中国农业科学

水稻花器官数目异常突变体afon1的表型分析与基因定位

杨成聪，梁容，秦冉，曾冬冬，金晓丽，石春海

中国农业科学. 2017, 50(20): 3837-3847. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.20.001

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【目的】研究水稻花器官数目异常突变体afon1（abnormal floral organ number1）的分子机理，鉴定出控制水稻花器官数目变化的基因。【方法】利用甲基磺酸乙酯（EMS）诱变籼稻品种浙农34获得一个花器官数目异常突变体作为试验材料，命名为afon1。开花期随机取突变体afon1和野生型浙农34的稻穗各5个，利用组织学和扫描电子显微镜等技术研究afon1的花器官表型、细胞学特征和花粉育性。成熟期随机取突变体afon1和野生型浙农34植株各10株，测定株高、分蘖数、穗长、每穗颖花数、每穗实粒数和千粒重等农艺性状。随机取突变体afon1和野生型饱满种子各100粒，测定发芽势和发芽率。以突变体afon1为母本，分别与野生型浙农34和粳稻品种浙农大104杂交构建2个F2群体进行遗传分析和基因定位，筛选候选基因进行DNA测序比对，构建AFON1蛋白质的空间模型并对其结构进行分析，同时对候选基因以及与花器官数目相关的基因进行实时荧光定量PCR分析。【结果】与野生型相比，突变体afon1中59.64%小穗的花器官数目发生异常，其中多数小穗仅在内稃一侧产生一个颖壳状的器官，部分小穗表现2—4轮花器官数目同时增加；株高和千粒重显著增加，而结实率显著降低。遗传分析表明，突变体afon1与野生型浙农34杂交的F1植株小穗花器官数目表现正常，F2群体中小穗花器官数目正常植株与花器官数目异常植株的分离比符合3﹕1，表明突变体afon1性状受一对隐性核基因控制，基因位于水稻第1染色体长臂端InDel标记1M5和1M18之间，物理距离为73 kb，该区间内共有6个注释基因。突变体afon1和野生型的测序比对发现，突变体afon1中的基因LOC_Os01g67430外显子中第565个碱基T突变成A，导致第189个氨基酸由色氨酸突变为精氨酸。蛋白质序列和空间结构分析表明，AFON1蛋白质序列中含有一个Lipase_3结构域，结构域内的突变导致蛋白质的空间结构发生了明显的变化。实时荧光定量PCR结果显示，LOC_Os01g67430在突变体afon1幼穗中的表达量要显著高于野生型，而在根、茎和叶中则无显著差异；穗发育早期FON1和FON2/4等调控花器官数目的基因在突变体afon1花器官中的表达量显著增加。【结论】LOC_Os01g67430为突变基因afon1，该基因通过影响花器官数目相关基因的表达而调控各轮花器官数目。

用高基元微卫星标记分析中国糜子遗传多样性

王瑞云，刘笑瑜，王海岗，陆平，刘敏轩，陈凌，乔治军

中国农业科学. 2017, 50(20): 3848-3859. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.20.002

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【目的】开发高基元（4—6）碱基重复微卫星标记，分析种质资源遗传多样性，为糜子遗传和进化研究提供理论基础。【方法】用隶属函数、主成分分析和聚类分析综合评价糜子资源表型多样性，用前期糜子转录组测序获得高基元SSR引物对地理来源差异大的糜子材料进行PCR扩增检测其多态性，用PowerMarker 3.25计算遗传多样性参数，用PopGen 1.32计算Nei’s遗传距离，用MEGA 5.0进行聚类分析，用Structure 2.2鉴定遗传类群。【结果】96份糜子资源株高和穗长变异最丰富，多样性指数分别为2.08和1.91。PCR扩增发现，占56.29%的85对引物具多态性，其中四、五和六碱基重复引物分别为71对（83.53%）、10对（11.76%）和4对（4.7%）。85个标记扩增产物大小分布为100—450 bp，PIC值平均为0.51，Rp值为1.00—5.75，平均为3.15。四、五和六碱基重复SSR的平均Rp值分别为3.15、2.8和4.0。基于Rp值分析SSR的分布频次，发现85个标记分布区间为0—1、1—2、2—3、3—4、4—5和5—6，分别包含1（1.18%）、15（17.65%）、31（36.47%）、20（23.53%）、12（14.12%）和6（7.06%）个标记，60%（51个）的标记分布在区间2—3和3—4。用85个SSR扩增96份糜子资源，共检测到232个等位变异，每个位点检测到等位变异2—3个，平均2.7294个；62个位点产生3个变异，23个位点产生2个变异；多样性指数为0.2842—1.0633，平均为0.7708；PIC值为0.0400—0.7281，平均为0.4723。不同生态区糜子种质间的遗传距离为0.0093—0.5052（平均为0.1798），遗传一致度为0.6034—0.9907（平均为0.8485）。基于UPGMA将96个糜子基因型聚为4个群组，第一群组主要属于北方春糜子区；第二群主要属于东北春糜子区；第三群组主要属于华北夏糜子区；第四群组主要属于黄土高原春夏糜子区。遗传结构分析将96份试材划分为4个类群，分别代表黄土高原、华北、东北和北方基因库。UPGMA聚类分析和遗传结构分析结果基本一致，均与地理起源相关。【结论】在糜子中构建了85个四、五和六碱基重复微卫星标记，这些高基元SSR的引物分辨率（Rp）高，对不同基因型分辨能力强，PCR扩增多态性好；用其评估中国糜子资源的遗传差异发现，黄土高原春夏糜子区和北方春糜子区资源遗传多样性最丰富。

异源表达irrE转基因烟草的耐盐耐旱性

赵雷霖，范鑫，聂星，梁成真，张锐，孙国清，孟志刚，林敏，王远，郭三堆

中国农业科学. 2017, 50(20): 3860-3870. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.20.003

