皮和中柱稳定定殖。【结论】枯草芽孢杆菌NJ-18菌株的转化方法宜选用化学法；该菌株能够在小麦根部定殖。

中国柑橘黄龙病病原菌两个原噬菌体超变异基因遗传多样性

谭锦12, 王雪峰2, 苏华楠12, 李中安2, 周常勇2

中国农业科学. 2013, 46(18): 3784-3792. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2013.18.006

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【目的】通过原噬菌体区域高度变异的基因位点研究柑橘黄龙病病原菌亚洲种（‘Candidatus Liberibacter asiaticus’）的种群分化，探讨病原菌种群遗传多样性水平和遗传结构。【方法】基于2种原噬菌体类型（SC1和SC2）对应的超变异基因区域设计2对引物（Lap-TJ-F/Lap-TJ-R1和Lap-TJ-F/Lap-TJ-R2），对中国不同柑橘产区的224个‘Ca. L. asiaticus’株系进行PCR检测和序列分析。【结果】PCR扩增的条带类型呈多态性，具有4种条带类型（SC1-1、SC1-2、SC2-1和SC2-2），西南地区以SC1-1型为主，广东、广西地区以SC2-1型为主，福建、江西、浙江地区没有明显优势的扩增型。分析SC1-1和SC1-2对应序列表明，其差异系由于132 bp的卫星序列和24 bp的小卫星序列2种串联重复序列数不同引起，而SC2-1和SC2-2的差异系由原噬菌体内部基因重排引起。【结论】中国不同地理来源病原菌株系在原噬菌体区域具有较丰富的多态性，对该基因区域研究将有助于揭示中国‘Ca. L. asiaticus’种群的遗传多样性。

斜纹夜蛾受翻译控制肿瘤蛋白基因的克隆及表达

卢梦玲, 闫超, 毛根林, 徐汉虹

中国农业科学. 2013, 46(18): 3793-3799. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2013.18.007

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【目的】克隆斜纹夜蛾受翻译控制肿瘤蛋白（TCTP）基因，分析其序列特征，为深入研究该基因奠定基础。【方法】利用RACE末端快速扩增技术，在斜纹夜蛾卵巢细胞中克隆TCTP基因的全长。根据不同物种间TCTP基因的同源性来构建进化树，并在原核细胞中对斜纹夜蛾TCTP进行表达。【结果】克隆得到斜纹夜蛾TCTP基因全长cDNA，登录号为HQ896486.1。序列分析表明，该基因cDNA全长829 bp，开放阅读框长519 bp，编码含172个氨基酸的蛋白，蛋白分子质量19.67 kD。生物信息学分析表明，斜纹夜蛾TCTP基因属于受翻译控制肿瘤蛋白家族，与其它物种TCTP基因有很高相似性。构建重组质粒 pET32a(+)-TCTP，在大肠杆菌中表达重组蛋白，确定了1 mmol•L-1 IPTG诱导4 h为重组蛋白表达的最佳条件，在短期内能得到大量稳定性好的TCTP蛋白。【结论】从斜纹夜蛾卵巢细胞中克隆得到斜纹夜蛾TCTP基因全长cDNA，并且成功在原核细胞中进行表达。本研究为深入研究斜纹夜蛾TCTP的功能以及针对斜纹夜蛾TCTP基因RNAi干扰的生物防控提供了理论依据和技术支持。

不同轮耕模式对黄土高原旱作麦田土壤物理性状的影响

程科1, 李军1, 毛红玲2

中国农业科学. 2013, 46(18): 3800-3808. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2013.18.008

