当期目录

2015年 第48卷 第24期 刊出日期：2015-12-16

  

作物遗传育种·种质资源·分子遗传学

水稻粒厚主效位点qGT8精细定位和候选基因分析

高方远，罗正良，任鄄胜，吴贤婷，陆贤军，苏相文，吕建群，任光俊

中国农业科学. 2015, 48(24):  4859-4871.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.24.001

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【目的】在已鉴定的稻谷粒长、粒宽和粒厚QTL的基础上，对控制粒厚的主效QTL进行精细定位和候选基因分析，以解析川106B（C-106B）细长粒形的遗传基础，为进一步通过分子技术改良其产量水平提供科学依据。【方法】以细长粒形的优质籼稻保持系川106B与籽粒较宽厚的籼稻保持系川345B（C-345B）杂交，构建包含182个单株的F2群体，采用QTL Catographer v2.5软件基于复合区间作图法发掘与稻谷粒形性状相关的QTL；进一步从BC₃F₂群体筛选隐性单株（稻谷厚度较薄）对粒厚主效QTL（qGT8）进行精细定位，并对候选基因进行测序和荧光定量PCR分析。分别构建qGT8位点携带川106B等位基因的近等基因系（NIL-gt8^C-106B）和携带川345B等位基因的近等基因系（NIL-GT8^C-345B）并调查其稻米外观品质及产量性状。【结果】川106B和川345B的粒长、粒宽和粒厚表型存在显著差异。利用F₂群体检测到2个粒长QTL、3个粒宽QTL和3个粒厚QTL，其中，位于第7染色体区间RM21892—RM3589的粒长主效QTL（qGL7）可解释粒长变异的68.23%，川106B等位基因在该位点可增加粒长0.47 mm。控制稻谷粒宽和粒厚的主效QTL（qGW8和qGT8）位于第8染色体上相同区间RM6070—RM447，分别解释相应表型变异的26.48%和34.89%，增加粒宽或粒厚的等位基因均来自于川345B。利用1 732个BC₃F₂隐性单株，将粒厚主效位点qGT8精细定位在标记SG930和SG950间的11.2 kb区段，该区段仅包含1个注释基因LOC_os08g41940（OsSPL16）。对该基因测序分析发现，川106B和川345B在起始密码子ATG上游2 kb区段存在7个差异位点，在编码区有5个多态性位点，其中，川106B在第3外显子插入2 bp（c.1006_1007 插入CT）引起移码突变，且位于qGT8的OsmiR156结合位点，推测为川106B籽粒厚度变薄、宽度变细的关键位点。实时荧光定量PCR分析发现，qGT8在幼穗中表达量较高，且在川106B和川345B中的表达方式相似，表达量在1—8 cm长幼穗发育时期随幼穗发育逐渐增加，8 cm时达到最高，之后随幼穗发育逐渐降低，但2个亲本在各时期的表达水平存在差异。近等基因系NIL-GT8^C-345B的粒厚、粒宽、千粒重、单株产量和垩白粒率显著高于NIL-gt8^C-106B，而粒长、透明度、株高、单株有效穗数、穗长、每穗实粒数、结实率和播抽期与NIL-gt8^C-106B相当。【结论】控制粒长的主效QTL（qGL7）位于第7染色体区间RM21892—RM3589，控制粒宽和粒厚的主效QTL位于第8染色体的相同区间RM6070—RM447。粒厚主效QTL（qGT8）被精细定位在仅包含GW8的片段上，是控制粒形和产量的关键基因，但在近等基因系中高粒重与高垩白紧密连锁，表明该位点存在高产与外观品质改良的矛盾。

棉花GhGT-2转录因子的克隆及其功能分析

李月，刘晓东，谢宗铭，董永梅，武冬梅，陈受宜

中国农业科学. 2015, 48(24):  4872-4884.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.24.002

