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兰州大尾羊PPARG全长cDNA克隆及生物信息学分析
- 金方园1, 徐红伟2, 达小强1, 柏家林1, 冯玉兰1, 臧荣鑫1, 杨具田1
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中国农业科学. 2014, 47(12):
2435-2445.
doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.12.016
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【目的】克隆兰州大尾羊过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator-activated receptor gamma, PPARG)基因,分析其序列及编码蛋白的生物学特性,阐明PPARG基因在绵羊中的生物学作用,为生产应用提供理论依据。【方法】根据绵羊PPARG基因CDS序列设计特异性引物,利用RACE和RT-PCR技术克隆获得兰州大尾羊PPARG基因序列,结合生物信息学方法分析其生物学特性。【结果】克隆获得兰州大尾羊PPARG cDNA 序列全长1 774 bp(GenBank序列号:KF727439),其CDS区片段长1 428 bp,编码475个氨基酸,编码区两侧翼分别具有5’-UTR 131 bp(1-131 nt)和3’-UTR 214 bp(1 560-1 774 nt)。预测兰州大尾羊PPARG蛋白分子量为54.40 kD,理论等电点为4.94。预测PPARG编码蛋白疏水性最大值为3.600,最小值为-2.744,为非跨膜的疏水性蛋白。亚细胞定位主要在细胞质(65.2%)和细胞核(21.7%)中,少量作用于细胞支架(4.3%)和过氧化物酶体(4.3%),无信号肽,不属于分泌蛋白。预测其氨基酸序列有26个磷酸化位点,无糖基化位点,含有1个ZnF_C4结构域、1个HOLI结构域和1个LCR结构域,二级结构以随机卷曲为主。同源性分析显示兰州大尾羊PPARG核苷酸序列与山羊、野牛、水牛、绵羊、虎鲸、野猪和人类核苷酸序列间的同源性分别为99% 、98% 、97% 、99%、 94%、92%和90%,兰州大尾羊PPARG氨基酸序列与山羊、野牛、水牛、绵羊、虎鲸、野猪和人类核苷酸序列间的同源性分别为100% 、99.8% 、100% 、100%、 98.7%、98.5%和97.5%。系统发育树表明,兰州大尾羊与山羊、绵羊和水牛的进化水平更为接近,与鱼类、人类和鼠类较远。其基因第486位发生碱基转换(C←→T),第828位发生碱基转换(C←→A),但其所编码氨基酸不变。【结论】兰州大尾羊与其他物种PPARG在结构上相似性较高,说明该基因具有高度的保守性。推测PPARG蛋白大部分在游离核糖体上合成,其功能与过氧化物酶体有关,该预测结果符合其过氧化物酶体增殖物激活受体的身份。PPARG氨基酸序列有26个可以成为蛋白质激酶磷酸化的位点,某些位点被磷酸化后,可导致一系列肥胖相关基因的功能失调和表达变化, 如胰岛素增敏激素,脂联素( adiponectin)的表达减少。其序列包含的ZnF_C4锌指结构域具有与脂质结合的功能,HOLI即LBD配体结构域在激素信号转导过程中发挥重要作用,其中PPARG锌指结构域中的磷酸化位点Ser112,被MAPK磷酸化后,可以抑制PPARG同配体的结合,从而降低PPARG蛋白的活性,两个结构域均与成脂分化过程相关联。文章为进一步研究PPARG在成脂分化过程中的作用提供了参考。