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【目的】IrrE是从耐辐射异常球菌中发现的全局调控蛋白，主要通过修复强辐射等逆境条件下DNA损伤，提高耐辐射异常球菌对极端逆境环境的抗性。研究按植物密码子优化的irrE后导入烟草对转基因烟草耐逆能力的提高，为棉花等作物耐逆育种研究打下基础。【方法】按照植物密码子优化细菌irrE并合成基因；通过酶切连接法构建irrE植物表达载体；通过叶盘法转化烟草并PCR验证获得阳性转基因再生苗；通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析转基因株系中irrE的表达量；通过蛋白免疫印迹法（Western blot）检测IrrE编码蛋白；通过NaCl和甘露醇模拟盐处理和干旱处理分析纯和转基因株系的耐盐耐旱性，通过测定抗逆相关生理指标鉴定其对植物耐逆的贡献。【结果】按照植物密码子对irrE进行改造，共优化了241个密码子；构建了高效植物表达载体GBI-IE；利用除草剂草甘膦作为筛选剂获得转基因再生幼苗，并通过PCR验证共获得15个独立的转基因株系；通过qRT-PCR分析从中选取两个表达量最高的株系GO1和GO2进行后续的抗逆性分析；Western blot验证IrrE编码蛋白在GO1和GO2中能正确翻译。转基因烟草耐盐耐旱性分析：种子萌发试验表明，正常1/2 MS培养基上，转基因株系GO1和GO2发芽率和非转基因野生型对照之间没有明显的差异。然而250 mmol·L^-1 NaCl培养基上GO1和GO2萌发率分别为78.8%和90.0%，野生型仅为10.3%，分别提高了68.5%和79.7%。类似地，300 mmol·L^-1甘露醇条件下，野生型的萌发率为39.7%，转基因株系GO1和GO2分别提高了42.9%和50.8%；正常萌发的种子移栽到250 mmol·L^-1 NaCl和300 mmol·L^-1甘露醇条件12 d后，转基因株系根长、侧根数以及鲜重等生理指标显著高于野生型对照；温室中正常生长30 d的苗期烟草在250 mmol·L^-1 NaCl处理下，转基因烟草SOD、CAT活性比野生型对照分别提高了48.80%和88.55%，而MDA含量比野生型对照降低了61.61%，胁迫响应基因NtABF2、NtLEA5、Ntzfp、NtCDPK2在GO1和GO2转基因株系中表达量均显著高于非转基因野生型。和盐处理结果类似，300 mmol·L^-1甘露醇的处理下，转基因烟草的耐旱生理生化指标均优于非转基因对照。【结论】烟草中异源表达耐辐射异常球菌irrE可以显著提高耐盐耐旱性；其多效性耐非生物胁迫能力的提高表明其可作为植物耐逆基因工程的优良基因源。

外源6-BA对两种氮素水平下小麦幼苗叶片光合性能及内源激素含量的影响

杨东清，董文华，骆永丽，宋文挺，蔡铁，李勇，尹燕枰，王振林

中国农业科学. 2017, 50(20): 3871-3884. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.20.004

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【目的】在盆栽和大田种植条件下，研究两种氮素水平与喷施外源细胞分裂素（6-BA）对小麦幼苗叶片叶绿素含量、光合参数、叶绿素荧光参数、硝酸还原酶（NR）和谷氨酰胺合成酶（GS）活性和内源激素含量、产量和其构成因素的影响，为外源激素调控苗期小麦生长提供理论依据。【方法】选用济麦22（JM22）为试验材料，盆栽种植条件下，设置低浓度氮（0.63 mmol·L^-1）、高浓度氮（3.75 mmol·L^-1）和叶面喷施清水、30 mg·L^-1的6-苄基腺嘌呤（6-BA）及300 mg·L^-1的洛伐他汀（Lovastatin）6个喷施组合处理，即高氮下喷清水的对照（HN）、高氮下喷施外源细胞分裂素（HN+6-BA）、高氮下喷施细胞分裂素合成抑制剂（HN+Lov）、低氮下喷清水的对照（LN）、低氮下喷施外源细胞分裂素（LN+6-BA）、低氮下喷施细胞分裂素合成抑制剂（LN+Lov）。处理后每隔3 d，测定叶绿素含量、光合参数、叶绿素荧光参数、GS和NR活性、内源激素含量。大田条件下，设置低施氮量（120 kg·hm^-2，N1）、常规施氮量（240 kg·hm^-2，N2）、叶面喷施清水、30 mg·L^-1的6-BA和300 mg·L^-1的Lovastatin 6个喷施组合处理，即N1、N1+6-BA、N1+Lov、N2、N2+6-BA、N2+Lov。于成熟期测定籽粒产量、单位面积穗数、千粒重和穗粒数。【结果】盆栽条件下，与对照相比，喷施外源6-BA显著提高了小麦幼苗地上部植株干重；喷施抑制剂Lovastatin则显著降低小麦幼苗地上部植株干重。与对照HN和LN相比，处理后12d，HN+6-BA和LN+6-BA两处理的植株干重分别提高21.39%、43.92%。与对照HN相比，HN+6-BA处理显著提高了叶片气孔导度（G_s）、蒸腾速率（T_r）、胞间二氧化碳浓度（C_i）、净光合速率（P_n）；处理后12 d，HN+6-BA处理的G_s、T_r、P_N、C_i分别提高68.32%、58.66%、30.72%、51.61%。高氮水平的叶绿素a（Chl a）、叶绿素b（Chl b）分别比低氮水平高103.39%、94.44%。与对照HN相比，HN+6-BA处理显著提高了9—12 d Chl a含量和3—12 d 的叶片Chl b含量。高低氮水平下，喷施Lovastatin均显著降低了Chl a和Chl b含量。高低氮水平下，喷施6-BA显著体高了叶片硝酸还原酶（NR）和谷氨酰胺合成酶（GS）活性，而外喷Lovastatin则显著降低了叶片NR及GS活性。快速叶绿素a荧光诱导动力学分析表明外源6-BA处理改变了OJIP曲线。与对照HN相比，HN+6-BA显著提高了Ψ_o和PI_abs，降低了W_k和V_j值。与对照LN处理相比，LN+6-BA处理的W_k和V_j分别降低22.09%和36.05%。外源6-BA对小麦幼苗叶片内源激素含量影响显著。与对照HN相比，HN+6-BA显著提高了3—12 d 叶片Zt含量和6—12 d叶片IAA含量。喷施6-BA显著降低了叶片ABA含量，而Lovastatin处理则显著提高了叶片ABA含量。大田试验结果表明，与对照N1和N2相比，喷施外源6-BA显著提高了小麦籽粒产量，N1+6-BA和N2+6-BA处理的籽粒产量分别提高10.48%和16.61%。【结论】外源6-BA与氮素配合施用，通过提高内源Zt含量，降低内源ABA含量，一方面提高了Chl a及CHl b含量和NR及GS活性，进而改善了叶片氮素同化能力和光能捕获、传递转化能力；另一方面提高了PSII反应中心电子传递链供体侧和受体侧的电子传递能力，进而改善了改善光系统性能，提高叶片光合性能，叶片积累较多的光合产物，从而提高苗期地上部植株干重，最终提高了籽粒产量。

减氮适墒对冬小麦土壤硝态氮分布和氮素吸收利用的影响

张嫚，周苏玫，杨习文，周燕，杨蕊，张珂珂，贺德先，尹钧

中国农业科学. 2017, 50(20): 3885-3897. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.20.005