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【目的】棉花是重要的纤维作物，其生长常遭受非生物逆境危害，严重影响棉花的生长和产量。Trihelix转录因子在植物抵御各种逆境胁迫中扮演重要作用。克隆棉花Trihelix转录因子基因并分析其表达特性和功能，为最终利用转基因手段改良棉花抗逆性奠定基础。【方法】通过BLAST分析比对，从棉花EST数据库中获得1个高度同源基因，通过基因序列分析，发现其属于Trihelix转录因子GT-2亚家族，命名为GhGT-2。以棉花叶片总RNA为模板，根据EST序列设计引物，利用RT-PCR结合RACE技术，获得GhGT-2的编码序列。使用MEGA5对蛋白序列及其同源序列进行多序列比对分析，并构建同源物种间系统进化树，通过SMART网站（http://smart.embl- heidelberg.de/）进行蛋白结构预测。以陆地棉品种新陆早26号为研究材料，在棉花15 d苗龄时（一对真叶期），分别对其植株进行非生物胁迫和ABA处理0、1、3、6和12 h，然后采集相应时段棉苗叶片。另外采集同一品种棉花的不同发育时期的根、茎、叶、花、开花后当天胚珠以及开花后12 d（12 days post anthesis，DPA）纤维等不同组织样品，利用实时荧光定量PCR方法分析GhGT-2在棉花不同组织间的表达差异及其在低温、干旱、高盐和ABA处理下的表达模式。将GhGT-2克隆至GFP表达载体pBI221，和GAL4 DNA结合结构域载体，在拟南芥原生质体中验证GhGT-2在细胞内的定位情况和转录激活活性。利用凝胶迁移试验（EMSA）检测DNA结合元件。【结果】克隆了棉花GhGT-2的cDNA全长序列。该基因cDNA全长1 579 bp，开放阅读框为1 428 bp，编码475个氨基酸的蛋白，推导编码蛋白质的分子量为54.07 kD，等电点为8.96。SMART蛋白结构预测发现，该蛋白含有2个Trihelix家族典型的SANT蛋白结合域。系统进化树分析表明，GhGT-2属于Trihelix转录因子GT-2亚家族，与拟南芥AtGTL1、白杨PtaGTL1 GT2-Box、GT3-Box、GT-1b（BoxⅡ）和MYB元件MBS1、MRE1、MRE3、MRE4亲缘关系最近。实时荧光定量PCR表明，GhGT-2在棉花的根、茎、叶、花、开花后当天胚珠以及开花后12 d（12 DPA）纤维中均有表达，其中，在叶中表达量最高，在根中表达量最低。在冷胁迫下，GhGT-2除在3 h时表达量接近0 h外，在1、6和12 h的表达量均低于0 h，呈现抑制表达特征。在高盐、干旱和ABA处理3种胁迫下，GhGT-2在1 h的表达量均低于0 h，但3、6和12 h的表达量均高于0 h，表现为先抑制后上调表达特征。推测该基因可能参与棉花ABA信号通路中对逆境胁迫的抗性反应。利用拟南芥原生质体分析，GhGT-2主要定位于细胞核中，转录激活活性不明显。凝胶阻滞（EMSA）分析发现，GhGT-2可以结合GT元件。【结论】获得棉花GhGT-2的全长cDNA序列，其编码蛋白含有2个SANT蛋白结合域，属于棉花Trihelix转录因子GT-2亚家族。在干旱、高盐和ABA逆境胁迫下，GhGT-2属于依赖于ABA胁迫响应基因调控网络，推测GhGT-2在陆地棉的非生物胁迫适应过程中可能具有重要的作用。

甘蓝型油菜与AⁿAⁿCⁿCⁿC^oC^o六倍体的可交配性及杂交种菌核病抗性

刘瑶，丁一娟，汪雷，万华方，梅家琴，钱伟

中国农业科学. 2015, 48(24):  4885-4891.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.24.003

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【目的】利用甘蓝与甘蓝型油菜的六倍体杂交种为桥梁与甘蓝型油菜回交，从回交种的自交后代中选育理想的甘蓝型油菜个体，是将甘蓝遗传成分转入甘蓝型油菜的一种新策略。调查多份甘蓝型油菜与六倍体的可交配性及杂交种后代的育性，并以油菜菌核病抗性为例，以验证该策略在甘蓝型油菜遗传改良中的应用潜力。【方法】用菌核病抗性较强的野生甘蓝与甘蓝型油菜中双9号进行种间远缘杂交，采用胚挽救及染色体加倍技术创建AⁿAⁿCⁿCⁿC^oC^o六倍体。通过调查六倍体与9份甘蓝型油菜的杂交结实率，分析六倍体与甘蓝型油菜的可交配性。通过调查六倍体与9份甘蓝型油菜的杂交种F₁的自交、自由授粉结实率和菌核病抗性水平，反映杂交种F₁代的结实能力以及目标性状的改良情况。【结果】经鉴定，六倍体含有20条A基因组染色体和36条C基因组染色体，即染色体组成为AⁿAⁿCⁿCⁿC^oC^o。该六倍体同时具有甘蓝亲本和甘蓝型油菜亲本中双9号的遗传物质，其自交结实率和自由授粉结实率分别为5.6和8.6粒/角。六倍体与9份甘蓝型油菜杂交的结角率在69.1%—92.9%，每角粒数介于4.7—10.5，不同基因型的甘蓝型油菜与六倍体杂交结果率和每角粒数均存在显著差异（P＜0.01）。所调查的9份杂交种F₁的花粉育性达到正常水平，但自交结实率和自由授粉结实率分别为11.4—20.7粒和19.9—26.1粒，基因型间均存在显著差异（P＜0.0001），自交结实率和自由授粉结实率之间相关性显著（r = 0.67*，P＜0.05）。综合2013和2014年的茎秆菌核病抗性鉴定数据，六倍体相对于中双9号的相对感病度为0.47，9份甘蓝型油菜的相对感病度在0.94—1.26，亲本基因型之间抗性水平差异显著（P＜0.0001）。9份杂交种F₁的相对感病度为0.56—1.10，均介于对应的双亲之间，且与甘蓝型油菜亲本的抗性水平显著相关（r = 0.78*, P＜0.05）。其中5份杂交种F₁的相对感病度显著低于对应的甘蓝型油菜亲本（P＜0.05），即其抗性水平相对于原甘蓝型油菜亲本获得明显提高。【结论】AⁿAⁿCⁿCⁿC^oC^o六倍体有一定的结实能力，与甘蓝型油菜的可交配性受油菜基因型显著影响，但均易获得具有较好（一定）结实性的杂交种后代，目标性状在杂交种一代获得显著改良。