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【目的】研究免耕、深松和翻耕两两组合而成的3种不同轮耕模式对黄土高原旱作麦田土壤物理结构与稳定性影响。【方法】于2007—2012年在陕西渭北旱塬麦田开展夏闲期免耕/深松、深松/翻耕和翻耕/免耕3种隔年交替的轮耕试验，测定土壤容重，并应用干筛和湿筛法分析土壤团聚体不同粒级含量、大小和分形维数。【结果】与耕作试验前相比，5年免耕/深松、深松/翻耕和翻耕/免耕处理在收获期0—60 cm土层土壤容重与孔隙度差异均不显著。3种轮耕处理的耕层团聚体性状变化差异显著，0—10 cm土层大于0.25 mm水稳性团聚体含量（R0.25）及稳定率表现为免耕/深松＞深松/翻耕＞翻耕/免耕；0—30 cm土层水稳性团聚体平均重量直径（mean weight diameter，MWD）大小表现为免耕/深松＞深松/翻耕＞翻耕/免耕。3种轮耕处理的团聚体分形维数（fractal dimension，D），干筛法下10—30 cm土层表现出差异，湿筛法下0—10 cm土层表现出差异，免耕/深松处理分形维数低于深松/翻耕和翻耕/免耕处理。【结论】3种轮耕模式对土壤容重的影响无显著差异。免耕/深松保护性轮耕模式能提高耕层团聚体含量与稳定性，改善旱地土壤结构；而深松/翻耕与翻耕/免耕的轮耕模式由于隔年翻耕对土壤的强烈扰动，对土壤结构改善效果不明显。

黄土丘陵区撂荒农耕地土壤有效态微量元素演变特征

张超12, 刘国彬12, 薛萐12, 肖列1

中国农业科学. 2013, 46(18): 3809-3817. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2013.18.009

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【目的】探索农耕地撂荒对土壤微量元素演变特征的影响，为该地区植被恢复中土壤质量评价和生态恢复的持续健康发展提供科学依据。【方法】以黄土丘陵区不同撂荒年限的坡耕地为研究对象，分析农耕地撂荒后不同坡向土壤4种有效态微量元素的变化趋势。【结果】黄土丘陵区坡耕地撂荒后，阴坡由于土壤温度较低，含水量较大，植被生长旺盛。有机碳、全氮、有效锰、有效铁、有效锌含量变化规律性较强，表现为在演替前期变化较小，而后期随撂荒年限的延长而显著增加，有效铜则随撂荒年限呈降低趋势。阳坡土壤有机碳、全氮及4种有效态微量元素含量则随年限呈波动变化。不同演替阶段土壤微量元素密度变化不同，阳坡土壤有效铁和有效锌密度在演替前10年明显高于阴坡，而在10年后显著低于阴坡；有效铜密度在前5年略低于阴坡，5年后明显高于阴坡。【结论】黄土丘陵区坡耕地撂荒20年后，虽然4种土壤有效态微量元素含量有所提高，但仍处于低或极低水平，因此黄土丘陵区通过自然演替来改善土壤微量元素状况还需要较长的时间。

供应铵态和硝态氮对苹果幼树生长及¹⁵N利用特性的影响

李晶, 姜远茂, 门永阁, 李洪娜, 周乐, 魏绍冲

中国农业科学. 2013, 46(18): 3818-3825. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2013.18.010

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【目的】揭示大田栽培条件下，苹果矮化中间砧幼树生长及对不同形态15N的利用、分配特性。【方法】以1年生宫藤富士/SH6/平邑甜茶幼树为试材，采用15N同位素示踪法，研究硝态氮和铵态氮对苹果幼树生长及15N利用和分配的影响。【结果】施肥46 d后，15NO3-15N利用率为3.43%，显著高于15NH4-15N利用率（1.19%）。施用NO3--N后树体生物量、根冠比显著高于NH4+-N，根系中15NO3-15N分配率为27.91%，显著高于15NH4-15N分配率（25.13%）。施肥118 d后，NO3--N肥效降低，表现为树体生物量显著低于NH4+-N处理，15NO3-15N利用率为4.08%，与15NH4-15N利用率相比差异不显著；根系15NO3-15N分配率为31.19%，显著高于根系15NH4-15N分配率（25.10%）。【结论】大田栽培条件下，硝态氮肥效快于铵态氮，利于树体生长和根冠比的迅速提高，但随着生长期的延长铵态氮与硝态氮肥效无显著差异。

缺锌胁迫对苹果叶片光合速率及叶绿素荧光特性的影响

付春霞, 张元珍, 王衍安, 范晓丹, 闫玉静, 张友朋

中国农业科学. 2013, 46(18): 3826-3833. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2013.18.011