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【目的】针对黄淮冬麦区过量施氮的现象，研究了适量减氮在不同土壤墒情下硝态氮分布以及冬小麦对氮素吸收利用效率和籽粒产量的变化，为该地区小麦生产上科学施用氮肥提供理论依据。【方法】于2014—2015和2015—2016两个小麦生长季，在大田条件下设置3个灌水处理，自然降水（W1）、适墒（W2，70%±5%）、足墒（W3，80%±5%）和3个施氮量处理（不施氮，N1；减氮施肥，N2：195 kg·hm^-2；常规高量氮肥，N3：270 kg·hm^-2），测定了0—100 cm土层硝态氮含量、冬小麦植株氮素吸收转运量和籽粒产量。【结果】0—60 cm土层硝态氮（NO₃-N）的分布随土层加深而减少，随施氮量增加而提高，随土壤墒情的增大而减少；＞60 cm又出现不同程度的回升，尤其是足墒（W3）加大了NO₃-N的淋溶，N2、N3水平下80—100 cm土层W3平均比W1高出了3.8 mg·kg^-1和4.2 mg·kg^-1；减氮处理（N2）促进了NO₃-N吸收，成熟期0—20 cm土层NO₃-N比开花期平均降幅为2.3 mg·kg^-1，高氮处理（N3）收获后土层中NO₃-N却有较多的富集。减氮适墒处理（W2N2）显著增加了开花期营养器官氮素积累量（P＜0.05），并促进氮素向籽粒的有效转运，尤其表现在叶片中；花前氮素转移量和对籽粒的贡献率均达最大，籽粒产量和籽粒中的氮素积累量分别比其他处理平均高出15.4%、27.3%，从而极显著提高了氮素吸收率和生产效率（P＜0.05）。【结论】本试验条件下，施氮量195 kg·hm^-2，拔节后土壤相对含水量维持在70%±5%，是兼顾产量、氮肥吸收和生产效率的最佳处理。

不同紫花苜蓿品种对低磷环境的形态与生理响应分析

栗振义，张绮芯，仝宗永，李跃，徐洪雨，万修福，毕舒贻，曹婧，何峰，万里强，李向林

中国农业科学. 2017, 50(20): 3898-3907. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.20.006

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【目的】筛选耐低磷苜蓿品种及与耐低磷密切相关的性状指标，进一步为紫花苜蓿耐低磷机制研究和生产应用提供理论依据。【方法】本研究在溶液培养条件下，对20个紫花苜蓿品种的24 d龄的幼苗分别进行常磷（500 μmol·L^﹣¹ KH₂PO₄）和低磷（5 μmol·L^﹣¹ KH₂PO₄）处理，30 d后检测各品种的茎叶干重（SLW）、株高（PH）、根干重（RW）、根冠比（RS）、总根长（TRL）、根表面积（RSA）、全磷含量（TP）、磷利用率（PUE）、酸性磷酸酶活性（ACPA），并计算各指标的耐低磷系数。进一步对各指标的耐低磷系数进行相关性分析，并运用主成分分析、隶属函数分析、回归分析及聚类分析方法，综合评价不同品种耐低磷性及筛选与耐低磷密切相关的指标，同时建立耐低磷评价模型。【结果】低磷胁迫下，各品种紫花苜蓿的地上部分生长受到抑制，地下根系增大，全磷含量显著下降（P＜0.01）。通过主成分分析可将9个单项指标转化为4个新的相互独立的综合指标。进一步利用隶属函数对4个新的综合指标进行耐低磷综合评价，结合聚类分析结果，可将20个紫花苜蓿品种可分为三类，其中耐低磷较强的品种包括敖汉、新牧1号、耐盐之星、皇冠；中度耐低磷品种包括骑士T、驯鹿、牧歌37CR、龙牧801等9个品种；耐低磷较弱的品种包括巨能Ⅱ、中苜2号、康赛等7个品种。进一步利用逐步回归分析方法建立了紫花苜蓿耐低磷性评价数学模型D=-0.7997+0.3856SLW+0.2025PH+0.3789RW+0.1051TRL+0.4188TP+0.1347ACPA，方程的决定系数R²=0.9982.【结论】通过分析紫花苜蓿不同品种的耐低磷能力，得出耐低磷较强的品种为敖汉、新牧1号、耐盐之星、皇冠，与耐低磷性最相关的指标有茎叶干重、株高、根干重、总根长、全磷含量和酸性磷酸酶活性，可用于紫花苜蓿耐低磷性的评价筛选。

普通小麦-十倍体长穗偃麦草衍生新品种抗赤霉病基因的分子鉴别

刘新伦，王超，牛丽华，刘志立，张录德，陈春环，张荣琦，张宏，王长有，王亚娟，田增荣，吉万全

中国农业科学. 2017, 50(20): 3908-3917. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.20.007

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【目的】赤霉病（Fusarium head blight，FHB）是世界范围内严重危害小麦生产的病害之一。十倍体长穗偃麦草（Thinopyrum ponticum）具有优良的赤霉病抗性，普通小麦-十倍体长穗偃麦草衍生新品种西农509、西农511和西农529在田间展现出较强的赤霉病抗性。本文旨在对这3个品种的赤霉病抗性基因进行分子鉴别，为它们在小麦赤霉病抗性遗传改良中的应用提供理论依据。【方法】通过赤霉病菌（Fusarium graminearum）人工接种鉴定，明确3个小麦新品种对赤霉病的抗性水平。利用偃麦草E组染色体（臂）第1—7同源群的特异引物对3个普通小麦-十倍体长穗偃麦草衍生新品种及其主要亲本小偃693、小偃597和十倍体长穗偃麦草进行分子鉴定，确定其长穗偃麦草的遗传区段。利用与长穗偃麦草7EL染色体上抗赤霉病基因Fhb7紧密连锁的标记对实验材料进行分析，明确该抗性基因与Fhb7的关系。【结果】鉴定结果表明，西农509、西农529和西农511的赤霉病抗性与中抗对照品种扬麦158的抗性水平相当，表现为中抗。105个长穗偃麦草E基因组特异标记中有7个在3个新品种中均能扩增出长穗偃麦草的特异条带，其中5个标记定位于7EL染色体臂上，2个标记定位于7ES染色体臂上。利用97个定位于7E染色体的特异标记进一步对小偃693、小偃597和3个新品种的遗传片段进行鉴别，结果表明20个标记能在5个长穗偃麦草衍生品种（系）扩增出稳定的十倍体长穗偃麦草的特异条带，其中包括与Fhb7紧密连锁的XsdauK8、XsdauK144、XsdauK27、XsdauK99、Xcfa2040和XsdauK116等6个标记（7EL 149.00—7EL 153.77），即表明该区段源自于十倍体长穗偃麦草，跨距约89 cM。然而，已报道的7EL染色体臂末端与Fhb7两侧紧密连锁的分子标记XsdauK60（7EL 153.77）、Xmag1932（7EL 154.70）、Xcfa2240（7EL 156.27）、XsdauK66（7EL 158.02）、XsdauK71（7EL 158.97）和Xsews19（7EL 160.00）等在3个新品种及小偃597中均没检出长穗偃麦草的特异条带。【结论】普通小麦-十倍体长穗偃麦草衍生新品种西农509、西农511和西农529具有较好的赤霉病抗性，携带来自于十倍体长穗偃麦草7E染色体的遗传区段，然而该抗赤霉病基因不同于Fhb7。