耕作栽培·生理生化·农业信息技术

缓控释肥组配对机插常规粳稻群体物质生产和产量的影响

邢晓鸣，李小春，丁艳锋，王绍华，刘正辉，唐设，丁承强，李刚华，魏广彬

中国农业科学. 2015, 48(24):  4892-4902.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.24.004

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【目的】研究不同缓控释肥及施肥方式对机插常规粳稻群体光合物质生产和产量的影响。【方法】 2013—2014年在江苏省丹阳市延陵镇南京农业大学水稻试验基地进行，以当地常规粳稻武运粳24号进行机插种植，试验设置3种缓控释肥（掺混肥、4个月树脂尿素、硫包衣尿素）以及一次性施肥和一基一蘖两种施肥方式，共7个处理，分别为掺混肥的一次性基肥施用（B-BSRB）、4个月树脂尿素的一次性基肥施用（B-PCU）、硫包衣尿素的一次性基肥施用（B-SCU）、掺混肥的一基一蘖施用（BT-BSRB）、4个月树脂尿素的一基一蘖施用（BT-PCU）、硫包衣尿素的一基一蘖施用（BT-SCU）和当地高产施肥方式（CK）为对照，各处理的施氮量一致，磷钾肥用量均相同。【结果】水稻产量表现为掺混肥＞4个月树脂尿素＞硫包衣尿素，2年结果一致；一基一蘖施肥方式＞一次性施肥，掺混肥一基一蘖处理产量最高，2年产量分别为11.6 t·hm^-2和10.1 t·hm^-2，较常规高产施肥（CK）处理2年产量分别提高9.4%、12.2%。群体干物质重、叶面积指数、光合势均表现为掺混肥＞硫包衣尿素＞4个月树脂尿素；群体干物质重、叶面积指数和光合势均表现为一基一蘖施肥方式＞一次性施肥，2年结果一致。干物质积累量、群体生长率在拔节期表现为掺混肥＞硫包衣尿素＞4个月树脂尿素，但是在成熟期表现为掺混肥＞4个月树脂尿素＞硫包衣尿素，一基一蘖施肥方式＞一次性施肥。【结论】掺混肥在提高水稻群体干物质、叶面积指数、光合势及产量上优于4个月树脂包衣尿素和硫包衣尿素，一基一蘖施肥方式优于一次性施肥处理。与当地常规高产施肥相比，组配的掺混肥配合分蘖期速效氮肥的施用可以显著提高水稻群体的光合物质生产和产量。

喷施烯效唑对甜荞茎秆抗倒性能及产量的影响

刘星贝，吴东倩，汪灿，胡丹，杨浩，佘恒志，阮仁武，袁晓辉，易泽林

中国农业科学. 2015, 48(24):  4903-4915.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.24.005