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【目的】研究不同程度的缺锌胁迫对大田苹果树叶片的叶绿素含量、光合速率、叶绿素荧光特性等的影响，进一步揭示缺锌对叶片光系统的伤害机理。【方法】以大田盛果期‘红富士/平邑甜茶’正常树和缺锌小叶病树为试材，对叶片锌含量、叶绿素含量、净光合速率、荧光参数等指标进行测定。【结果】缺锌胁迫下，苹果叶片叶绿素含量下降，单叶面积、比叶重显著减小；气孔导度降低，胞间CO2浓度升高，净光合速率和水分利用效率下降。随缺锌程度加重，叶片初始荧光Fo上升，PSⅡ潜在活性Fv/Fo 、PSⅡ实际光化学效率ΦPSⅡ、光化学淬灭系数qP及PSⅡ天线转化效率Fv’/Fm’显著下降；J点相对可变荧光VJ和K点的相对变化Wk上升，电子传递的量子产额ETo/ABS和单位面积有活性的反应中心数量RC/CSo下降，光合性能指数PIABS显著降低。【结论】缺锌时非气孔限制是导致苹果叶片光合速率降低的原因之一；缺锌时首先引起放氧复合体（OEC）的破坏，进而使PSⅡ反应中心受损，PSⅡ供体侧、受体侧电子传递受抑制，影响叶片对光能的吸收、传递与利用。

‘富士’苹果痘斑病与Ca营养、分布和定位

董宇12, 冯云霄1, 关军锋1

中国农业科学. 2013, 46(18): 3834-3841. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2013.18.012

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【目的】研究苹果痘斑病果实和健康果实不同部位Ca、K和Mg含量及离子微区分布，分析Ca定位与痘斑病发生之间的关系，探讨果实产生痘斑病的主要原因。【方法】以‘短枝富士’苹果（Malus domestica cv. Spur Fuji）为材料，用原子吸收法测定患痘斑病果实（简称病果）与健康果实（简称健果）的顶、中、底部果皮组织中Ca、K和Mg含量。同时，用X射线能谱仪分析果皮和果肉组织中Ca、K和Mg的微区分布，并观察Ca在亚细胞水平上的分布规律。【结果】病果的果皮中Ca含量显著低于健果，而K和Mg含量与健果无显著差别。X射线微区分析证明，健果果皮中Ca和K的X射线峰值显著高于病果的，健果果肉中Ca峰值显著高于病果的，K的峰值相反，但病斑区域K峰值极高。在健果中，Ca颗粒大量存在于果皮或果肉的液泡中，且分布均匀，但在病果中，Ca颗粒分布显著减少，尤其是在病斑区域的果皮细胞中，大量Ca颗粒出现在内陷的液泡膜之外，且其细胞形状不规则，内含物减少，内部形成大小不同的囊泡。【结论】病果的果皮组织中Ca含量明显低于健果的，病斑区果肉中积累大量的K。果皮细胞内Ca外泄，液泡内Ca明显减少。这些揭示细胞内Ca参与苹果果实痘斑病的发生。

啤酒污泥堆肥不同施用方式对苹果苗生长和生理特性的影响

仝少伟1, 时连辉12, 刘登民1, 姜远茂23, 束怀瑞23, 胡雨彤1, 魏美艳1

中国农业科学. 2013, 46(18): 3842-3849. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2013.18.013

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【目的】研究啤酒污泥堆肥在苹果上的最佳施用方式及其增产机理。【方法】采用盆栽试验方法，探讨啤酒污泥堆肥与土壤混合(H)、堆肥覆盖土壤表面 (F)、混合+覆盖(HF)3种施用方式对苹果苗生长、叶片生理特性以及根系形态的影响。【结果】啤酒污泥堆肥不同施用方式均能显著促进苹果苗的生长，H与HF处理在提高苹果苗干径、苗枝径、单叶片叶面积和单株叶面积方面效果更显著；不同施用方式下叶片叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素含量、Pn均显著提高，叶绿素a/b和蒸腾速率均显著降低；啤酒污泥堆肥可增强叶片抗氧化酶活性并减少对叶片伤害，H和HF处理表现效果好于F处理；H、F和HF处理的根长、根表面积、根体积、根鲜重和根数量显著高于CK，啤酒污泥堆肥对苹果苗根有诱导和促进生长作用，以H和HF处理效果较好；H、F和HF处理的根系活力分别比CK增加了53.68%、40.50%、77.72%。【结论】在本试验条件下，啤酒污泥堆肥3种不同施用方式都能够促进苹果苗生长，改善叶片和根的各项生理指标。整体来看，HF处理综合了H、F处理的优点，是啤酒污泥堆肥较有效的施用方式。

