中国农业科学

黄淮麦区部分小麦种质脂肪氧化酶活性分析及等位基因检测

吴培培，宋双，张福彦，陈锋，崔党群

中国农业科学. 2015, 48(2): 207-214. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.02.01

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【目的】小麦中的脂肪氧化酶（LOX）是影响小麦面粉颜色和其储藏特性的主要因素之一，对中国黄淮麦区的306份小麦种质资源进行脂肪氧化酶活性分析及等位基因检测，为小麦品质育种提供理论参考。【方法】利用紫外分光光度计和酶标仪测定参试样品的脂肪氧化酶（LOX）活性，并利用控制脂肪氧化酶活性的位于1AL上的QLpx.caas-1AL位点紧密连锁的分子标记Xwmc312以及位于4BS上的TaLOX-B1位点的功能标记LOX16和LOX18，采用特异引物的PCR扩增技术以及琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳分离技术进行参试材料的LOX基因型鉴定。【结果】表型测定结果表明，参试的黄淮麦区小麦品种（系）中脂肪氧化酶活性的平均值为65.73 AU·min^-1·g^-1，标准差为13.54，变幅为27.09—99.55 AU·min^-1·g^-1，变异系数为20.6%。参试材料中小于40 AU·min^-1·g^-1和大于90 AU·min^-1·g^-1的小麦品种（系）分别为7个和8个，可作为对当前主栽小麦品种进行脂肪氧化酶活性改良的重要资源材料。基因型鉴定结果表明，参试材料的QLpx.caas-1AL位点存在3种等位变异类型，Xwmc312₂₂₇、Xwmc312₂₃₅和Xwmc312₂₄₇所占比例分别为30.4%、18.9%和50.6%。参试材料的TaLOX-B1位点存在TaLOX-B1a和TaLOX-B1b两种变异类型，所占比例分别为 28.7%和71.2%。分析其基因型组合发现，参试材料中共有6种基因型组合类型，依次为TaLOX-B1a/Xwmc312₂₂₇、TaLOX-B1a/Xwmc312₂₃₅、TaLOX-B1a/Xwmc312₂₄₇、TaLOX-B1b/Xwmc312₂₂₇、TaLOX-B1b/Xwmc312₂₃₅和TaLOX-B1b/Xwmc312₂₄₇，所占比例分别为7.2%、9.5%、12.1%、23.2%、9.5%和38.6%。分析不同LOX基因型与脂肪氧化酶活性的关系表明，1AL位点上拥有Xwmc312₂₃₅基因型的小麦品种脂肪氧化酶活性显著高于其他两种基因型（P＜0.05），4BS位点拥有TaLOX-B1a基因型的小麦品种脂肪氧化酶活性显著高于拥有TaLOX-B1b基因型的小麦品种（P＜0.05）。进一步分析不同LOX基因型组合与脂肪氧化酶活性的关系表明，拥有TaLOX-B1a/Xwmc312₂₃₅基因型组合的小麦品种脂肪氧化酶活性（76.80 AU·min^-1·g^-1）显著高于其他5种基因型组合，而拥有TaLOX-B1b/Xwmc312₂₂₇基因型组合的小麦品种脂肪氧化酶活性显著低于其他5种基因型组合，仅为62.44 AU·min^-1·g^-1。【结论】中国黄淮麦区的小麦品种脂肪氧化酶活性绝大多数处于中间类型，拥有极低（小于40 AU·min^-1·g^-1）或极高（大于90 AU·min^-1·g^-1）脂肪氧化酶活性类型的小麦品种所占比例较低。黄淮麦区所发现的6种不同LOX基因型组合中，拥有TaLOX-B1a/Xwmc312₂₃₅基因型组合的小麦品种脂肪氧化酶活性相对较高（P＜0.05），而拥有TaLOX-B1b/Xwmc312₂₂₇基因型组合的小麦品种脂肪氧化酶活性相对较低（P＜0.05）。

兼抗虫、除草剂、干旱转基因玉米的获得和鉴定

孙越，刘秀霞，李丽莉，官赟赟，张举仁

中国农业科学. 2015, 48(2): 215-228. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.02.02

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【目的】培育抗玉米螟、抗草甘膦、抗旱的转基因复合性状玉米种质。【方法】通过农杆菌介导的玉米茎尖遗传转化法，把重组到同一植物表达载体的cry1AcM、epsps、GAT和ZmPIS转入玉米骨干自交系9801和齐319（Q319），获得转基因植株。通过逐代除草剂筛选、分子检测和抗虫性鉴定，从大量转基因株系中优选出6个优良玉米株系。在此基础上，以非转基因自交系9801、Q319为对照，在严格控制条件下对6个转基因株系进行抗虫、抗除草剂和抗旱性检测。由于不同生长时期植株对玉米螟危害的敏感程度有差异，在抗虫性检测试验中，对不同生长阶段的转基因玉米的抗虫性，分别进行了田间和室内玉米螟接种试验，并以灌浆期玉米的籽粒和苞叶饲喂玉米螟幼虫检测其杀虫性。在草甘膦抗性鉴定试验中，对6叶期田间玉米植株喷洒大田除草用量的草甘膦溶液评估其应用价值；采用3倍应用剂量的草甘膦溶液喷施3叶期玉米植株测试其草甘膦耐受力。在抗旱性鉴定试验中，对10叶期玉米植株进行干旱胁迫处理，观测转基因植株的表型变化并测定光合作用和叶绿素荧光等参数。【结果】选择出6个遗传稳定的兼抗亚洲玉米螟、抗草甘膦和抗旱性提高的转基因玉米株系，其中株系L1—L3来自自交系9801，Q1—Q3来自自交系Q319。通过RT-PCR检测4个转基因的转录强度，证明它们在转基因植株中有效表达；利用Western blot方法检测cry1Ac蛋白的表达水平，确定其在玉米植株中稳定表达。植株抗虫性鉴定结果显示这6个株系在玉米营养生长期和灌浆期的抗虫能力均显著高于未转基因自交系。在草甘膦抗性测试中，转基因植株表现出明显高于未转基因自交系的草甘膦抗性。在干旱控水期间，转基因植株能维持较强的光合能力和光系统Ⅱ活性，对干旱胁迫的抗性显著高于对照植株。【结论】将cry1AcM、epsps、GAT、ZmPIS一同转入玉米，赋予了植株抗玉米螟、抗除草剂草甘膦特性，提高了植株的抗旱性，达到生产中应用标准。培育出具有优良复合性状的转基因玉米新材料。

木质素与生物燃料生产：降低含量或解除束缚？

王晓娟，杨阳，张晓强，姜少俊，宋瑜，周海辰，金樑

中国农业科学. 2015, 48(2): 229-240. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.02.03