拮抗根癌土壤杆菌的桃内生细菌的筛选鉴定

李昱佳，李茜，张志想，李世访

中国农业科学. 2017, 50(20): 3918-3929. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.20.008

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【目的】从对根癌病具有获得抗性（SAR）的桃单株“西北13-1”的枝条内分离鉴定内生细菌，分析其种群组成并从中筛选拮抗根癌土壤杆菌的高效生防菌，为桃根癌病的生物防治探索新方向并提供新的生防菌资源。【方法】首先，将根癌土壤杆菌（Agrobacterium tumefaciens）接种到“西北13-1”的桃树枝条上，并以无菌水接种作为对照；然后，分别于接种前、接种后10 d和接种后60 d采集接种处理和对照处理的“西北13-1”枝条。表面消毒桃树枝条样品后采用涂布平板法分离内生细菌；并结合16S rDNA序列鉴定，比对初步鉴定菌株，分析内生细菌的数量及组成差异。采用平板拮抗法、温室防病效果测定筛选拮抗根癌土壤杆菌的活性菌株，通过生理生化测定和分子鉴定，明确其分类地位。为揭示拮抗菌可能具有的其他拮抗作用机制，通过电击转化将含有GFP基因的pBBR1MCS-2质粒导入拮抗菌株中，然后进行GFP标记菌株对根癌土壤杆菌的抑菌试验、生长动力学分析、稳定性测试。采用灌根法提前接种标记菌株菌悬液，第2天接种根癌土壤杆菌菌悬液，应用激光扫描共聚焦显微镜和平板稀释法研究标记菌株在番茄根部的定殖情况。【结果】从“西北13-1”桃枝条中共分离到108株内生细菌，基于16S rDNA序列，这些菌株分别属于伽马变形菌类（Gammaproteobacteria）、阿尔法变形菌类（Alpharoteobacteria）、放线菌类（Actinobacteria）、厚壁菌类（Firmicutes）、拟杆菌（Bacteroidetes），共计5个细菌类群17个属，显示了桃树枝条中内生细菌丰富的种群多样性。其中，伽马变形菌类的肠杆菌属（Enterobacter）、泛菌属（Pantoea）和根瘤菌属（Rhizobium）最多，其数量在接种根癌土壤杆菌后显著上升，包含了14株产抑菌圈的拮抗菌中的10株细菌。经鉴定，筛选出的两株抑菌活性较高、具有生防潜力的拮抗菌10DM4-1和10DI2-2分别为泛菌（Pantoea deleyi）和肠杆菌（Enterobacter cowanii），它们可显著抑制向日葵根癌瘤的形成，防治效果分别为86.08%和89.87%。标记菌株10DM4-1-gfp和10DI2-2-gfp灌根番茄后，可在根部细胞间隙观察到目标菌落，标记菌株的数量在0—10 d时呈现急剧下降趋势，最后保持相对稳定的较低水平（10⁴ CFU/g），说明了它们在番茄根组织内具有良好的生存和定殖能力。【结论】桃“西北13-1”的内生菌中存在着能够拮抗根癌土壤杆菌的细菌，这些具有拮抗活性的菌株与桃“西北13-1”具有根癌病抗性有关。分离得到的泛菌10DM4-1和肠杆菌10DI2-2可能通过产拮抗物质、占据根部有利生态位拮抗根癌土壤杆菌。

不同施氮量下缓释氮肥与尿素掺混对玉米生长与氮素吸收利用的影响

郭金金，张富仓，王海东，闫世程，郑静，陈东峰，李志军

中国农业科学. 2017, 50(20): 3930-3943. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.20.009

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【目的】研究不同施氮量下，尿素与缓释氮肥掺混对大田玉米生长、干物质累积量、产量、氮肥利用率和土壤硝态氮残留的影响，为作物高效施氮管理提供理论依据。【方法】试验选用玉米品种郑单958，设置了3种氮肥类型（尿素（U）、缓释氮肥（S）、尿素缓释肥3∶7掺混（SU））和4个施氮水平（N1（90 kg·hm^-2）、N2（120 kg·hm^-2）、N3（180 kg·hm^-2）、N4（240 kg·hm^-2）），以不施氮肥（N0）为对照，共13个处理。生育期内对玉米株高、茎粗和叶面积指数进行观测，并统计干物质累积量、产量及产量构成因素。【结果】氮肥类型与施氮量及两者交互作用对玉米生长指标、干物质累积量、产量及产量构成要素都有显著的影响。尿素掺混缓释氮肥（SU）在N3施氮量下玉米最大干物质累积量和氮素累积吸收量分别为17 927.9 kg·hm^-2和156.1 kg·hm^-2，较其他处理分别提高了16.0%—61.7%和8.1%—45.2%。尿素掺混缓释氮肥（SU）在N3施氮量下，产量达到最高，为6 200 kg·hm^-2，比尿素（U）N3处理和缓释氮肥（S）N2处理的产量分别增加了19.8%和20.7%；其中，缓释氮肥处理（S）和尿素掺混缓释氮肥处理（SU）在N2施氮量下比尿素处理施氮量减少30%时，产量无显著性差异。玉米的产量并不是随着施氮量的增加而增加，尿素（U）和尿素掺混缓释氮肥处理（SU）在N3施氮量时玉米产量比N4施氮量分别增加了19.7%和19.0%，缓释氮肥处理（S）中N2施氮量的玉米产量比N3和N4施氮量分别提高10.9%和26.5%。尿素掺混缓释氮肥（SU）N3处理玉米吐丝期后营养器官中氮素向籽粒中转运量最大，比尿素（U）N3处理和缓释氮肥（S）N2处理分别增加了14.7%和8.2%，有利于促进籽粒的增产。土壤硝态氮的累积量随着施氮量的增加而增加，但是尿素掺混缓释氮肥（SU）处理的土壤硝态氮累积量比尿素（U）处理和缓释氮肥（S）处理分别平均减少21.2%和9.5%，尿素掺混缓释氮肥（SU）处理土壤硝态氮含量主要分布在0—40 cm土层，不仅促进玉米的吸收，更减少土壤氮素向更深土层的淋失，提高耕作层的土壤养分。【结论】尿素与缓释氮肥掺混，施氮量180 kg·hm^-2是试验区玉米高效生产的最佳施氮量。