生物炭和有机肥处理对平邑甜茶根系和土壤微生物群落功能多样性的影响

陈伟1, 周波3, 束怀瑞2

中国农业科学. 2013, 46(18): 3850-3856. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2013.18.014

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【目的】研究生物炭和生物有机肥处理对平邑甜茶根系及微生物功能多样性等指标的影响，为果园可持续发展提供参考依据。【方法】采用盆栽试验，添加生物炭和生物有机肥处理，分析不同生物炭和生物有机肥处理对植株根系、土壤微生物群落功能多样性的影响。【结果】施用生物有机肥和生物炭均可增加细吸收根量、细吸收根面积、土壤和根际可培养微生物量，提高土壤FDA酶活性和土壤微生物多样性，二者联合施用效果最佳。生物炭处理对细吸收根面积的改善效果优于生物有机肥处理，对土壤微生物多样性的改善效果则不如生物有机肥处理；10%生物肥+6%生物炭、10%生物肥+3%生物炭处理细吸收根面积分别是CK的6.6和10倍，10%生物肥处理是CK的2.5 倍，6%和3%生物炭处理是CK的3.3和3.1倍，生物炭和生物有机肥处理土壤细菌数量为CK土壤的3.32—10.23倍，放线菌数量为CK土壤的1.2—1.97倍，真菌数量为CK土壤的3.24—5.26倍，根际放线菌数量在生物有机肥处理后最高，根际真菌数量则在3%生物炭处理后最高。【结论】增加土壤炭可以增加植株根系、土壤微生物多样性，有利于土壤肥力的保持和农业的可持续发展。

基于条码-RFID关联的蔬菜流通过程追溯精确度提高方法

钱建平1, 吴晓明1, 范蓓蕾1, 杨信廷1, 孙连新2, 陈明2

中国农业科学. 2013, 46(18): 3857-3863. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2013.18.015

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【目的】解决不同包装单元的聚合与拆分导致的流通过程追溯精确度不高的问题，为实现蔬菜全程质量安全追溯体系的建立奠定基础。【方法】采用条码和无线射频识别（RFID）分别对不同包装单元进行标识，开发便携式流通信息采集系统和升级蔬菜企业信息管理系统。【结果】实现了RFID TID与小包装产品追溯号之间的关联及流通过程信息采集，从而提高流通过程追溯精度；将本方案应用于山东省某蔬菜生产企业中，通过应用测试结果表明，本方案的关键环节之一条码读取率在距离为20 cm以内，其读取率高于95%；另一关键环节关联正确率达到100%。【结论】该方法可进行实际应用以实现到单品或单批次到流通过程的追溯。

猕猴桃有机成分产地指纹特征及判别分析

马奕颜, 郭波莉, 魏益民, 赵海燕, 魏帅

中国农业科学. 2013, 46(18): 3864-3870. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2013.18.016

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【目的】分析不同地域来源猕猴桃有机成分组成特征及含量差异，各有机成分指标对猕猴桃产地来源的判别效果，探讨有机成分指纹分析技术对猕猴桃产地鉴别的可行性。【方法】检测来自陕西周至和眉县、四川沐川、湖南永顺3个主产区93份猕猴桃样品的VC、VE、可溶性固形物、总酸及总糖含量，分别对数据进行方差分析（ANOVA）、多重比较分析和判别分析。【结果】不同产地猕猴桃的有机成分指纹信息有显著差异。陕西周至和眉县猕猴桃的VC含量最高，VE、可溶性固形物及总糖含量最低；四川沐川样品的VE、可溶性固形物及总糖含量最高，总酸含量最低；湖南永顺样品的总酸含量最高，VC含量最低。利用VC、VE、可溶性固形物、总酸及总糖含量对猕猴桃产地进行判别分析，回代检验正确判别率为92.2%，交叉检验正确判别率为90.0%。【结论】不同地域来源的猕猴桃有其独特的品质特征，有机成分指纹分析是用于猕猴桃产地鉴别的一种潜在技术。