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生物质能源作为可再生性替代能源之一，其开发利用可为解决当前全球变暖、化石能源成本飞涨和环境污染等重大问题提供新的途径。木质纤维素是植物细胞壁的主要组成成分，也是地球上最丰富的可再生资源之一，可转化为生物酒精等液体生物燃料。木质纤维素主要包括纤维素、半纤维素和木质素，三者之间由酯键、醚键和糖苷键等化学键连接，形成的木质素-糖类复合体是一种共价键聚合物，这些细胞壁成分的组成及其互作会影响多糖的水解作用，进而影响木质纤维素的转化利用效率，其中，木质素被认为是阻碍纤维素酶分解的主要物理障碍。当前，提高能源作物生物质的田间种植、生产效率及其工厂化降解、转化效率是生物质能源发展的热点和难点问题。由于木质素是木质纤维素生物量中除多糖之外含量最高的成分之一，提高木质素利用效率成为影响整个木质纤维素生物冶炼产能的关键。为此，文中从降低木质素含量和解除木质素束缚的角度出发，系统回顾了木质素在植物细胞壁中的发育沉积特征及其遗传改造研究进展，探究从植物细胞壁结构组成角度优化木质纤维素性状提高生物燃料产率的可能性，重点论述了降低能源植物木质素含量的遗传选育和基因改良策略，以及木质纤维素生物冶炼的预处理和分离技术。一方面，通过常规育种程序培育低木质素含量的生物能源作物品种，或是通过基因工程技术下调木质素的生物合成，对于提高木质纤维素利用效率和降低生物燃料生产成本均具有积极的作用。另一方面，以解除木质素束缚为目的的生物冶炼预处理技术是提高木质纤维素生物燃料工厂化生产效率的重要环节，主要包括酸预处理法、碱预处理法和有机溶剂预处理法，高效的预处理技术能够显著提高纤维素酶水解效率，增加生物酒精产量。文中最后对木质素与生物燃料生产的研究与应用前景进行了展望。

外源四价硒条件下硫对小麦硒吸收的影响机制

刘新伟，段碧辉，赵小虎，郭再华，胡承孝，赵竹青

中国农业科学. 2015, 48(2): 241-250. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.02.04

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【目的】研究硫肥对外源四价硒条件下土壤硒赋存形态和价态变化的影响，旨在揭示硫调控小麦硒吸收的作用机制。【方法】以郑麦9023为试验材料，通过苗期土培和水培进行，土培试验设3个硫水平，分别为0、150和300 mg·kg^-1，硫源为硫磺，2个硒水平，分别为0和5 mg·kg^-1，硒源为亚硒酸钠，生长至70 d收获并取土样；水培试验先将幼苗在1/5 Hogland-Arnon营养液中培养2周，然后开始进行处理，设3个硫水平，分别为0、1和2 mmol·L^-1，硫源为硫酸镁，硒水平为10 µmol·L^-1，2种硒源，分别为亚硒酸钠和硒酸钠，培养24 h后收获，土培和水培试验均为完全交互设计，重复4次，采用HG-AFS-8220型双道原子荧光光度计对小麦地上部和根以及土壤中硒含量进行测定，根据与植物硒吸收的相关性，将土壤总硒分成不同赋存形态和价态。【结果】施用适量硒和硫对小麦生长均有一定的促进作用；150 mg·kg^-1硫可以显著降低小麦地上部和根中硒含量和硒累积量，降幅分别可达61.7 %、34.4%和55.7%、24.7%，但是这种降低不会随施硫量的增加而显著变化；施硫可以显著降低土壤pH值，最高可降低0.50个单位，并增加了土壤有机质含量，最高可增加0.78 g·kg^-1。施硫可以显著降低土壤中水溶态硒含量，并显著增加铁锰氧化物结合态硒含量，也增加了有机结合态和残渣态硒含量，而对交换态硒含量无显著影响，表明施硫促使了硒在土壤中的钝化。施硫可以显著降低水溶态中各种价态硒含量，其降幅基本一致，施硫可以增加交换态中四价硒含量而显著减少六价硒含量，表明施硫抑制了硒在土壤中向高效价态的转化。小麦对四价硒和六价硒的吸收差异与是否施硫密切相关，无硫时，六价硒处理下小麦地上部和根中硒含量分别为四价硒处理的44.7和22.4倍，而硫浓度为1 mmol·L^-1时，其硒含量迅速降为四价硒处理的2.8倍和51.8%，表明硫可以显著缩小小麦对四价和六价硒的吸收能力差异。【结论】施用适量硫肥在改善小麦生长的同时，可以通过降低土壤pH和提高有机质含量，促使水溶态硒在土壤中向铁锰氧化物结合态、有机结合态及残渣态的钝化，并抑制交换态中四价硒向六价态的转化，从而降低小麦对硒的吸收。因此，可以通过在高硒缺硫地区增施硫肥以及缺硒高硫地区减施硫肥来有效调控作物体内的硒含量

海岛棉和陆地棉叶片光合特性、冠层结构及物质生产的差异

姚贺盛，张亚黎，易小平，薛军，罗毅，罗宏海，张旺锋

中国农业科学. 2015, 48(2): 251-261. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.02.05

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【目的】探讨海岛棉和陆地棉两个棉花栽培种群体物质生产存在差异的原因，揭示海岛棉和陆地棉产量形成的机理，为选育高光效棉花品种和高产高效栽培提供理论依据。【方法】在新疆气候生态条件下，选用能适应北疆棉区的海岛棉品种（系）（新海22号、H858）和陆地棉主栽品种（新陆早13号、新陆早33号）为试验材料，分别测定不同棉花品种（系）叶片的叶绿素含量、叶面积指数、冠层开度、叶片向日性运动、群体光合速率和生物量等指标，探讨海岛棉和陆地棉两个栽培种间群体冠层结构、叶片光合组分和光合生产特性等的差异。【结果】陆地棉品种冠层上部叶片数量多，叶面积指数大，冠层开度小，上部叶片光截获量占冠层光截获总量的比例大，冠层中下部光截获量少；海岛棉品种冠层上部叶片少，叶面积指数小，冠层开度大，截获的光占冠层光截获总量的比例小；海岛棉品种群体光合速率均比陆地棉高；两个棉花栽培种光合物质生产能力存在显著差异，海岛棉光合产物总量多，但生殖器官占总光合产物的比例显著低于陆地棉；海岛棉和陆地棉产量构成因子及皮棉产量差异显著，陆地棉单位面积总铃数约为1.30×10⁶个/hm²，皮棉产量为3 000—3 500 kg·hm^-2，海岛棉虽然单位面积铃数显著大于陆地棉，达到1.54×10⁶个/hm²左右，但单铃重远低于陆地棉，皮棉产量仅1 500 kg·hm^-2左右；在棉铃空间分布上，海岛棉棉铃主要分布在冠层中下部，而陆地棉棉铃在冠层中上部的分布比例大。【结论】与海岛棉相比，陆地棉总光合产物低，但经济系数高，籽棉产量高，通过改善陆地棉冠层结构，延长群体光合功能期，提高光合产物累积量，有利于陆地棉产量的进一步提高；与陆地棉相比，海岛棉冠层光能利用率高，群体光合速率高，光合物质生产潜力大，但单铃重低，总铃库较小，且铃库与光合源比例失衡，光合产物转运效率低，经济系数小，产量较低。选育大铃、早熟性好的海岛棉品种，并适当增大种植密度，可能是海岛棉增产的技术途径。

加工型马铃薯品种微型薯种薯贮藏期内源激素含量、阈值和休眠期相关性分析

刘悦善，李成，王东霞，徐刚，王玉萍，程李香，张俊莲，王蒂，张峰

中国农业科学. 2015, 48(2): 262-269. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.02.06