减量施磷对温室菜地土壤磷素积累、迁移与利用的影响

李若楠，武雪萍，张彦才，王丽英，翟凤芝，陈丽莉，史建硕, 徐强胜, 黄绍文

中国农业科学. 2017, 50(20): 3944-3952. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.20.010

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【目的】针对过量施磷问题，定位研究日光温室蔬菜生产磷肥减施潜力，明确适宜施磷范围。【方法】以北方温室蔬菜主栽种类黄瓜和番茄为研究对象，采用冬春茬黄瓜-秋冬茬番茄种植模式，在基础土壤有效磷（Olsen-P）40.2 mg·kg^-1下，设计不施磷肥（P₀）、减量施磷（P₁）和农民常规施磷量（P₂）3个磷肥用量水平。P₀、P₁、P₂处理对应黄瓜单季施磷肥（P₂O₅） 0、300、675 kg·hm^-2，番茄单季施磷肥（P₂O₅） 0、225、675 kg·hm^-2。3年6季定位研究蔬菜生产磷素盈亏、土壤有效磷供应与迁移，分析产量变化，推荐合理施磷范围。【结果】（1）农民常规施磷量年盈余磷 480.0 kg P·hm^-2·a^-1，每盈余磷 100 kg P·hm^-2主根区0—20 cm土层Olsen-P增加2.7 mg·kg^-1，3年0—20 cm土层Olsen-P平均含量70.2 mg·kg^-1，2010年番茄季0—20 cm土层磷素饱和度（DPS_M3）为80%，磷素土壤深层迁移明显。（2）减量施磷较农民常规磷量下降61.1%，3年磷素盈余量下降71.0%—77.3%，0—20 cm土层Olsen-P含量下降18.6%—43.5%，3年均值为49.3 mg·kg^-1，接近瓜果类蔬菜Olsen-P农学阈值，关键生育期磷素吸收量无显著变化，产量保持在中高水平不降低；经过3年种植，0—20 cm土层DPS_M3下降21个百分点，20—60 cm土层Olsen-P平均含量下降9.3%—30.1%，减施磷肥有效缓解了土壤磷素深层迁移。（3）不施磷肥导致土壤磷素亏缺，蔬菜从土壤中每攫取磷 100 kg P·hm^-2，P₀处理0—20 cm土层Olsen-P含量下降3.4 mg·kg^-1，3年0—20 cm土层Olsen-P平均含量30.5 mg·kg^-1，虽产量没有显著降低，但是2008年番茄高产下（140 t·hm^-2）磷素吸收量较P₁、P₂处理下降19.8%—30.0%，产量呈降低趋势。（4）依据上述推荐：土壤有效磷含量≥40 mg·kg^-1的温室，冬春茬黄瓜产量水平170 t·hm^-2下施用P₂O₅不宜超过300 kg·hm^-2，秋冬茬番茄产量水平100 t·hm^-2下施用P₂O₅不宜超过225 kg·hm^-2。【结论】华北平原温室蔬菜生产减施磷肥潜力较大。对于种植一段时间（≥3年）的温室，较农民常规减施磷60%，可以显著改善磷素盈余状况，缓解土壤有效磷积累，降低土壤磷素深层迁移量，保证黄瓜番茄持续中高产水平生产。

关中-天水经济区生态系统固碳服务空间流动及格局优化

李婷，李晶，王彦泽，曾莉

中国农业科学. 2017, 50(20): 3953-3969. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.20.011

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【目的】量化区域生态系统固碳服务（以下简称“固碳服务”）的供需平衡状况，模拟固碳服务的空间流动，揭示区域固碳服务功能转变的空间规律，并据此给出区域固碳空间布局优化策略，为引导区域的低碳发展提供直观的科学参考。【方法】通过多源数据融合模型模拟人口空间密度，进而估算关中-天水经济区生态系统固碳服务需求量；使用CASA模型计算研究区生物碳库的固碳服务供给量，在此基础上结合遥感碳循环过程模型估算土壤碳库的固碳服务供给量；使用流动比率量化区域固碳服务的供需平衡状况，以空间可视化的方式梳理固碳服务从供给区到受益区的流动过程；基于贝叶斯原理计算环境变量对固碳服务供给的状态条件概率，将其可视化表达为条件概率像素图，通过熵减模型筛选关键变量，利用关键因子最优状态子集分布探讨固碳格局的不确定性，并给出固碳空间布局优化策略。【结果】（1）研究区固碳服务总体上供大于求，供需平衡空间差异明显，需求的高值区主要分布在关中平原的人口高度聚集区，供给的高值区则主要沿秦岭山脉和北山山系分布。（2）根据流动比率分布，研究区大致可分为三大碳源集聚中心：以天水市区为中心的碳源集聚中心（R_i >0.04），以彬县为中心的碳源集聚中心（R_i >0.04），以及以最高值西安市为中心的多级碳源集聚中心（R_i>0.20）。其空间流动则可分为四组供需对应区域：秦岭中段、东段及北山的永寿县等流向以西安市为中心的关中城市群，秦岭西段流向天水市，麟游县、旬邑县等流向彬县，铜川市、澄城县、华县等流向蒲城县。（3）根据条件概率和熵减度计算，研究区可取{DEM=3, PET=1}作为生物碳库的关键变量最优状态子集，该子集主要分布在宝鸡市南部秦岭山脉和天水市西南角，该区域中生物固碳状态为最优的概率可以达到54.36%；取{NPP=3, DEM=3}作为土壤碳库的关键变量最优状态子集，该子集主要分布在秦岭山脉沿线、天水市西南角和咸阳市东北角，这些区域中土壤固碳状态为最优的概率高达92.84%。与现有固碳格局对比得出，生物碳库的适宜优化区主要分布在天水市武山县和秦州区，土壤碳库的适宜优化区主要分布在秦岭中段各区县。【结论】研究区固碳服务总体上需求小于供给，区域内存在较明显的固碳服务空间流动，未来的固碳格局优化中以天水和秦岭中段作为固碳功能优化的主要区域，能够得到良好固碳格局优化成效的概率较大。

基于转录组分析苹果水杨酸特异响应基因MdWRKY40的启动子鉴定

邱化荣，周茜茜，何晓文，张宗营，张世忠，陈学森，吴树敬

中国农业科学. 2017, 50(20): 3970-3990. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.20.012