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【目的】甜荞（Fagopyrum esculentum M.）被誉为21世纪人类的绿色食品之一。倒伏是制约甜荞产量和品质的重要因素。研究喷施不同浓度的烯效唑对甜荞茎秆抗倒性能的影响，为甜荞的抗倒伏栽培提供理论依据。【方法】试验于2013—2014年在西南大学歇马科研基地进行，采用随机区组设计，以中抗甜荞品种“宁荞1号”为试验材料，设置0（CK）、25 mg·L^-1（T1）、50 mg·L^-1（T2）、75 mg·L^-1（T3）和100 mg·L^-1（T4）5个烯效唑浓度处理，于4叶期按100 mL·m^-2进行叶面喷施。分别于开花期、灌浆期和成熟期对茎秆抗折力、倒伏指数、茎秆形态特性和茎秆解剖结构等指标进行测定分析，并于成熟期调查倒伏习性和产量。【结果】（1）茎秆抗折力、茎壁厚度和维管束面积从开花期至成熟期呈先增加后减小的变化趋势，在灌浆期达最大值；倒伏指数、株高、茎秆重心高度、茎秆鲜重、基部第2节间长、基部第2节间粗、机械组织厚度和维管束数目从开花期至成熟期逐渐增加；第2节间干重、节间充实度和机械组织层数从开花期至灌浆期逐渐增加，而后变化不明显。（2）产量、茎秆抗折力、基部第2节间粗、基部第2节间干重、节间充实度、机械组织层数、机械组织厚度、茎壁厚度、维管束数目和维管束面积在CK-T3处理浓度下表现为随浓度的增加而增加，在T3-T4处理浓度下表现为随浓度增加而降低；倒伏率、倒伏指数、株高、茎秆重心高度、茎秆鲜重、基部第2节间长在CK-T3处理浓度下表现为随浓度的增加而降低，在T3-T4处理浓度下表现为随浓度增加而增加。（3）与CK相比，T1、T2、T3和T4处理的产量分别增加了2.3%、6.5%、21.3%和11.3%，倒伏率分别降低了17.9%、40.7%、84.0%和60.5%。（4）不同烯效唑浓度处理间，茎秆抗折力、倒伏指数、茎秆形态特性和茎秆解剖结构均存在显著差异。产量与株高、茎秆重心高度、茎秆鲜重和基部第2节间长、倒伏指数及倒伏率呈极显著负相关，与基部茎秆第2节间粗、基部第2节间干重、节间充实度、机械组织层数、机械组织厚度、茎壁厚度、维管束数目和维管束面积及茎秆抗折力呈极显著正相关。茎秆抗折力、基部第2节间粗、基部第2节间干重、节间充实度、机械组织层数、机械组织厚度、茎壁厚度、维管束数目和维管束面积表现为T3＞T4＞T2＞T1＞CK，倒伏指数、株高、茎秆重心高度、茎秆鲜重和基部第2节间长表现为CK＞T1＞T2＞T4＞T3。【结论】本试验条件下，当烯效唑喷施浓度为75 mg·L^-1时，能有效优化甜荞茎秆结构，改善茎秆质量，减小倒伏发生风险，增加产量。研究结果为甜荞的抗倒伏栽培奠定了基础。

植物保护

咪唑乙烟酸对冀谷33生长发育的影响及对后茬作物的安全性

张婷，师志刚，王根平，程汝宏，陈媛，冀小绵，杨伟红

中国农业科学. 2015, 48(24):  4916-4923.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.24.006

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【目的】冀谷33是抗咪唑乙烟酸谷子（Setaria italica）品种，在生产实践中通过喷施咪唑乙烟酸除草剂可达到间苗、除草的目的，适应规模化、集约化种植。论文旨在通过研究咪唑乙烟酸对冀谷33生长发育的影响及对后茬作物的安全性，为冀谷33的应用和推广提供依据。【方法】试验于2013年5月至2015年6月在河北省农林科学院谷子研究所郄马试验站进行，试验设置0、56.25、75、112.5、150、225 g a.i./hm² 6种咪唑乙烟酸剂量水平。对冀谷33生长发育的影响试验在田间进行，用药后7、10、13、16、20、25和30 d，分别调查统计苗高和鲜重；成熟期调查株高、穗长和穗径，并统计小区产量；并对小米、谷壳、植株和土壤中的残留进行检测。对后茬作物的影响试验在网室进行，研究其药后30、60 d和药后1年播种的8种后茬作物白菜、冀谷19、冀谷33、甜菜、高粱、玉米、小麦、棉花的安全性。【结果】56.25—225 g a.i./hm²剂量下，冀谷33正常生长，无明显药害。药后不同时期对冀谷33苗高、鲜重的影响结果表明，喷药谷子苗高和鲜重与对照相比差异不显著；药后13—16 d处于拔节期初期，为苗高敏感期，药后20—25 d处于拔节期末期、孕穗期初期，为苗重敏感期，之后抑制逐渐解除，收获时冀谷33生长发育正常，产量高于对照。只有喷施225 g a.i./hm²咪唑乙烟酸的植株中检测到（0.01±0.006） mg·kg^-1少量残留，低于检测限LOQ，其余处理均未检出。随着咪唑乙烟酸施药时间的增长，对后茬作物的抑制作用有所减轻，在药后1年播种的后茬作物中，株高差异显著，仅对白菜、高粱产量有显著影响。在夏谷区喷施咪唑乙烟酸的田地，冀谷33可与玉米、小麦、棉花轮作种植。【结论】施用56.25—225 g a.i./hm²咪唑乙烟酸对冀谷33安全，对其生长发育和产量没有显著影响。随着咪唑乙烟酸施药时间的增长，对后茬作物的抑制作用有所减轻，冀谷33可与玉米、小麦、棉花轮作种植。在生产中，要注意控制药量，合理轮作。