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【目的】加工型马铃薯微型薯作为生产高质量脱毒原种用种薯，其休眠持续时间和发芽时间有着重要的经济意义。探究加工型马铃薯微型薯种薯在不同贮藏温度下，随着贮藏时间延长，微型薯中内源激素含量与其休眠期的关系，可为加工型马铃薯微型薯种薯的高质量贮藏提供理论依据。【方法】采用高效液相色谱（HPLC）法，测定微型薯在3种不同贮藏温度（4℃、10℃、20℃）下连续贮藏150 d，其内源赤霉素（GA₃）、吲哚-3-乙酸（IAA）和脱落酸（ABA）的含量，分析不同贮藏时间和温度下内源激素含量变化对微型薯休眠解除程度影响，并根据内源激素水平动态变化进行激素与休眠的相关性推导。【结果】在整个贮藏期（150 d）间，随着贮藏温度提高，两个品种夏波蒂和大西洋休眠解除时间显著缩短，在4℃贮藏150 d后，两个品种休眠均未完全解除，在10℃和20℃贮藏条件下，大西洋比夏波蒂休眠解除早15 d左右。在整个贮藏期（150 d）间，随着贮藏时间延长和贮藏温度提高，GA₃含量显著上升，在10℃贮藏150 d时，大西洋和夏波蒂中GA₃含量分别是4℃贮藏条件下的1.7和1.9倍，在20℃贮藏150 d时，大西洋和夏波蒂中GA₃含量分别是4℃贮藏条件下的1.9和2.0倍。IAA含量在贮藏后期（90—150 d）显著上升，在10℃贮藏150 d时，大西洋和夏波蒂中IAA含量分别是4℃贮藏条件下的1.5和1.2倍，在20℃贮藏150 d时，大西洋和夏波蒂中IAA含量分别是4℃贮藏条件下的1.9和1.5倍。ABA含量显著下降，在4℃贮藏150 d时，大西洋和夏波蒂中ABA含量是10℃贮藏条件下的7.2和6.4倍。在整个贮藏期（150 d）间，（GA₃+IAA）/ABA比值显著提高。对（GA₃+IAA）/ABA比值与种薯发芽率相关性分析表明，（GA₃+IAA）/ABA比值与种薯发芽率呈极显著线性正相关。根据（GA₃+IAA）/ABA比值与种薯发芽率之间的线性关系推断出夏波蒂和大西洋休眠解除时，（GA₃+IAA）/ABA临界阈值分别为52.02和48.49。当（GA₃+IAA）/ABA比值超过临界阈值后，微型薯种薯的发芽率超过50%，休眠解除。【结论】微型薯中内源激素GA₃、IAA和ABA含量动态平衡变化以及发芽率明显受贮藏时间和贮藏温度影响。通过对块茎内源激素比值和发芽率的相关性分析获得（GA₃+IAA）/ABA临界阈值计算方法和范围，为加工型马铃薯种薯贮藏精准控制提供了理论依据和技术参数。

PVY^NTN-NW榆林分离物的全基因组序列测定与分析

高芳銮，常飞，沈建国，谢联辉，詹家绥

中国农业科学. 2015, 48(2): 270-279. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.02.07

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【目的】马铃薯Y病毒（Potato virus Y，PVY）是马铃薯病毒科（Potyviridae）马铃薯Y病毒属（Potyvirus）代表成员，是马铃薯和烟草生产中分布最为广泛并造成严重经济损失的病毒之一。研究旨在揭示PVY榆林分离物ShX14的全基因组特征，并准确判断其株系分子类型。【方法】根据已经报道的PVY不同基因保守区设计11对简并引物，采用片段重叠法从感染 PVY的马铃薯病叶中扩增、克隆获得榆林分离物ShX14的全长序列，并对其序列特征、重组位点、系统发育关系等进行分析。同时，应用系统发育与性状关联分析（phylogeny-trait association analysis）评估PVY分离物与株系的关联性。【结果】测序获得的ShX14分离物核苷酸序列全长为9 724 nt（不含3′端的多聚腺苷酸尾）。该病毒基因组含有一个9 186 nt的开放阅读框，编码3 061个氨基酸的多聚蛋白（polyprotein）。在P3顺反子中+2相位上也发现由移码（reading frame shift）产生的PIPO蛋白。全基因组序列比较分析显示，ShX14分离物与HN2、SYR-NB-16分离物（PVY^NTN-NW株系SYR-I型）的核苷酸、氨基酸序列的一致性分别为98%—99%和98%—100%。该分离物的P1、HC-Pro/P3和CP基因的5′端均检测到显著的重组信号，重组位点分别位于2 318、5 674 和8 385 nt，与PVY^NTN-NW株系（SYR-I型）的重组位点相似。系统发育分析结果显示该分离物与HN2、SYR-NB-16分离物相聚成簇，表明其在系统发育关系上，与PVY^NTN-NW株系（SYR-I 型）的亲缘关系最近。系统发育分析与性状关联分析结果显示该分离物与PVY^NTN-NW株系（SYR-I 型）的关联系数（association index, AI）、简约分值（parsimony score, PS）和最大单系分支（maximum monophyletic clade, MC）3个统计检验均显著，表明其与PVY^NTN-NW株系（SYR-I型）存在显著的关联性。同时，应用多重RT-PCR成功扩增出约为1 000、600和400 bp的3个特异性片段，与PVY^NTN-NW株系（SYR-I型）的特异条带大小相一致。这些结果也进一步确定该分离物属于 PVY^NTN-NW株系（SYR-I型）。【结论】ShX14 分离物为N×O重组分离物，属于PVY^NTN-NW株系（SYR-I型），为后续深入开展该分离物的生物学等研究奠定了基础。

正交设计和均匀设计在优化噻虫胺悬浮剂物理稳定性上的应用

李北兴，王伟昌，张大侠，王凯，管磊，刘峰

中国农业科学. 2015, 48(2): 280-292. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.02.08

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【目的】比较正交和均匀设计两种多因素试验方法在水悬浮剂配方中应用的优缺点，为该方法在农药制剂学领域的应用提供参考。【方法】在采用流点法初筛得到润湿性能良好的润湿分散剂之后，分别采用正交设计和均匀设计制备30%噻虫胺悬浮剂。综合考察润湿分散剂和黏度调节剂对制剂热贮析水率、离心沉淀率、黏度、流动性、分散性、热贮前后样品的粒度分布（D₁₀、D₅₀和D₉₀）和悬浮率的影响。通过主效应图分析正交试验结果，采用逐步回归和偏最小二乘法（PLS）分析均匀试验结果，最后检验优化配方的各项性能。【结果】正交试验和均匀试验的所有样品黏度均在144.50—317.84 mPa·s，均具有良好（良级或优级）的流动性和分散性。由于奥氏熟化作用，样品经热贮后，粒子的粒径轻微增大，D₁₀、D₅₀和D₉₀分别由0.56—1.00、0.88—1.53和1.77—2.68 μm变为0.76—1.02、1.12—1.56和2.07—3.25 μm。所有样品贮前悬浮率均在91.88%—96.39%，经热贮后样品的悬浮率变化不大，分别在91.91%—96.13%，符合悬浮剂质量控制的一般要求，故本研究主要优化了热贮析水率和离心沉淀率两个指标。正交试验分析结果表明，T2700、黄原胶和硅酸镁铝的用量对热贮析水率和离心沉淀率均有显著影响，且均随用量增加而降低，而NR1601的用量对两个因变量的影响不显著。采用正交设计优化的配方，样品黏度为229.6 mPa·s，流动性和分散性良好，热贮前后悬浮率分别为（94.76±0.70）%和（93.50±0.20）%，热贮析水率为（4.23±0.19）%，离心沉淀率也低于10%。均匀设计中，PLS平方项模型对热贮析水率有良好的预测性，热贮析水率为（2.55±0.03）%，离心沉淀率也仅为（4.36±0.21）%，优化样品的黏度为324.16 mPa·s，流动性和分散性良好，热贮前后悬浮率分别为（93.19±0.09）%和（92.77±0.22）%，粒子的粒径小且分布较窄。PLS线性模型对离心沉淀率表现出良好的预测性，优化配方的离心沉淀率为（7.75±0.14）%，热贮析水率为（5.24±0.19）%。逐步回归模型对因变量的预测性均较差，优化配方也并非最优配方，热贮析水率为（9.51±0.20）%，离心沉淀率也高达（16.63±0.19）%。采用双重筛选逐步回归和PLS可以同时优化热贮析水率和离心沉淀率两个因变量，其中前者优化的模型拟合性比后者好，但其优化配方也并非最优配方。【结论】正交设计试验次数较多，但数据分析方法简单易掌握，采用主效应图结合方差分析即可有效地优化30%噻虫胺悬浮剂配方。均匀设计的稳健性差于正交设计，但其试验次数少，可有效降低试验成本，若能掌握其复杂的统计及分析方法，也可以获得理想的优化配方。