腊肉加工过程中肌原纤维蛋白结构的变化

曹锦轩1, 张玉林1, 韩敏义2, 蒋亚婷1, 潘道东1, 欧昌荣1

中国农业科学. 2013, 46(18): 3871-3877. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2013.18.017

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【目的】解析肌原纤维蛋白在腊肉加工过程中主链构象及微环境的变化。【方法】运用拉曼光谱，对酰胺Ⅰ、Ⅲ带及S-S、C-C、C-N伸缩振动谱带进行分析，比较I760、 I850/I830的强度变化。【结果】在加工过程中，肌原纤维蛋白α-螺旋的含量显著下降，β-折叠的最终含量显著增加，β-转角及无规则卷曲含量无明显变化，主链C-C的α-螺旋及C-N伸缩振动强度减弱，二硫键天然构象的谱带强度也显著下降；I760归一化强度在干腌2 d后显著降低，而后在风干过程中又显著上升，I850/I830的比值在同时期显著下降。【结论】肌原纤维蛋白的主链及二级结构在整个加工过程中发生了变化，氨基酸残基的疏水性在风干过程中得到了增强。

烟酰胺削弱罗格列酮诱导猪前体脂肪细胞凋亡的作用与分子机制

庞卫军, 许儒祥, 熊燕, 孙世铎, 杨公社

中国农业科学. 2013, 46(18): 3878-3886. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2013.18.018

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【目的】探讨烟酰胺（nicotinamide, NIC）和罗格列酮（rosiglitazone, RSG）对猪前体脂肪细胞凋亡的作用及分子机制，寻找通过凋亡方式调控脂肪细胞数目进而控制生脂的新途径。【方法】分别用含有 0、0.2、0.4、0.6、0.8 和 1.0 mmol•L-1 RSG的培养基处理猪前体脂肪细胞，在处理后的48 h，对不同处理组细胞进行Hoechst33258和Annexin-V-FITC/PI染色以观察细胞形态，流式细胞仪分析细胞凋亡情况；并收集细胞总蛋白，用Western blotting方法检测细胞凋亡关键基因的蛋白表达水平；基于RSG促凋亡的浓度梯度结果，选用1.0 mmol•L-1 RSG分别与含0、0.1、0.2和0.3 mmol•L-1 NIC的培养基共处理细胞，在处理后的48 h，染色并观察细胞形态，流式细胞仪分析细胞凋亡情况；并收集细胞总蛋白、细胞质蛋白和细胞核蛋白，检测细胞凋亡关键基因的蛋白水平。【结果】 RSG以浓度依赖方式诱导猪前体脂肪细胞凋亡，减少了细胞数目；Bcl-2和cleaved Caspase-3凋亡关键蛋白水平随RSG浓度增加而上升，Bax则下降；0.1（P＜0.05）、0.2（P＜0.01）和0.3 mmol•L-1 （P＜0.01）NIC显著削弱1 mmol•L-1 RSG诱导猪前体脂肪细胞凋亡，Bcl-2和cleaved Caspase-3水平显著被下调（P＜0.05），Bax则被上调（P＜0.05）；0.3 mmol•L-1 NIC明显有助于1 mmol•L-1 RSG处理的猪前体脂肪细胞中的Sirt1由细胞质向核转移，且抑制核中cleaved Caspase-3水平。【结论】NIC通过促进Sirt1由细胞质到核的转位以及下调核中cleaved Caspase-3水平削弱RSG诱导的猪前体脂肪细胞凋亡。