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【目的】探明水杨酸（SA）对苹果叶片基因转录调控的影响，鉴定SA信号途径及其调控基因，为研究SA介导的抗病分子机制提供理论依据。【方法】生长30 d的‘嘎啦’组培苗叶片用2 mmol?L-1 水杨酸（SA）处理12 h，以CTRL（0.2%乙醇）处理作为对照，利用Illumina HiSeqTM 2000进行转录组测序，通过综合的生物信息学分析（差异基因筛选、条件特异性分析、GO分类及KEGG富集分析等）筛选SA信号途径的调控基因。克隆受SA特异性诱导表达基因的启动子，利用苹果细胞原生质体转化技术，进行启动子活性鉴定，确定对SA进行特异性响应的核苷酸序列。【结果】CTRL和SA处理分别获得750 439 459 bp和751 596 153 bp的原始数据，分别有44.77%和43.88%与‘金冠’苹果基因组完全匹配。获得3 329个显著性差异基因，包括苯丙烷类、类黄酮等次生代谢物生物合成途径的相关基因（如木质素合成关键酶CAD、细胞色素P450、真菌抗性相关的β-1,3-葡聚糖酶等），调控植物病原菌互作途径重要功能基因（钙调蛋白CaM、抗病蛋白RPM1、热激蛋白HSP90、WRKY转录因子等）以及33个条件特异性诱导表达基因（NAC转录因子、NIMIN1、WRKY40、ERF转录因子等）。其中1 085个基因上调，2 244个基因下调。差异基因主要涉及细胞过程、代谢过程和基因绑定、催化活性等；根据转录组学的结果，将SA响应基因MdWRKY40的启动子序列克隆到含有荧光素酶基因的表达载体中，置于荧光素酶基因的上游，转化苹果原生质体细胞。SA处理的原生质体细胞，荧光素酶的活性为未经SA处理的20.6倍，而脱落酸（ABA）、茉莉酸（JA）、1-氨基环丙烷羧酸（ACC）对荧光素酶的活性没有影响，说明该启动子为苹果中对SA进行特异性响应的启动子序列。不同区段的启动子片段对SA响应能力不同，从MdWRKY40翻译起始位点ATG向上游500—1 000 bp只能响应高浓度SA，而对低浓度SA不具有响应能力，1 500 bp片段对高浓度SA响应能力进一步显著增强，对低浓度SA响应也有微弱提高；而长度为2 000 bp的核苷酸片段无论对高浓度SA还是对低浓度SA都具有显著响应能力，且达到最强。与2 000 bp片段相比，2 500 bp的核苷酸片段没有进一步增强启动子片段对SA的响应能力。超表达MdWRKY40蛋白对其自身的转录具有抑制作用。【结论】2 mmol·L^-1 SA处理所影响的基因主要参与了苯丙烷类、类黄酮的生物合成，植物病原菌互作及植物激素信号转导途径。位于MdWRKY40开放阅读框上游的2 500 bp核苷酸序列，为对SA进行特异性响应的核苷酸启动子序列。在1 000—1 500 bp及1 500—2 000 bp具有显著提高启动子对SA敏感性的未知核苷酸序列，另外，MdWRKY40转录调控存在反馈抑制机制。

基于转录组信息的黑果枸杞MYB转录因子家族分析

严莉，王翠平，陈建伟，乔改霞，李健

中国农业科学. 2017, 50(20): 3991-4002. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.20.013

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【目的】MYB基因家族是植物中最大的一类转录因子家族，广泛参与植物的生长发育和代谢调控过程。目前仍没有针对枸杞等木本作物MYB转录因子家族的系统分析。基于转录组数据鉴定分析黑果枸杞MYB基因家族，可为该类基因生物学功能和代谢调控机制的研究提供参考。【方法】基于黑果枸杞转录组测序（RNA-Seq）数据，利用NR、NT、Swiss-Prot和PFAM 4个数据库和NCBI网站，对黑果枸杞MYB基因进行筛选注释；利用Web Logo3、Prot Comp 9.0、MEGA5.0软件进行保守结构域、亚细胞定位和系统进化等生物信息学分析。基于转录组数据分析MYB基因在黑果枸杞果实不同发育期的差异表达模式，并采用荧光定量PCR方法进行验证。【结果】基于转录组测序数据，注释得到83个黑果枸杞MYB类转录因子基因，根据结构特性将其分为4大类：R2R3-MYB、1R-MYB、3R-MYB和4R-MYB。结构域分析表明：R2R3-MYB类转录因子的R2 MYB基序中包含3个极度保守的色氨酸残基，R3 MYB基序中的第一个色氨酸残基被疏水氨基酸替代。比较分析黑果枸杞MYB家族和拟南芥MYB家族共同构建的进化树发现，黑果枸杞的MYB家族在进化上包括3个大类，6个亚类。亚细胞定位预测结果显示，44个MYB转录因子定位于细胞质中，37个定位于细胞核中。基于转录组数据的MYB差异表达模式分析表明，黑果枸杞MYB基因可能参与了果实不同发育时期花青素变化的调控；基于荧光定量PCR的差异表达数据进一步验证了部分MYB转录因子在果实不同发育时期的花青素合成中可能起到调控作用。【结论】黑果枸杞MYB基因家族注释得到83个黑果枸杞MYB类转录因子基因，为进一步研究MYB家族的基因结构和生物学功能奠定了基础。

采后ABA处理促进‘陇薯3号’马铃薯块茎愈伤形成

李雪，吴觉天，王毅，姜红，毕阳，司敏，张静荣，徐洁

中国农业科学. 2017, 50(20): 4003-4011. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.20.014

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【目的】研究外源ABA处理对采后‘陇薯3号’马铃薯块茎愈伤效果的影响，分析苯丙烷代谢及抗氧化酶在愈伤中的作用机理。【方法】以‘陇薯3号’马铃薯块茎为试材，人工损伤后用不同浓度脱落酸（ABA）处理，评价处理块茎在常温（（20±3）℃，湿度（80±5）%）及黑暗条件下的愈伤效果，分析100 mg·L^-1ABA处理后块茎伤口处组织苯丙烷代谢关键酶活性和代谢产物积累以及过氧化物酶和多酚氧化酶的活性变化，扫描电镜观察伤口处愈伤组织的形成过程.【结果】不同浓度ABA处理均有效促进了块茎愈伤，其中以100 mg·L^-1的处理效果最好。ABA处理能显著提高块茎伤口处组织苯丙氨酸解氨酶、肉桂酸羟化酶、4-香豆酰-辅酶A-连接酶和肉桂醇脱氢酶的活性，并能使总酚、类黄酮和木质素的含量增加，其中，苯丙氨酸解氨酶的活性呈现双峰型变化，在处理后的第3天和第9天分别高出同期对照253.07%和125.18%。此外，总酚和类黄酮含量在处理后第6天分别较同期对照高出48.60%和50.42%。ABA处理还明显增强了块茎伤口处组织中的过氧化物酶和多酚氧化酶活性。扫描电镜观察结果表明，ABA处理促进了块茎伤口表面愈伤封闭层和周皮的形成。【结论】外源ABA处理可通过促进马铃薯块茎伤口处组织的苯丙烷代谢，提高过氧化物酶和多酚氧化酶活性，加速马铃薯块茎愈伤周皮的形成。