秸秆还田对长期连作棉田土壤腐殖质组分含量的影响

刘军，景峰，李同花，黄金花，谈建鑫，曹晶晶，刘建国

中国农业科学. 2015, 48(2): 293-302. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.02.09

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【目的】以棉花长期连作定位试验田为研究对象，分析秸秆还田条件下长期连作棉田土壤腐殖质组分含量变化特征，为衡量和评价秸秆还田对长期连作棉田土壤质量和肥力的影响提供科学的理论依据。【方法】试验在石河子大学农学院试验站棉花长期连作定位试验田进行。设秸秆还田模式下5、10、15、20、25和30 a棉田连作小区，无秸秆还田模式下1、5、10和15 a连作小区，共计10个处理，每个处理3次重复，小区土壤初始背景值相近。棉花种植品种为“新陆早46号”，按“30+60+30”宽窄行距配置，种植密度为每公顷19.8万株/hm²。全生育期滴灌11次，滴灌总量5 400 m³·hm^-2，采用膜下滴灌。共施纯氮495 kg·hm^-2，30%基施，其余随水滴施，其他管理措施同一般大田管理。【结果】秸秆还田可以显著提高3个土层土壤胡敏酸含量，随着连作年限增加, 胡敏酸含量逐渐升高，20—40 cm土层土壤胡敏酸积累幅度最大，连作30 a棉田土壤胡敏酸含量比连作5、10、15、20和25 a分别增加139.90%、86.68%、93.33%、58.60%和22.86%；秸秆还田长期连作棉田0—20、20—40和40—60 cm土层土壤富里酸含量随着连作年限的增加而保持稳定不变, 分别维持在（2.79±0.19）、（2.56±0.10）和（1.77±0.15）g·kg^-1的水平上，而且0—20 cm和20—40 cm土层富里酸含量明显大于40—60 cm土层。秸秆还田能够显著地增加长期连作棉田各个土层胡敏素含量，胡敏素含量0—20＞20—40＞40—60 cm土层。秸秆还田不同连作年限C_HA/C_FA值均大于1，PQ值均大于0.5，且随着年限增加而增大，连作5 a最小，连作30 a最大，0—20、20—40和40—60cm土层连作30年C_HA/C_FA比连作5 a分别增加120.04%、116.39%和112.91%，PQ值连作30 a比连作5 a分别增加37.15%、36.44%和36.81%。【结论】秸秆还田能够提高长期连作棉田土壤胡敏酸和胡敏素的含量，增加富里酸含量并使之处于稳定水平上，还能够显著地提高 C_HA/C_FA和PQ值，使土壤腐殖质品质朝好的方向转化。

沙漠绿洲灌区甜瓜氮磷钾用量优化模式研究

薛亮，马忠明，杜少平

中国农业科学. 2015, 48(2): 303-313. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.02.10

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【目的】为优质甜瓜生产提供科学施肥依据，以挖掘产量潜能，降低生产成本，防止过量施肥造成的环境污染。【方法】连续两年田间试验按氮、磷、钾3因子5水平312-D饱和最优设计方法进行，建立以甜瓜收获后产量、可溶性固形物含量（SSC）和经济效益为目标的肥料效应方程，解析肥料的独立效应与交互效应，确定甜瓜氮磷钾施用量阈值。【结果】相对于不施肥处理（N₀P₀K₀），施肥后甜瓜产量提高了16.42%—65.98%，SSC提高了6.71（2012年）和6.62（2013年）个百分点；在其他两个施肥因子一致时，施氮量由0增加到360 kg·hm^-2，产量分别提高31.23%（2012年）和31.47%（2013年），SSC增加2.89（2012年）和2.46（2013年）个百分点；施磷量由0增加到180 kg·hm^-2，产量提高5.77%（2012年）和7.53%（2013年），SSC提高0.55（2012年）和1.09（2013年）个百分点；施钾量由0增加到90 kg·hm^-2时，产量提高5.51%（2012年）和5.09%（2013年），SSC提高1.37（2012年）和1.69（2013年）个百分点。甜瓜产量、SSC和经济效益随着氮、磷、钾用量的增加而先增加、后降低。对甜瓜产量、SSC和经济效益影响顺序为氮＞钾＞磷。氮磷、氮钾互作对产量、SSC和经济效益影响较为明显，而磷钾互作的影响均不显著；氮磷互作对产量和经济效益为正效应，对SSC不显著；氮钾互作对产量和经济效益为负效应；磷、钾肥含量较低时，增施氮肥对产量、SSC形成抑制作用，较高时氮肥有明显的增效作用。【结论】综合考虑氮磷钾肥对产量、品质和经济效益的影响，绿洲灌区大田甜瓜高产优质高效益的施肥方案为：施氮量260.22—263.64 kg·hm^-2，施磷量133.03—134.08 kg·hm^-2，施钾量87.53—88.52 kg·hm^-2，产量为44 356 kg·hm^-2，SSC 13.61 %，经济效益68 445 yuan/hm²。

水肥耦合对温室袋培番茄品质、产量及水分利用效率的影响

王鹏勃，李建明，丁娟娟，刘国英，潘铜华，杜清洁，常毅博

中国农业科学. 2015, 48(2): 314-323. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.02.11