父源性印记基因在牛早期胚胎中的表达

张春强, 赵德超, 韩志玲, 张文广, 张家新

中国农业科学. 2013, 46(18): 3887-3893. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2013.18.019

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【目的】研究父源印记基因在牛早期胚胎中的表达模式。【方法】利用Real-time PCR技术，检测Gnas、Grb10和Xist这3个父源性印记基因在牛体外受精（In vitro Fertilization，IVF）和孤雌激活（Parthenogenetic Activation，PA）胚胎各发育阶段的表达情况。【结果】对于IVF和PA两种来源的牛胚胎，Gnas在胚胎各发育阶段的表达没有明显差异；Grb10在2细胞阶段的PA胚胎中的表达量明显高于在IVF胚胎的，但从4细胞阶段到囊胚阶段，Grb10在两种来源的牛胚胎中表达没有明显差异；从2细胞阶段到8细胞阶段，Xist在两种来源的牛胚胎中表达没有明显差异，但从16细胞期开始，Xist在PA胚胎中的表达明显高于IVF胚胎的表达量。【结论】对于牛IVF胚胎和PA胚胎，Gnas、Grb10和Xist从2细胞期到囊胚期都可以检测到表达，但表达模式不同。这3个父源性印记基因在牛胚胎发育过程中可能发挥着重要的作用。

西门塔尔牛肌内和皮下脂肪miRNA表达谱及miR-27b靶基因分析

汪海洋, 郑月, 李惠侠, 韩兆玉, 王根林

中国农业科学. 2013, 46(18): 3894-3900. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2013.18.020

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【目的】通过分析西门塔尔牛肌内脂肪和皮下脂肪差异表达miRNA，及对重要的候选miRNA-27b进行靶基因预测及相关生物信息学分析，探索miRNA在动物肌内脂肪生长、发育过程中的作用及其调控机制。【方法】利用miRNA微阵列芯片技术对肌内脂肪和皮下脂肪miRNA表达谱进行检测和分析以筛选差异表达miRNA；qRT-PCR方法验证4个在肌内脂肪显著高表达的候选miRNAs；采用Targetscan生物信息学计算方法预测目标miR-27b（对肌内脂肪沉积可能起重要调节作用）的靶基因，并对靶基因进行GO注释描述、富集分析及KEGG富集。【结果】miRNA芯片分析发现肌内脂肪和皮下脂肪共有88个差异表达极显著miRNA（P＜0.01）。候选的4个在肌内脂肪高表达miRNAs（miR-140、miR-145、miR-143、miR-27b）的qRT-PCR检测结果与芯片分析结果具有很好的一致性。KEGG富集显示，目标miR-27b的预测靶基因在MAPK、Wnt、Hedgehog、TGF-beta、GnRH等信号通路中显著富集，其中在MAPK信号通路中富集度最高。【结论】牛肌内脂肪和皮下脂肪组织中确实存在一些差异表达的miRNAs，某些重要的在差异高表达miRNA（如miR-27b）可能以独特的通路（如MAPK信号）来调节牛肌内脂肪的形成过程。

陕西省avian-like H1N1猪流感病毒的遗传进化分析

任娟娟, 王晶钰, 刘红彦, 刘万华, 武宁, 邱渊皓, 唐攀, 江跃德

中国农业科学. 2013, 46(18): 3901-3913. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2013.18.021

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【目的】监测陕西省猪流感的流行与传播情况，为猪流感研究提供参考。【方法】从生猪养殖场和屠宰场表观健康猪中随机采取猪鼻/气管拭子样本，经SPF鸡胚分离，对HA阳性样本进行猪流感病毒RT-PCR鉴定。测定分离株全基因序列，通过MEGA4构建基因进化树，并进行遗传变异分析。【结果】从500份样本中分离鉴定出6株H1N1流感病毒，病毒分离率为1.2%。获得6个核苷酸相似性为98.3%—99.1%的分离株全基因序列。遗传进化分析表明6个分离株都位于avain-like H1N1猪流感病毒谱系，与中国江苏，辽宁，山东和香港等地H1N1猪流感病毒株同源性达97%—99%。6个分离株的8个基因片段均在蛋白受体结合位点、潜在糖基化位点等处发生核苷酸变异，这将会影响猪流感病毒的抗原特性、宿主适应性和致病力。【结论】首次从西北地区表观健康猪中分离到H1N1猪流感病毒，并获得6个分离株的全基因序列。遗传进化分析表明，6个分离株为avain-like H1N1猪流感病毒, 且多处氨基酸位点发生变异。