中国主要茶区茶树炭疽菌系统发育学

王玉春，郝心愿，黄玉婷，岳川，王博，曹红利，王璐，王新超，杨亚军，肖斌

中国农业科学. 2015, 48(24):  4924-4935.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.24.007

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【目的】炭疽菌能够侵染茶树叶片并造成病叶干枯、脱落，论文旨在分离、鉴定中国主要茶区茶树炭疽病的病原菌，为茶树病害防治工作提供科学依据。【方法】利用单孢分离法对采自中国15省（市、自治区）茶区的茶树炭疽病病叶进行炭疽菌分离，并对其ITS、TUB2两个位点进行PCR扩增和测序，测序结果采用MEGA 6.0软件以邻接法（Neighbor-Joining，NJ）构建多基因位点系统发育树。对分离的菌株在马铃薯葡萄糖琼脂培养基（potato dextrose agar，PDA）上的形态特征进行描述。对龙井43和中茶108茶树品种叶片进行有伤和无伤处理后接种代表性菌株，测试其致病性。【结果】以茶树上分离的炭疽菌菌株的2个基因位点序列（ITS、TUB2）构建多基因位点系统发育树，Colletotrichum boninense CBS 123755作为外群，结果表明所有菌株聚为3支，其中45个菌株与C. camelliae聚为一族、28个与C. fructicola聚为一族、5个与C. siamense聚为一族，所有菌株均归属于C. gloeosporioides复合种，并且C. camelliae在中国茶区分布范围最广，为茶树炭疽菌的优势种。形态特征结果表明，C. camelliae在PDA培养基上生长速度平均11.8 mm·d^-1，菌落白色，气生菌丝致密，绒毛状，中央凸起，边缘整齐；菌核、刚毛未见；分生孢子梗、产孢细胞未见；分生孢子透明，光滑，圆柱状，两端钝圆或基部渐尖，（8—15）µm×（3—6）µm；菌丝附着胞褐色，棍棒状，不规则状，有分枝，（8—10.5）µm×（6.5—8）µm；分生孢子附着胞未见。C. fructicola在PDA培养基上生长速率平均6.76 mm·d^-1，菌落正面白色，背面中央褐色，边缘白色，气生菌丝致密，绒毛状；菌核、刚毛未见；分生孢子梗透明，有隔，具分枝，产孢细胞圆柱状，7—18 µm，顶端直径1—2 µm；分生孢子透明，圆柱状，两端钝圆，部分中部溢缩，（10—15）µm×（3—3.5）µm；菌丝附着胞深褐色，圆形，近圆形，不规则形，有分枝，（6.5—8）µm×（3.5—5.5）µm；分生孢子附着胞褐色或深褐色，圆形，（5—7）µm×（5—6.5）µm。C. siamense在PDA培养基上生长速率平均7.6 mm·d^-1，菌落白色，气生菌丝致密，绒毛状；菌核、刚毛未见；分生孢子梗透明，有隔，具分枝；产孢细胞圆柱状，8—16 µm，顶端直径1—2 µm；分生孢子透明，圆柱形，梭形，两端钝圆，部分中部有溢缩，（9.5—13.5）µm×（3—3.5）µm；菌丝附着胞深褐色，球形，棒状，不规则形，（5—8）µm×（3—5.5）µm。致病性测试结果表明，C. camelliae能侵染龙井43品种茶树有伤叶片，但对龙井43无伤叶片和中茶108有伤、无伤叶片无致病性，而C. fructicola和C. siamense 2个种对2个品种茶树有伤、无伤叶片均无致病性。【结论】基于系统发育学和形态学结合的方法对中国15省（市、自治区）部分茶区茶树病叶病原菌鉴定，基本明确C. camelliae为中国茶树炭疽菌优势种。

土壤肥料·节水灌溉·农业生态环境

低分子量有机酸对植烟土壤酶活性和细菌群落结构的影响

于会泳，宋晓丽，王树声，曹丽君，郭利，王晓丽，彭功银

中国农业科学. 2015, 48(24):  4936-4947.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.24.008