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【目的】探讨水分和肥料与温室袋培番茄品质、产量及水分利用效率关系，为温室袋培番茄的高效生产提供科学依据。【方法】在温室条件下，以番茄品种‘金棚1号’为试材，研究水肥耦合对温室袋培番茄品质、产量和水分利用效率的影响，同时基于主成分分析方法对番茄品质做多目标综合评价，最后分析不同处理番茄生产的成本和经济收益。【结果】单株施肥量、灌水量以及水肥交互作用对番茄各品质指标影响不同。在相同水分条件下，番茄果实中硝酸盐和可溶性蛋白含量随着肥料浓度的升高而增加，而Vc、番茄红素以及可溶性糖含量却呈现先增加后减少的趋势；在相同肥料浓度下，随着基质含水量的增加番茄果实中硝酸盐、Vc、可溶性蛋白、以及可溶性糖等含量逐渐降低，表现为“稀释效应”，番茄红素的含量则在中水处理下较高；在单株施肥量一定的条件下，其产量随着灌水量的增加呈现先增加后降低的趋势，而在单株灌水量一定的条件下，产量随着施肥量的增加同样呈现抛物线趋势，施肥量、灌水量以及水肥交互作用对番茄产量的影响都达到了极显著水平，其影响大小顺序为水分作用＞肥料作用＞水肥交互作用；在同一施肥水平下，袋式栽培番茄灌溉水分利用效率随着单株灌水量的升高而降低，在同一灌水量水平下，灌溉水分利用效率随着施肥量的增加呈抛物线趋势，施肥量和灌水量作为单一因子对灌溉水分利用效率的影响极显著，且水分作用＞肥料作用，而水肥交互作用对水分利用效率的影响不显著；高肥高水处理的净收益最高，为4.98 元/株，与中肥中水处理（4.86 元/株）、高肥中水（4.84 元/株）以及中肥高水（4.80 元/株）之间无显著性差异；而低肥低水处理的净收益为3.33 元/株，显著低于其他处理。【结论】综合考虑品质、产量、水分利用效率、资源节约以及可持续生产等因素，在不显著降低番茄品质和净收益的情况下，选择中肥（5 1470 mg）中水（120 L）处理作为最优水肥组合。

弱光下菊花‘清露’的激素水平及相关基因表达

韩霜，陈素梅，蒋甲福，房伟民，管志勇，陈发棣

中国农业科学. 2015, 48(2): 324-333. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.02.12

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【目的】测量菊花在弱光条件下，出现庇荫症状过程中乙烯生成速率、赤霉素和生长素含量的变化及相关基因表达变化，从激素和基因水平探究庇荫机理。【方法】以菊花‘清露’为试验材料，设置55%光照（对照）和15%光照（弱光处理）。利用气相色谱仪Agilent 6890N GC在0、2、4、6和8 d测量乙烯生成速率，利用高效液相色谱仪Agilent HPLC-110在0、2、4、6和8 d测量赤霉素（GA₃）和生长素（IAA）含量，以GAPDH为内参基因用荧光定量PCR方法测量0、2、4、6和8 d时PHYA、COP1、PIF4、GAI和IAA1的相对表达量。设置0.5、1.0、2.0和4.0 mmol·L^-1 4个GA₃浓度，用适量乙醇溶解，使乙醇终浓度为1%，0 d、4 d时各处理1次，采用地上部喷施；设10、20、50和100 μmol·L^-1 4个多效唑（paclobutrazol，PAC）浓度，用适量乙醇溶解，使乙醇终浓度是1%，0 d和4 d时各处理1次，根据结果以2.0 mmol·L^-1 GA₃，50 μmol·L^-1 PAC对植物生长影响显著，分别作为处理浓度。0 d、7 d各喷1次，14 d时取样进行基因表达分析。【结果】15%光照条件下，第2天和第4天时乙烯生成速率显著增加，第4天最显著，比对照增加了2.04倍，第6天以后对照和处理的植株乙烯生成速率差异不显著，15%弱光处理条件下植株地上部乙烯生成速率比55%光照条件增加显著；15%光照条件下，第2、4和6天时叶片赤霉素含量与对照相比显著增加，第6天时出现峰值，达到4 700.56 ng·g^-1，比对照高出2.57倍，随后又迅速下降，第8天降到与对照相同的水平；15%光照条件下生长素水平与对照组相比显著下降，随着处理时间的延长，对照组生长素含量呈增加趋势，弱光处理组生长素含量呈下降趋势，第8天时处理组生长素含量为223.95 ng·g^-1FW，对照为489.77 ng·g^-1 FW，对照比处理的生长素含量高出1.12倍。弱光处理第2天时PHYA表达量迅速增加，2—6 d以略小的速度增加，6—8 d保持不变，对照组从第2天开始下降，4—8 d时处理组PHYA变化量都高于对照组；对照和处理的PIF4表达量变化在0—4天趋势相同，不同的是处理组在4—8 d高于对照，尤其是第6天比对照高出1.85倍。对照组COP1呈缓慢降低趋势，处理组先增加后下降，峰值出现在第2天，第8天降到对照组含量以下。整个处理过程中，处理组的GAI一直增加，对照组0—4 d小幅增加，后以较快的速度下降。处理组和对照组IAA1在0—2 d均小幅上升，对照组在2—4 d又以较快速度下降，2 d后处理组IAA1表达量变化不大。外源赤霉素使COP1、PIF4的表达量上升，使GAI和IAA1表达量下降；PAC处理抑制COP1、PIF4、GAI和IAA1的表达。【结论】PHYA、COP1、IAA1和PIF4都受光的诱导，弱光引起ＧＡ_３含量升高和GAI转录水平上调，赤霉素和乙烯参与菊花庇荫调节过程。

大蒜蔗糖﹕蔗糖1-果糖基转移酶（1-SST）的酶学特征

文明，卜利伟，罗紫韵，王佳伟，董芬，黄雪松

中国农业科学. 2015, 48(2): 334-342. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.02.13

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【目的】研究大蒜（Allium sativum L.）中蔗糖﹕蔗糖1-果糖基转移酶（1-SST）的酶学特征，为大蒜保鲜、加工和品质改良提供依据。【方法】采用饱和度10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%和100%的硫酸铵分级沉淀1-SST，以确定其所在的硫酸铵部位。分别取1-SST活力最高的硫酸铵部分与底物蔗糖反应，研究其在不同的温度、pH、离子强度、底物质量浓度等条件下合成高果聚糖的能力，即采用高效液相色谱-蒸发光散射（HPLC-ELSD），测定1-SST反应前后的1-蔗果三糖的含量，进而计算出1-SST活力大小并总结出其在不同的温度、pH、离子强度、底物质量浓度等条件下合成高果聚糖反应的规律；采用的色谱柱为Prevail Carbohydrate ES柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），色谱柱柱温箱温度为40℃，流动相最大限压20 MP，流动相为乙腈和水，其流速为1.0 mL·min^-1，ELSD撞击器关闭状态，漂移管温度90℃，载气流量2.5 L·min^-1（空气）。其梯度洗脱方式为：0 min，75%乙腈﹕25%水；15 min，65%乙腈﹕35%水；30 min，50%乙腈﹕50%水；35 min，75%乙腈﹕25%水；40 min，75%乙腈﹕25%水。【结果】在上述测定条件下，果糖、葡萄糖、蔗糖、1-蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖6种糖完全分离，出峰时间仅为20 min，测定方法可靠、灵敏度高，满足了测定1-SST活性的要求。以50%（w/w）蔗糖为底物时，仅产生1-蔗果三糖，无其它高果聚糖的产生，证实了在所试条件下，大蒜中1-SST反应具有专一性。大蒜1-SST主要存在于30%—40%硫酸铵饱和度部分，其中0—30%，40%—70%有轻微活力，未发现70%—100%硫酸铵组分有1-SST的活力。取30%—40%的硫酸铵饱和度部分作为样品研究1-SST酶学特征发现其最适反应温度为35℃，当温度到达40℃以上时，酶的活力下降的很快，说明1-SST具有热不稳定性，因此在研究大蒜1-SST时，要尽量避免高温，以免影响后续研究；其最适反应pH为5.0，与大麦（Hordeum vulgare）、菊苣（Cichorium intybus L.）、菊芋(Helianthus tuberosus Colombia )、黑麦草（Lolium rigidum）、龙舌兰（Agave americana L.）的1-SST最适pH大致相同，显示不同植物1-SST活力中心部位的结构可能基本一致；在蔗糖浓度为100—600 mg·mL^-1内，酶活力随着底物质量浓度的增加而提高，而当底物浓度超过500 mg·mL^-1时，酶活力增加的幅度减少而趋于平缓，这完全符合米氏方程（Michaelis-menten）的酶动力学性质；对于Na⁺、Cl^-来说，离子强度越低，1-SST活力越强，1-SST在35℃下的米氏常数Km为10⁴ mmol·L^-1。【结论】大蒜1-SST随温度、pH、离子强度、底物质量浓度等变化，不仅影响大蒜贮藏过程中的果聚糖代谢，也影响大蒜加工产品，尤其是大蒜提取物中糖的种类和含量。