甘草酸二钾体外诱导感染MDV鸡胚成纤维细胞凋亡发挥抗病毒作用

丛向明1, 牛丽1, 白喜云1, 武彩红2, 孙耀贵1, 贺俊平1, 白元生3, 李宏全1

中国农业科学. 2013, 46(18): 3914-3921. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2013.18.022

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【目的】探讨甘草酸二钾体外抗MDV的活性及作用机制。【方法】在体外以鸡胚成纤维细胞为MDV增殖模型，利用MTT比色法、噬斑减少法通过抗病毒试验、病毒复制抑制试验、直接灭活试验来评价甘草酸二钾的抗病毒效果；并通过细胞凋亡试验解释其抗病毒机制。【结果】抗病毒试验结果表明，在安全浓度范围内,甘草酸二钾在体外具有较强的抗MDV的活性，其EC50为（893.5±36.99）µg•mL-1，SI>3.36，最大抑制率达94.4%；在病毒复制抑制试验中，甘草酸二钾可以抑制病毒复制的整个过程；病毒直接灭活试验表明甘草酸二钾可直接杀灭病毒粒子且不呈时间依赖性；细胞凋亡试验结果显示甘草酸二钾能够诱导感染MDV的鸡胚成纤维细胞凋亡。【结论】甘草酸二钾在体外具有抗MDV的活性，可以通过诱导感染病毒的鸡胚成纤维细胞凋亡发挥抗病毒作用。

家蚕丝腺生物反应器表达狂犬病病毒核蛋白

尤征英1, 危浩13, 阮系真2, 叶露鹏1, 王少华1, 周继勇2, 钟伯雄1

中国农业科学. 2013, 46(18): 3922-3929. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2013.18.023

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【目的】采用家蚕丝腺生物反应器这一蛋白高效表达系统，尝试建立一种高效、低廉、稳定生产狂犬病病毒核蛋白（RVNP）的技术体系，为生产基因工程疫苗奠定基础。【方法】通过RT-PCR方法克隆获得RVNP序列，采用家蚕丝胶蛋白基因（Ser1）启动子为特异性启动子，将RVNP构建到含有增强型绿色荧光蛋白（EGFP）筛选标记基因的piggyBac转座子表达载体（pBA3EGFP）中，并采用显微注射转基因家蚕技术构建家蚕丝腺生物反应器。【结果】G1代通过EGFP标记的筛选获得转基因家蚕阳性蛾区26个，蛾圈阳性率为59.09%。PCR实验证实RVNP已经整合到家蚕基因组中，Western blot分析表明RVNP蛋白可能附着于丝胶蛋白并随家蚕吐丝行为分泌到蚕茧中。【结论】获得了能够表达外源的RVNP蛋白的转基因家蚕品系，该系统有望成为高效、低廉、稳定地生产狂犬病基因工程疫苗的技术体系之一。

黄淮小麦农艺性状演变趋势

吴秀亭12, 张正斌1, 徐萍1, 齐亚娟12, 王玉莹3, 何秀平3, 高辉明3

中国农业科学. 2013, 46(18): 3930-3938. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2013.18.024

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【目的】通过对黄淮小麦品种农艺性状演变趋势分析，研究黄淮小麦适应气候变化自然选择和人工高产育种选择的规律。【方法】记载二倍体、四倍体、六倍体小麦进化材料和现代小麦品种不同生育期的农艺性状，收获后测定产量性状。【结果】小麦在进化过程中，分蘖和叶片数有减少的趋势。二倍体→四倍体→六倍体野生种，株高有增加的趋势；从六倍体野生小麦到现代小麦，株高和生物学产量又有明显降低的趋势。单株总叶面积在返青—抽穗期是二倍体＜四倍体＜六倍体＜农家种＜现代品种，在开花期—灌浆期是六倍体＞四倍体＞农家种和现代品种＞二倍体，表现相反趋势。小麦单株生物学产量有降低的趋势，籽粒产量和收获指数有增加的趋势。【结论】野生种具有适应低温和生长缓慢的野生生长方式和遗传特性，现代品种适应气候变暖而提早成熟，减少分蘖，避免旺长遭遇冷害，后期叶片将更多的干物质转运到籽粒。