不同载体预混合饲料中维生素E近红外光谱模型

王燕妮，陈玉艳，查珊珊，王石，肖志明，李守学，樊霞

中国农业科学. 2017, 50(20): 4012-4020. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.20.015

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【目的】维生素E是重要饲料添加剂，其含量的准确测定对饲粮配制具有重要意义。文章探讨了不同载体稀释剂预混合饲料中维生素E的快速定量方法，旨在说明近红外光谱分析方法对不同载体预混合饲料的适用性，对日后建立预混合饲料中维生素含量的近红外速测方法提供参考。【方法】采集商品维生素E粉剂，以市场上常见的二氧化硅、脱脂米糠和石粉为载体稀释剂，通过混匀机混匀配制了浓度范围为5—250 IU·g^-1的维生素E预混合饲料，并采集其近红外光谱。研究比较了不同扫描次数和分辨率对近红外光谱质量的影响，比较了不同载体稀释剂预混合饲料中维生素E的特征峰及不同光谱预处理方式下维生素E偏最小二乘回归模型的定量精度，并从PLS模型中的VIP Score值的角度来分析模型的差异性。【结果】16 cm^-1分辨率和32次扫描次数为适宜的光谱采集参数；不同载体稀释剂预混合饲料的近红外光谱差异明显，二氧化硅、脱脂米糠和石粉为载体的预混合饲料维生素E主要特征吸收峰不同，分别位于8 700—8 200、7 100—7 450、6 020—5 550、4 440—4 200、5 210—4 760，8 550—8 050、7 410、5 950—5 200、4 400—4 050、4 750—4 600 cm^-1和8 550—8 050、7 250、5 950—5 200、4 600—4 000、4 800—4 700 cm^-1其近红外定量模型的最佳光谱预处理方法分别为SNV+1stDeriv.（2，15）、MSC+1stDeriv（2，21）和SNV+2stDeriv（2，15），其校正决定系数（R_c²）分别为0.988，0.949和0.941，校正集标准偏差（SEC）分别为7.64，14.66和16.16；验证决定系数（R_p²）分别为0.989，0.980和0.921，预测标准偏差（SEP）分别为8.86，10.36和23.37，RPD值分别为8.10，6.90和3.07。提取与3种不同载体稀释剂混合后的维生素E的PLS模型VIP Score值，以二氧化硅为载体的模型提取到的贡献显著且与维生素E特征峰相关的VIP Score值最多，脱脂米糠次之，石粉最少。【结论】近红外光谱检测技术对于以二氧化硅和脱脂米糠为载体的预混合饲料的适用性较好，以石粉为载体的预混合饲料的适用性较差。

肌注氟苯尼考在鸭疫里氏杆菌感染鸭体内的药动学特征

梅献，万鹏，韩东东，裴鹏飞，曾庆林，李晓虹，曾振灵

中国农业科学. 2017, 50(20): 4021-4027. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.20.016

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【目的】研究并比较肌注氟苯尼考在2周龄健康和鸭疫里氏杆菌感染鸭体内的药代动力学特征。【方法】240只鸭随机分为2组，各120只鸭，其中一组用鸭疫里氏杆菌腿部感染，分别以30 mg·kg^-1体重单剂量肌内注射氟苯尼考，采血点为给药前和给药后5、10、15、20、30、45 min和1、1.5、2、4、8、10、14 h。采用高效液相色谱法 (HPLC) 测定血浆氟苯尼考的浓度，采用紫外检测器检测，检测波长为223 nm，流动相为乙腈和水，其体积比为26和74 ，流速为1 mL·min^-1，色谱柱为Agilent C18 (4.6 mm×150 mm，5 μm)，进样量为20 μL。药动学分析软件 WinNonlin 5.2.1以非房室模型拟合处理血药浓度-时间数据，计算相关的药动学参数，并用统计学软件SPSS17.0对药动学参数进行t检验统计学分析。【结果】氟苯尼考在健康鸭体内的峰浓度(Cmax)为(22.88±3.11) μg·mL^-1，表观分布容积(Vd/F)为(2.39±0.81) L·kg^-1，体清除率(Cl_B/F)为(0.64±0.11) L·h^-1·kg^-1，消除半衰期(t_1/2_β)为 (2.57±0.51) h和药时曲线下面积(AUC)为(47.28±7.87) μg·mL^-1·h;氟苯尼考在感染鸭体内的峰浓度(C_max)为(19.77±1.82) μg·mL^-1，表观分布容积(Vd/F)为(2.44±0.46) L·kg^-1，体清除率(Cl_B/F)为(0.63±0.08) L·h^-1·kg^-1，消除半衰期(t_1/2_β)为(2.74±0.54) h和药时曲线下面积(AUC)为(48.11±6.62) μg·mL^-1·h 。统计分析氟苯尼考在健康鸭和感染鸭的药动学参数，结果表明，除了C_max差异显著(P<0.05)，其他参数差异均不显著(P>0.05)。【结论】两者的主要药动学参数相比较，感染鸭体内的C_max显著低于(P<0.05)健康鸭体内的C_max，其他参数无显著性差异。氟苯尼考以30 mg·kg^-1体重肌内注射在健康和感染鸭体内具有吸收迅速，峰浓度高,体内分布广泛，消除较快的特点。

杆状病毒LEF-11蛋白自身相互作用关键区域的鉴定

蒋亚明，董战旗，陈婷婷，胡楠，董非凡，黄亮，唐良彤，潘敏慧

中国农业科学. 2017, 50(20): 4028-4035. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.20.017