大足黑山羊PHLDA2基因的克隆、组织表达与印记状况分析

苏鲁方，彭学强，蒋曹德

中国农业科学. 2015, 48(2): 343-351. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.02.14

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【目的】克隆大足黑山羊PHLDA2（pleckstrin homology-like domain, family A, member 2）基因序列，分析其组织表达特征、印记状况以及与胎盘性状的关系，为深入研究该基因在山羊胎盘中的功能积累数据。【方法】根据人、牛和猪PHLDA2的保守区域设计引物以RT-PCR方法扩增大足黑山羊该基因部分cDNA序列，进一步利用5′-和3′-RACE技术获得全长cDNA序列;利用ORF Finder和ProtParam等在线工具分析PHLDA2基因序列特征;采用Real-time PCR方法分析PHLDA2在大足黑山羊心、肝、脾、肺、肾、大脑、肌肉、脂肪、舌和胎盘等10个组织的表达差异;寻找大足黑山羊和波尔山羊PHLDA2基因序列SNP位点，基于表达SNP的方法分析该基因在F₁代组织中的印记状况;采用线性回归的方法分析PHLDA2表达量与胎盘性状的关系。【结果】克隆得到935 bp大足黑山羊PHLDA2的cDNA全长序列,其中5′-UTR、3′-UTR和编码序列分别为62 bp、450 bp和420 bp，其编码140个氨基酸。预测的山羊PHLDA2蛋白分子量大小为15 638.7 Da，等电点为9.18，二级结构由α-螺旋(37.14%)、β-转角(9.29%)、延伸链(23.57%)和无规卷曲(30%)组成, 并且包含保守的PH（pleckstrin homology）结构域。③BLAST分析发现，山羊PHLDA2定位于29号染色体，其与牛、猪、猕猴、马和人同源基因核苷酸序列的相似性分别达到91%，90%，90%,90%和89%，在核苷酸和氨基酸序列上与牛的亲缘关系最近。④荧光定量PCR结果显示PHLDA2在山羊胎盘中表达量最高（P < 0.01)，在心、肝、肺、肾、肌肉、脂肪、舌和大脑组织中表达量很低且差异不显著（P > 0.05), 在脾中未检测到表达。⑤印记分析表明，PHLDA2在初生山羊胎盘、心脏和肝脏组织表达母源等位基因，但在肺、大脑和肌肉组织为双等位基因表达。⑥PHLDA2表达水平与山羊胎盘重回归关系显著（n = 15，R²=0.855，P <0.01）。【结论】山羊PHLDA2基因序列和结构特征具有物种间的保守性，但是其印记状况具有组织特异性; PHLDA2为山羊胎盘的生长和功能调控的重要基因。

猪传染性胃肠炎病毒非结构蛋白3a和3b融合表达及对细胞周期的影响

梁亚冰，张琪，常嵘，童德文，许信刚

中国农业科学. 2015, 48(2): 352-361. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.02.15

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【目的】克隆及真核表达猪传染性胃肠炎病毒（transmissible gastroenteritis virus ，TGEV）陕西分离株的3a和3b基因，研究表达蛋白在细胞中的分布及其对细胞周期的影响。【方法】利用软件Primer 5.0参照Genbank公布的序列设计两对分别针对TGEV非结构蛋白基因3a和3b的特异性引物。采用RT-PCR方法从TGEV 陕西分离株克隆3a和3b基因，再将其与真核表达载体pEGFP-N1连接，构建真核表达质粒p3a-EGFP-N1和p3b-EGFP-N1。利用脂质体转染法将重组质粒转染猪小肠黏膜上皮细胞（intestinal epithelial cells，IEC），采用激光共聚焦显微镜检测转染细胞内融合蛋白的表达分布情况。通过RT-PCR检测细胞中目的基因的转录情况，Western blotting检测细胞中融合蛋白的表达情况。利用流式细胞仪检测表达蛋白对细胞周期的影响，采用实时荧光定量PCR检测融合蛋白的表达对内质网应激蛋白标志性分子GRP78和细胞周期蛋白Cyclin A的表达的影响，通过Western blotting试验检测细胞中蛋白表达后GRP78、Cyclin A和Cyclin B1表达量的变化情况。【结果】成功克隆出完整的TGEV陕西分离株的3a及3b基因，经过测序鉴定，3a基因的大小为213bp，3b基因的大小为732bp；经过与不同来源的TGEV毒株进行对比分析，3a基因的核苷酸序列与其他毒株同源性为97.4%—100%，氨基酸同源性为98.6%—100%；3b基因的核苷酸序列与其他毒株同源性为98.3%—99.9%，氨基酸同源性为100%。重组表达载体转染IEC细胞后，经Western blotting分析IEC分别表达出分子质量约为35kD的3a-GFP和54kD的3b-GFP的融合蛋白，与预期结果相一致。激光共聚焦显微镜观察到融合蛋白3a-GFP和3b-GFP在IEC细胞的细胞核和细胞质中均有表达，流式细胞仪分析TGEV非结构蛋白3b的表达能够使G2/M期的细胞增多，实时荧光定量PCR分析显示细胞周期蛋白Cyclin A的mRNA水平高于对照组细胞（IEC和IEC-GFP），同时Western blotting分析结果显示表达3b蛋白的细胞中Cyclin A 蛋白水平表达量高于对照组，并且Cyclin B1的表达量低于对照组细胞，差异显著；TGEV非结构蛋白3a对细胞周期没有影响。实时荧光定量PCR分析结果显示，表达TGEV非结构蛋白3a的细胞中GRP78的mRNA水平高于对照组， Western blotting分析GRP78的蛋白水平高于对照组，差异显著，说明非结构蛋白3a可以使GRP78表达水平的上调；TGEV非结构蛋白3b对GRP78的表达没有影响。【结论】TGEV陕西株的非结构蛋白3a和3b在IEC细胞中成功表达，3a蛋白可以引起细胞内质网应激反应，3b蛋白通过使细胞周期蛋白Cyclin A表达上调并且使Cyclin B1表达下调引起细胞周期阻滞于G2/M期。

基于¹H NMR技术的乳热奶牛血清代谢组学分析

孙雨航，许楚楚，李昌盛，夏成，徐闯，吴凌，张洪友

中国农业科学. 2015, 48(2): 362-369. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.02.16