甘薯褪绿矮化病毒西非株系RT-LAMP检测方法的建立

乔奇, 张振臣, 秦艳红, 张德胜, 田雨婷, 王爽, 王永江

中国农业科学. 2013, 46(18): 3939-3945. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2013.18.025

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【目的】基于逆转录环介导等温扩增技术（Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification，RT-LAMP）建立甘薯褪绿矮化病毒（Sweet potato chlorotic stunt virus，SPCSV）西非株系（West African，WA）的可视化检测方法。【方法】针对SPCSV西非株系（SPCSV-WA）的CP核苷酸序列设计4条引物，以感染SPCSV-WA甘薯叶片总RNA为模板，进行一步法RT-LAMP，在65℃条件下反应1 h。扩增产物利用琼脂糖电泳分析和SYBR green I荧光染料显色判断结果，同时对扩增产物的电泳条带进行基因克隆和测序鉴定。利用常规RT-PCR和建立的RT-LAMP方法对14份甘薯样品进行SPCSV-WA检测，比较2种方法的检测结果。【结果】建立的LAMP方法可特异地对SPCSV-WA进行检测，且最低可检测出101拷贝/µL的模板。RT-LAMP产物的克隆测序表明，感染SPCSV-WA甘薯样品的RT-LAMP产物为SPCSV-WA CP基因序列。14份田间甘薯样品检测表明，RT-LAMP与RT-PCR方法检测结果完全一致。【结论】建立的SPCSV-WA RT-LAMP可视化检测方法，是简便、可靠的SPCSV-WA检测方法。

崂山奶山羊LEP和STAT5a基因对泌乳和生长性状的影响

刘园峰1, 王桂芝1, 李秋梅2, 曹海洋1, 皮秀霜1, 王建民1

中国农业科学. 2013, 46(18): 3946-3954. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2013.18.026

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【目的】探讨JAK-STAT通路中瘦素（Leptin，LEP）和信号转导子和转录激活子5a（signal transducers and activators of transcription，STAT5a）基因在崂山奶山羊群体中的遗传变异、交互作用及与生产性状的关联性。【方法】以174只崂山奶山羊泌乳母羊为实验群体，其中89只来自种羊场，有完整的产奶量记录；85只来自育种户。利用DNA混池测序和候选基因直接测序技术检测LEP基因外显子2、外显子3和STAT5a基因外显子10、外显子16在该群体中的多态性，并采用最小二乘法分析了多态性位点与乳成分、校正产奶量、生长性状的关联效应。【结果】在所研究的群体中，LEP基因外显子2、3和STAT5a基因外显子10、16上均不存在多态性。LEP基因内含子2上存在一个A→G 的单核苷酸替换，对于泌乳和生长性状而言，模型和场别效应均达到显著水平，该位点对育种场中校正产奶量和尻宽、育种户中体高有显著(P＜0.05)或极显著(P＜0.01)影响；STAT5a基因内含子9上存在A→G 的单核苷酸替换和T→C 的单核苷酸替换，这两个突变为连锁突变，对泌乳性状没有显著影响(P＞0.05)，对整个群体体长和胸围有显著(P＜0.05)影响，对育种户胸围有极显著(P＜0.01)影响。【结论】在崂山奶山羊中发现候选基因LEP和STAT5a存在多态性，相互之间没有交互作用，L393位点对育种场中校正产奶量和尻宽、育种户中体高有显著效应，S163/S206位点对整个群体的体重、体长和胸围，对育种户胸围有显著效应。因此，LEP和STAT5a基因可以作为崂山奶山羊产奶量及部分生长性状的遗传标记。

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