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【目的】土壤生物学性质是可反映土壤质量的重要指标，论文旨在阐明根系分泌物中的低分子量有机酸对土壤生物学性质的影响，为改善土壤质量提供科学依据。【方法】利用化学试剂模拟烟草根系分泌物中的6种低分子量有机酸进行室内培养试验。根据烟苗生长前期根系分泌有机酸的数量及前人研究结果，检测1、2和3 g·kg^-1（碳土比）3种浓度处理的6种有机酸（苯甲酸、肉桂酸、月桂酸、邻苯二甲酸、肉豆蔻酸和棕榈酸）25℃黑暗环境下培养植烟土壤30 d后对4种土壤酶活性（过氧化氢酶、碱性磷酸酶、脲酶和蔗糖酶）的影响并应用高通量测序方法检测6种低分子量有机酸的2 g·kg^-1浓度处理细菌群落结构之间的差异。细菌群落结构差异性分析采用系统进化树、主成分分析、相对丰度直观展示图和物种丰度聚类热图等方法。【结果】肉桂酸3种浓度处理的蔗糖酶活性均小于对照，对土壤蔗糖酶活性的抑制作用最强；肉桂酸、邻苯二甲酸和苯甲酸对土壤脲酶活性的抑制作用较强，其3种浓度处理下的土壤脲酶活性均小于对照；肉桂酸和苯甲酸对土壤过氧化氢酶的活性抑制作用较强，其中苯甲酸3 g·kg^-1浓度处理土壤过氧化氢酶活性在所有处理中最低；邻苯二甲酸、肉桂酸和苯甲酸对土壤碱性磷酸酶的活性抑制作用较强，3种浓度处理下的土壤碱性磷酸酶活性均低于对照，其中苯甲酸3 g·kg^-1处理最低。相对丰度直观展示图结果表明2 g·kg^-1浓度处理的月桂酸与其他6种处理存在较大差异，蓝藻门、Chloroplast、Streptophyta和Streptophyta-unclassified的含量分别在门、纲、目和科水平上明显大于其他6种处理，与系统进化树和主成分分析图显示的结论一致，其他处理的细菌群落结构在属以上水平差异不明显，在属水平上7个处理间有较大差异。【结论】低分子量有机酸的浓度对于土壤酶活性具有重要影响，土壤细菌或许不是影响土壤酶活性的主要原因。

北方冬麦区CO₂浓度增高与氮肥互作对冬小麦生理特性和产量的影响

居辉，姜帅，李靖涛，韩雪，高霁，秦晓晨，林而达

中国农业科学. 2015, 48(24):  4948-4956.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.24.009

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【目的】阐明CO₂浓度增高与氮肥互作对冬小麦生理和产量的影响，为客观评估气候变化背景下冬小麦生产潜力提供理论依据。【方法】2011—2014年利用开放式CO₂富集系统（FACE）平台，采用盆栽方法，研究冬小麦“中麦175”在不同CO₂浓度及高低氮肥水平下（高浓度CO₂ 550 mg·L^-1和大气浓度390 mg·L^-1；高氮N1，0.16 g·kg^-1和低氮N0，0 g·kg^-1）的生育进程、光合特征及产量变化。CO₂富集处理于每年返青-成熟期间进行，通气时间为每日6:30—18:30，夜间不通气。CO₂浓度通过计算机程序控制，并根据具体风向和风速控制释放管电磁阀的开合度，实现预定设置浓度。【结果】盆栽试验表明与大气CO₂浓度相比，高浓度CO₂加快了冬小麦生育进程，拔节期提前1 d，开花期可提前1—2 d，全生育期可缩短3—5 d，高氮肥处理对生育进程具有延迟作用，开花期延长1—2 d，灌浆期可延长4—5 d，同步缓解高浓度CO₂对生育进程的加快作用；高浓度CO₂使叶片光合速率提高13.7%，产量平均提高16.0%，且在高氮肥下光合速率的增幅比低氮肥相对提高2.5%，蒸腾速率提高13.5%；试验中单独高氮较低氮的增产效果达到50%，高于单独高浓度CO₂较大气浓度的增产效果；高浓度CO₂对产量构成中穗粒数和千粒重提高明显，高浓度CO₂较大气浓度穗粒数增加3.69%，单独高氮处理较低氮处理平均穗粒数增加3.43%，即CO₂肥效起到了增加穗粒数的作用并略高于单独氮肥处理，高氮和高CO₂双重促进下的穗粒数最多，达到38.37粒/穗，低氮和低CO₂处理的穗粒数水平最低，可见CO₂和氮肥互作对穗粒数的促进相对更明显，各自单独施用的促进作用彼此差异不大，但低氮、大气CO₂浓度处理的穗粒数则相对较低；与大气CO₂浓度相比，高浓度CO₂的千粒重增加5.3%，高氮高浓度CO₂处理的千粒重大约提高7.3%，说明氮肥的施用促进了高浓度CO₂对千粒重的提升效果。【结论】高浓度CO₂可提高冬小麦产量，且与氮肥有明显的正向互作关系，高氮肥处理可降低CO₂浓度升高对生育期的加快作用，提高光合能力，促进CO₂肥效的发挥；CO₂对冬小麦产量的提高主要是缘于CO₂浓度升高有利于穗粒数和千粒重的增加，育种中可以做综合性考虑和应用。