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【目的】应用¹H谱核磁共振（¹H NMR）技术筛选乳热奶牛血清内差异表现的小分子代谢物，从小分子水平和物质、能量代谢的角度探究奶牛发生乳热时其体内的代谢变化。【方法】选取年龄、胎次、体况和泌乳量相近的分娩当天的荷斯坦高产奶牛共32头，根据其血清中钙离子浓度及其有无临床症状分为两组。其中，24头奶牛为健康对照组（Group1, 血钙浓度 > 2.5 mmol·L^-1，无其他任何症状）和8头乳热组（Group2, 血钙浓度 < 1.4 mmol·L^-1，伴有明显乳热临床症状）。32头奶牛分别于清晨饲喂和榨乳前从颈静脉采集血液10 mL，置于离心管中，4℃下以1 500 × g 离心20 min，将离心得到的血清装入1.5 mL的EP管中，置于-80℃下待测。待样品解冻后，分别从每个EP管中抽取400 μL血清，加入200 μL缓冲盐溶液，充分混合、离心后，提取550 μL上清液置于5 mm核磁管中，在500 MHz的核磁共振波谱仪下采集信号。然后利用Topspin和MestReNova等软件将采集到的信号进行傅里叶转换，同时进行调零、校正基线和相位等预处理，去除水峰和尿素峰信号，将一维图谱进行积分分段，并将图谱信息转换为TXT格式文件，以便于后续数据分析，然后使用Chenomx软件进行化合物指认。最后应用SIMCA-P软件对得到的图谱数据进行多元统计分析，包括主成分分析（PCA）和正交修正-偏最小二乘法-判别分析（OSC-PLS-DA），同时结合SPSS软件对核磁数据进行单因素方差分析得到的P值以及Loading图，最终筛选出表现差异的小分子代谢物。【结果】本试验成功得到了乳热组和健康对照组奶牛的血清代谢图谱及差异表达代谢物的Loading图；PCA结果显示每组样品均在95%置信区间内，无需剔除，主成分贡献率较低，其中PC1=26.2%，PC2=16.7%，组间差异变量不能被选择；OSC-PLS- DA结果显示经过5次正交信号修正，与分组无关的变量被去除，组间差异达到最大化；与健康对照组相比，共筛选出9种血清差异表达代谢物，其中4种表达上调，分别为 β-羟基丁酸、丙酮、丙酮酸和赖氨酸，5种表达下调，分别为葡萄糖、丙氨酸、丙三醇（甘油）、磷酸肌酸和氨基丁酸；9种差异代谢产物多为糖和氨基酸，相互之间形成了一个能量转化网络图，通过多种代谢途径参与了机体能量代谢过程，其中较为特殊的差异代谢产物，如磷酸肌酸可直接为机体提供能量，其表现降低可能与病牛肌无力和瘫痪有关。此外，本试验中乳热组奶牛氨基丁酸降低，临床表现为精神沉郁、甚至昏迷，这与人类抑郁症患者的氨基丁酸表现相吻合，有关氨基丁酸下降与奶牛乳热精神的关系有待研究者进一步证实。【结论】¹H NMR技术能够被应用于筛选奶牛血清表现差异的小分子代谢物，代谢物差异显著；本试验中乳热奶牛血清差异代谢产物表现出能量负平衡及脂肪动员的病理学特征，提示乳热与能量代谢障碍有关。

小峰熊蜂可溶型海藻糖酶基因的克隆及表达分析

秦加敏，罗术东，廖秀丽，黄家兴，和绍禹，吴杰

中国农业科学. 2015, 48(2): 370-380. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.02.17

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【目的】克隆小峰熊蜂（Bombus hypocrita）可溶型海藻糖酶基因（soluble trehalase，Tre-1）全长cDNA序列，预测该基因及其编码蛋白的理化性质，明确该基因在小峰熊蜂不同组织及不同发育时期的表达特性，为研究该基因在小峰熊蜂生长发育中的生物学功能奠定基础。【方法】根据地熊蜂（B. terrestris）和B. impatiens可溶型海藻糖酶基因Tre-1编码蛋白的保守区序列，利用Primer Premier 5.0设计简并引物扩增得到小峰熊蜂保守区片段；随后根据该片段设计基因特异性引物，用RACE方法获得5'端和3'端片段。在此基础上，根据RACE扩增所得片段和保守序列，预测开放阅读框（ORF）序列，分别在起始密码子近5'端和终止密码子的近3'端设计ORF区特异性引物扩增得到ORF，最后采用BioEdit软件比对、拼接获得小峰熊蜂Tre-1 cDNA全长序列。运用ExPASy、SignalP 4.1、NetOGlyc 1.0 sever、ClustalW和MEGA 5.0等软件对该基因进行生物信息学分析，并利用实时荧光定量PCR技术，采用2^-^ΔΔCt方法检测不同组织及不同发育时期可溶型海藻糖酶基因的相对表达量。【结果】克隆所得基因cDNA全长为3 129 bp，命名为BhTre-1（GenBank登录号：KJ025078），其中包含5'端441 bp非编码区和3'端945 bp非编码区，ORF为1 743 bp，共编码580个氨基酸。其编码的蛋白预测分子质量为67.16 kD，等电点为5.95；有1个信号肽结构（1—21位），1个甘氨酸富集区（GGGGEY），2个特色“标签序列”（PGGRFKEFYYWDSY和QWDFPNAWPP），6个Asn-Xaa-Ser/Thr（N-X-S/T）序列，无跨膜区。序列分析发现BhTre-1氨基酸序列与地熊蜂BtTre-1和B. impatiens BiTre-1的一致性很高，分别为99%和98%，与西方蜜蜂（Apis mellifera）和云南小蜜蜂（A. florea）的Tre-1一致性也达到78%；系统发育分析也表明BhTre-1与BtTre-1、BiTre-1的亲缘关系最近，与AmTre-1、AfTre-1之间的亲缘关系次之。基因定量分析结果显示BhTre-1在成虫被检测的各组织中均有表达，在中肠的表达量最高，其次是马氏管，其他各组织表达量较低。成年工蜂的BhTre-1表达量高于幼虫和蛹，工蜂出房后随着龄期的增加表达量呈现先升高后降低的规律，在第15天表达量最高。【结论】克隆得到了BhTre-1全长cDNA序列，其分子生物学特性与其他昆虫Tre-1相似，该基因在小峰熊蜂中肠表达量最高，此外，幼虫和蛹的表达量低于成年工蜂，工蜂出房后表达量呈现先升高后降低的趋势，为进一步研究该基因在小峰熊蜂体内的生物学功能奠定了基础。

多花黑麦草DUS测定中SSR标记品种鉴定比较分析

黄婷，马啸，张新全，张新跃，张瑞珍，符开欣

中国农业科学. 2015, 48(2): 381-389. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.02.18