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【目的】家蚕核型多角体病毒（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus，BmNPV）是蚕业上最常见且危害最为严重的病原微生物之一，其晚期表达因子（late expression factor，lef）LEF-11对病毒的增殖具有重要作用，相关研究证明LEF-11蛋白能够发生自身相互作用形成寡聚体，本研究通过逐步截短探究LEF-11蛋白自身相互作用的关键区域。【方法】利用双分子荧光互补（bimolecular fluorescence complementation）技术和荧光定位（fluorescent co-location）技术，首先根据BmNVP lef-11及各个截短片段序列和荧光蛋白序列设计引物，通过PCR技术扩增回收得到所有片段以及荧光标签片段，并且通过限制性内切酶处理回收后，将荧光标签片段分别连接到昆虫细胞表达载体pIZ/V5-His上，构建pIZ-DsRed和pIZ-EGFP质粒，然后用相同方法构建LEF-11全长和逐步截短的LEF-11红色荧光融合蛋白载体，分别与pIZ-LEF11-GFP共同转染到家蚕BmN-SWU1细胞中，更换普通培养基48 h后固定细胞并制片，最后在荧光共聚焦显微镜下观察荧光融合蛋白表达及定位情况，鉴定LEF-11蛋白自身相互作用的关键区域；荧光双分子互补试验相关载体的构建步骤与荧光融合表达载体构建方法一致，转染处理及荧光观察方法也相同。【结果】杆状病毒LEF-11蛋白2—61和62—112端均能与LEF-11蛋白全长发生相互作用，分别共定位于细胞质和细胞核；逐步截短过程中，LEF-11蛋白N-端2—61、12—61、22—61、32—61、42—61和2—51均能与LEF-11蛋白全长共同定位于细胞质中，但其52—61、2—41未发生共定位；C-端截短片段能够与LEF-11蛋白全长发生共定位的有62—112、72—112、82—112、72—101和72—91，但92—112和72—81区域未发现共定位现象；双分子荧光互补试验结果验证LEF-11蛋白N-端片段与LEF-11蛋白全长相互作用的有2—61、12—61、22—61、32—61、42—61、2—51，而2—41、52—61截短突变体则不能，与N-端片段荧光共定位结果保持一致。【结论】鉴定到了杆状病毒LEF-11蛋白的42-51和82-91区域为其自身相互作用关键区域，可用于LEF-11相关功能研究。

咯菌腈对四种牡丹叶片病原真菌的抑制活性

徐建强，平忠良，刘莹，马世闯，许道超，杨岚，郑伟，刘圣明，夏彦飞，林晓民

中国农业科学. 2017, 50(20): 4036-4045. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.20.018

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【目的】探究咯菌腈对牡丹黑斑病菌（Alternaria suffruticosae）、黄斑病菌（Phyllosticta commonsii）、腔孢叶斑病菌（Hainesia lythri）和叶霉病菌（Cladosporium paeoniae）菌丝生长、孢子萌发、芽管伸长及产孢的抑制活性，分析咯菌腈在牡丹病害化学防治上的应用前景。【方法】采用菌丝生长速率法测定咯菌腈对菌丝生长的抑制活性，采用涂布平板法测定咯菌腈对孢子萌发、产孢时间及产孢量、芽管伸长及芽管和孢子形态的影响。【结果】咯菌腈对腔孢叶斑病菌菌丝生长的抑制作用最强，EC₅₀为0.01 μg·mL^-1，其次为黑斑病菌和黄斑病菌，分别为0.07和0.35 μg·mL^-1；咯菌腈对4种病菌的孢子萌发均有较强的抑制作用，对腔孢叶斑病菌的抑制作用最强，其EC₅₀为1.26 μg·mL^-1，对其他3种病菌孢子萌发的EC₅₀在3.27—3.45 μg·mL^-1；0.1 μg·mL^-1咯菌腈对4种病菌分生孢子芽管伸长的抑制率在40%—70%，表明咯菌腈对4种病菌分生孢子芽管伸长均有明显的抑制作用，浓度越大抑制作用越强，各浓度间差异显著，其中对腔孢叶斑病菌芽管伸长抑制的EC₅₀为0.04 μg·mL^-1，抑制作用最强，对其他3种病菌芽管伸长的EC₅₀在0.08—0.22 μg·mL^-1；咯菌腈对黑斑病菌和黄斑病菌分生孢子和芽管的致畸作用强烈，可导致孢子及芽管膨大、过度分枝，而对叶霉病菌和腔孢叶斑病菌致畸作用较弱，芽管及孢子形态基本正常；咯菌腈可推迟黑斑病菌、黄斑病菌及叶霉病菌的产孢时间，对黑斑病菌产孢量的抑制作用最强，EC₅₀为0.05 μg·mL^-1，对叶霉病菌次之，EC₅₀为0.38 μg·mL^-1，但对腔孢叶斑病菌产孢有促进作用。【结论】咯菌腈对牡丹黑斑病菌及腔孢叶斑病菌的菌丝生长、孢子萌发及芽管伸长均有很强的抑制作用，但对腔孢叶斑产孢具有一定的促进作用；对叶霉病菌和黄斑病菌孢子萌发及芽管伸长、黄斑病菌菌丝生长及叶霉病菌产孢的抑制作用强烈；由于咯菌腈内吸活性较弱，无法抑制已侵入牡丹叶片的病原真菌的生长，故建议作为保护剂在病害发生前施用。

番红花种球中虎眼万年青花叶病毒的分子鉴定与序列分析

廖富荣，林武镇，陈细红，陈青，陈红运，黄蓬英，方志鹏，吴媛，沈建国，林石明

中国农业科学. 2017, 50(20): 4046-4054. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.20.019

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【目的】对一批荷兰进境番红花种球（Crocus sativus）进行病毒鉴定，以防止危险性病毒传入危害。【方法】根据已报道的马铃薯Y病毒科（Potyviridae）通用引物(Sprimer和M4T)，采用RT-PCR方法对一批番红花种球样品进行检测，取其中一个RT-PCR产物进行克隆测序，利用GenBank上的基本局部比对搜索工具（Basic Local Alignment Search Tool，BLAST）和MEGA 6中的基于对数期望的多重序列比较（Multiple Sequence Comparison by Log-Expectation，MUSCLE）进行序列比对分析，并根据外壳蛋白基因（coat protein，CP）序列利用最大似然法（maximum likelihood method）进行系统发育分析。【结果】RT-PCR检测结果显示该批样品扩增到一条约1.7 kb的预期大小片段，说明该批番红花种球样品中存在Potyviridae科病毒。测序获得长度为1 666 bp的序列（命名为2677-NL），含有部分核内含体b基因（nuclear inclusion b，NIb）、完整的CP和3′端非编码区（3′-UTR），其核苷酸序列与虎眼万年青花叶病毒（Ornithogalum mosaic virus，OrMV）的SW3.3分离物具有最高序列一致性（99.6%），与OrMV参考基因组序列（Reference genomic sequences，RefSeq；NC_019409）的序列一致性为99.1%。该分离物的CP与6个OrMV印度分离物（JQ686722、JQ686720、JN692498、JN692497、JN692496、JF682235）的核苷酸和氨基酸序列一致性分别为71.5%—77.3%和65.7%—79.7%，与其他32个OrMV分离物的核苷酸和氨基酸序列一致性分别为77.9%—99.5%和82.9%—99.2%。基于CP进行的系统发育分析表明，OrMV可分为两个类群，而2677-NL与5个澳大利亚分离物（JQ807995、JQ807996、NC_019409、AF185964、AF185965）相聚成簇，表明其在系统发育关系上与OrMV澳大利亚分离物的亲缘关系最近。【结论】根据国际病毒分类委员会（ICTV）关于Potyviridae科病毒种类的分类标准，2677-NL为OrMV的一个分离物，证实该批番红花种球受到OrMV的侵染。这是世界上首次在番红花中发现OrMV的报道。

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