园艺

硼胁迫对枳橙砧木细根根尖成熟区和幼嫩叶片细胞结构的影响

刘磊超，姜存仓，董肖昌，吴秀文，刘桂东，卢晓佩

中国农业科学. 2015, 48(24):  4957-4964.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.24.010

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【目的】通过研究枳橙砧木对硼胁迫的反应，揭示缺硼对柑橘砧木细根根尖成熟区和中部功能叶解剖结构的影响。【方法】采用营养液的方式培养枳橙砧木幼苗，试验设置2个处理，分别为不施硼（-B）处理和施硼（硼酸含量为10 μmol·L-1，+B）处理。取枳橙砧木中上部的幼嫩叶片和细根根尖成熟区部分为观察材料，采用石蜡切片并结合透射电镜（TEM），研究缺硼对枳橙砧木解剖结构和亚细胞微观结构的影响。【结果】缺硼导致根部的皮层薄壁细胞数目减少且排列疏松紊乱、细胞变形破裂，细胞间隙增大；同时，细胞质出现解体并伴随多种细胞器消失，细胞壁厚度明显增加；而加硼处理的植株根部薄壁细胞的形态则表现正常，细胞大小均一，排列紧密，细胞间隙小；加硼处理的维管束细胞着色较深，形态正常，维管束的结构层次清晰，呈圆周状均匀分散在中央髓部周围。硼胁迫严重抑制了根部维管束发育，使其分化不明显、细胞体积小且排列无规则。缺硼的叶片纵切面加厚且不均匀，海绵组织细胞变形破裂，细胞间出现大的空缺，细胞数目多且体积大，使得海绵组织在叶肉中所占的比例明显增加；加硼处理的叶片纵切面各处厚度均一，表皮细胞形状规则排列紧密，栅栏组织细胞呈长圆柱形，细胞单层垂直分布表皮细胞之下，细胞排列整齐紧密；栅栏组织下面的海绵组织细胞结构完整，排列疏松，细胞间形成大小均匀的气腔。另外，缺硼导致叶片细胞中积累较多淀粉粒，叶片可溶性糖与淀粉含量比加硼时分别提高35.3%和66.7%，而加硼处理的叶片细胞中则没有观察到有明显的淀粉粒存在；缺硼叶片的维管束中薄壁细胞出现变形、破裂等现象。【结论】缺硼破坏细胞内部结构，造成细胞壁加厚，叶片细胞内淀粉粒积累加剧；影响叶片中海绵组织细胞形态大小，细胞出现不正常增生，从而抑制砧木根尖及叶片中维管束的发育。

‘春甜橘’及其突变体果皮差异相关蛋白质组分析

曾继吾，邓贵明，高长玉，姜波，钟云，钟广炎，易干军

中国农业科学. 2015, 48(24):  4965-4978.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.24.011

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【目的】柑橘自然芽变材料是柑橘育种的重要来源。‘明柳甜橘’（Citrus reticuiata Blanco cv.Mingliutianju，MP）是从‘春甜橘’（C. reticuiata Blanco cv. Chuntianju，CP）中选育出的自然芽变品种。分析‘春甜橘’与其自然芽变‘明柳甜橘’果皮差异蛋白质，探讨导致两品种形态差异的原因。【方法】以花后12周和23周的‘明柳甜橘’和‘春甜橘’果皮为材料，采用双向电泳技术（Two-dimensional gel electrophoresis，2-DE）分离获得野生型与突变型差异表达蛋白点，利用MALDI-TOF-MS质谱鉴定技术分析相关差异蛋白质，并进行功能注释和生物信息学分析。【结果】将提取的果皮总蛋白质经双向电泳后，分别采用硝酸银和考马斯亮蓝染色法进行蛋白质凝胶染色，均获得了清晰的2-DE电泳图。2-DE图谱经ImageMaster 2D软件分析表明，硝酸银染色法能检测到约1 200个蛋白点，考马斯亮蓝染色法能检测到约500个蛋白质点，从中各选取20个变化丰度2倍以上且重复性好的蛋白点进行MALDI-TOF-MS质谱鉴定和数据库检索分析，共有33个蛋白质有功能注释，其中17个蛋白质在‘明柳甜橘’果皮中表达上调，16个表达下调。按照33个差异蛋白质的功能，可将其分为11类，它们分别参与糖类/能量代谢、胁迫/防御反应、核酸代谢、氨基酸代谢、转录、氮代谢、脂肪酸代谢、蛋白修饰与降解以及未知类。利用KOBAS（KEGG Orthology-Based Annotation System）在线功能分析平台对33个差异表达蛋白质进行信号通路分析，其中18个差异蛋白质有KO注释，共涉及31条信号通路，按照P值大小排列，类黄酮生物合成过程位居第一，说明该信号通路最有可能参与春甜橘芽变形成过程。【结论】综合分析‘春甜橘’和‘明柳甜橘’基因水平及蛋白质水平的差异，推测可能是由参与类黄酮生物合成过程的差异表达基因尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶基因和差异表达蛋白咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶的差异表达导致了二者的表型差异。