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【目的】多花黑麦草是具世界栽培意义的牧草，但因异花授粉特性，育种材料的频繁交流导致品种间的遗传差异越来越小，传统农艺性状进行品种鉴定变得越来越困难。高效、快速有效地鉴定品种对实现育种目标具有重要作用，可为辅助多花黑麦草品种DUS测试和品种鉴定、知识产权保护等提供科学依据。【方法】基于SSR标记具有稳定性强、多态性高和共显性特点，对6个国审骨干多花黑麦草品种采用30株混合取样策略，每个品种以不同单株构成的30株混合样本量进行3次重复试验，以重复试验中至少出现2次的频率高的强带进行统计，从165对多花黑麦草SSR引物中，筛选出20对引物用于多花黑麦草品种鉴定。并采用30株单株样本扩增与30株混合样本扩增相结合的方法，加之扩增结果的比对，进行品种的鉴定分析。【结果】利用13-07A、01-06D和15-08C引物对6个多花黑麦草品种进行30株单株和30株混合取样对比性分析表明，混合株的某些条带相对于单株条带更为明显，且条带数更多，但也易出现一些弥散带，单株扩增中出现频率在40%及以上的条带则会在混合样本中出现；3组混合取样结果表明，20对SSR引物共扩增出143条清晰可辨条带，其中多态性条带127条，多态性条带的比率为88.81%，每对引物扩增的条带数为5—11，平均为7.15条，平均多态性条带为6.35条，平均多态性信息含量（PIC）为0.571，有的引物虽多态性信息含量较低，但稳定性好，3组混合样本扩增结果几乎一致；6个多花黑麦草品种的遗传相似系数范围为0.4755—0.7552，遗传相似系数最大的为邦德和阿德纳，遗传相似系数最小的为长江2号和特高。在平均遗传相似系数为0.615时可以将6个多花黑麦草品种划分为三大类：第Ⅰ类包括安格斯1号、邦德、阿德纳、达伯瑞；第Ⅱ类是长江2号；第Ⅲ类是特高。20对引物中有9对引物可以直接进行6个品种的鉴定，而其余的引物只能鉴别其中的3个或4个，则可通过不同引物的组合提高鉴别能力。【结论】对于异花授粉植物，多态性并非衡量引物有效性的唯一标准，引物稳定性也是衡量引物有效性的重要指标；相对于单株取样法，采用混合取样法进行品种鉴定更为有效；筛选出的20对SSR引物可以明确区分供试材料，采用SSR分子标记对多花黑麦草进行品种鉴定分析具有可行性。

基于gpd基因的大蒜黑腐病菌实时荧光定量PCR鉴定技术

王英超，甘琴华，厉艳，纪瑛，吴兴海，邵秀玲

中国农业科学. 2015, 48(2): 390-397. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.02.19

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【目的】大蒜黑腐病菌（Embellisia allii (Campanile) Simmons）的检疫鉴定主要采用形态鉴定方法。不仅耗时长，而且大蒜黑腐病菌与本属其他种以及其他属的分生孢子非常相似，极难分辨，需要建立快速、有效的分子诊断方法。研究旨在建立实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR, qPCR)体系以准确、灵敏地鉴定大蒜黑腐病菌。【方法】从NCBI的GenBank数据库中，选取大蒜黑腐病菌和其他大蒜病害以及近似种的3-磷酸甘油脱氢酶（gpd）基因核酸序列数据15种，应用引物设计软件Primer express，根据探针设计原则从理论上选出1条探针和3对引物。根据试验结果对上述引物进行筛选，筛选出能够鉴定出大蒜黑腐病菌的特异性引物对和TaqMan探针。同时对反应体系中复性-延伸温度的反应参数进行优化，设计56、58、60℃ 3个温度梯度；将大蒜黑腐病菌基因组DNA在紫外核酸分析仪上进行定量后进行10倍的梯度稀释，对探针灵敏性进行测试，从而建立大蒜黑腐病菌TaqMan水解探针法qPCR检测体系。【结果】从基于GenBank上的15种gpd基因核酸序列设计的引物和探针中，筛选出能够鉴定大蒜黑腐病菌的特异性引物对Emb21/Emb32和TaqMan探针Emb。在供试的6种菌株中，只有靶标菌大蒜黑腐病菌利用该引物对和探针能够被特异性的检测到阳性，空白对照和其他参试菌均没有荧光信号的增加，检测为阴性。复性-延伸温度反应参数优化中，△Rn荧光信号增加值在58℃时达最大，56、60℃荧光信号增加值降低，经过多次重复试验，确定最佳的复性-延伸温度为58℃。灵敏度测试中，大蒜黑腐病菌DNA浓度稀释到140 pg时，所得的图形较好；当体系中模板浓度稀释到14 pg时，所得的图形较差。最终DNA检测灵敏度为140 pg。应用该引物和探针建立的qPCR检测方法能够从供试的菌株中特异性地检出大蒜黑腐病菌。【结论】建立了大蒜黑腐病菌TaqMan探针法qPCR检测体系,该检测技术能够从供试的6种病原菌中特异性检测出大蒜黑腐病菌，检测灵敏度可达140 pg。建立的基于gpd基因的大蒜黑腐病菌qPCR方法具有高度的特异性和灵敏度，适合口岸大蒜黑腐病菌的快速检测。

基于基因组原位杂交快速构建黄瓜变种间核型

张云霞，娄群峰，李子昂，王筠竹，张振涛，李季，陈劲枫

中国农业科学. 2015, 48(2): 398-406. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.02.20

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【目的】利用基因组荧光原位杂交（genomic in situ hybridization，GISH）技术，对黄瓜（Cucumis sativus L.，2n=2x=14）种内两个变种（栽培黄瓜C. sativus var. sativus和野生黄瓜C. sativus var hardwickii）进行中期染色体分析，建立黄瓜变种染色体核型的快速分析方法，为黄瓜细胞分子遗传学研究提供基础。【方法】以栽培黄瓜‘9930’和野生黄瓜C. sativus var. hardwickii为材料，利用CTAB法提取栽培黄瓜‘9930’的基因组总DNA，采用缺刻平移法，将栽培黄瓜‘9930’基因组DNA和45S rDNA分别利用地高辛和生物素标记为探针，与栽培黄瓜‘9930’和野生变种C.sativus var. hardwickii的中期染色体进行荧光原位杂交，根据杂交结果显示的栽培黄瓜与野生变种每条染色体GISH荧光带型的不同，结合45S rDNA位点信号特征，区分栽培黄瓜与野生变种的每条染色体，并进行核型分析。【结果】荧光原位杂交结果显示，GISH信号并非平均分布于所有染色体上，而是在不同染色体的特定部位产生独特的信号，且两个变种间中期染色体的GISH信号模式差异显著。在栽培黄瓜‘9930’有丝分裂中期染色体上，除了6号染色体仅在短臂末端和近着丝粒处产生GISH信号外，其他染色体上的GISH信号集中分布于染色体的两端和近着丝粒的一侧或两侧，且每条染色体的信号特征差异明显；45S rDNA信号主要分布于‘9930’的第1、2、3、4和7号染色体的近着丝粒处，有3对强信号和2对弱信号。在野生黄瓜C. sativus var. hardwickii有丝分裂中期染色体上，杂交信号的位置及强弱与栽培黄瓜‘9930’表现明显不同，近着丝粒处均有GISH信号，但仅在第1、2、4和5号染色体的一端产生GISH信号，45S rDNA信号仅出现在第1、2和3号染色体上，表现为第1号染色体上信号极强，第2和3号染色体上信号极微弱。这些结果显示，以栽培黄瓜基因组DNA为探针的荧光原位杂交能反应出两个变种中期染色体独特的信号分布模式，通过信号的分布模式和强弱，结合45S rDNA位点信号的特异分布，可对每条染色体进行清晰地鉴别，并据此建立了两个变种的核型模式。比较前人发表的黄瓜已有重复序列的分布图，发现GISH揭示的信号分布主要位于黄瓜染色体串联重复序列区域。【结论】黄瓜基因组原位杂交能一次性快速显示基因组串联重复序列的分布图，能有效地用于不同黄瓜变种的快速核型分析；同时发现染色体上串联重复序列的分布及强弱在黄瓜变种间表现出明显的分化。

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