畜牧·兽医·资源昆虫

断奶时间对羔羊生长性能和器官发育及血清学指标的影响

柴建民，王海超，刁其玉，祁敏丽，郭峰，王海超*，张乃锋

中国农业科学. 2015, 48(24):  4979-4988.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.24.012

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【目的】研究不同断奶日龄对羔羊断奶后10d的生长、营养物质消化、器官发育和血清指标的影响，筛选羔羊最佳的早期断奶日龄。【方法】选取出生日龄、体重相近的湖羊羔羊72只，分成4组。3个试验组每组16只，分别于羔羊10、20、30日龄进行断奶，饲喂代乳品（EW10组、EW20组、EW30组）；对照组24只（ER组），羔羊随母哺乳。试验组羔羊于断奶后10d内进行消化试验，并在断奶后10d时测定羔羊生长性能、器官发育情况和血清指标变化规律，并以对照组作相同处理作为对照。【结果】（1）断奶后10d时，EW10和EW30羔羊体重、日增重显著低于ER（P＜0.05），而EW20羔羊体重、日增重与ER差异不显著（P＞0.05）。EW10和EW20组断奶后10d内羔羊开食料干物质采食量显著高于ER组（P＜0.05），EW30与ER组差异不显著（P＞0.05）。（2）EW10组羔羊断奶后10d内干物质（DM）和有机物（OM）的消化率与ER差异不显著（P＞0.05），总能（GE）、氮（N）、粗脂肪（EE）、钙（Ca）和磷（P）的表观消化率显著低于ER组（P＜0.05）。EW20和EW30组羔羊断奶后10内DM、OM、GE、N、EE、Ca和P的表观消化率显著低于ER组（P＜0.05）。（3）羔羊断奶后10d时EW10组瘤胃占羔羊体重比值显著高于ER（P＜0.05），EW20和EW30组与ER组相比差异不显著，但均高于ER组。其余指标或组别均差异不显著（P＞0.05）。（4）早期断奶羔羊各血清指标在断奶当天与对照组差异不显著（P＞0.05）。EW10和EW30组羔羊断奶后10d血清中TP和ALB含量显著低于ER（P＜0.05），EW10羔羊于断奶后10d血清中TNF-α显著高于ER（P＜0.05），EW10和EW30羔羊断奶后10d血清中CORT显著高于ER（P＜0.05）。【结论】羔羊20日龄断奶后10d应激较小，此日龄断奶效果较佳。

GPX5在成年绵羊附睾中的表达与蛋白定位

栗瑞兰，张通，范晓梅，欧阳效晴，张春强，曹俊伟，张家新

中国农业科学. 2015, 48(24):  4989-4995.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.24.013

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【目的】研究谷胱甘肽过氧化物酶-5（glutathione peroxidase type-5, GPX5）在成年绵羊附睾的表达特征以及GPX5蛋白在附睾中的定位，为绵羊精子在附睾中抗氧化机制的研究提供理论依据。【方法】采取年龄相近的成年蒙古绵羊的附睾、睾丸和输精管。每一只公羊的附睾分别按照附睾头、附睾体和附睾尾进行分割。样品保存于-80 ℃冰箱，采用实时荧光定量PCR和Western blotting的方法，对成年绵羊的附睾、睾丸和输精管的GPX5 表达量进行分析。将新鲜的组织样品各部分切取适合大小浸泡于4%多聚甲醛溶液中24h，按照石蜡切片的方法制做组织切片。用GPX5特异性抗体孵育组织切片，利用DAB显色试剂盒对阳性信号进行标记。【结果】实时荧光定量PCR结果显示，成年绵羊附睾头GPX5基因的表达量极显著高于附睾体和附睾尾（P＜0.01），而在输精管和睾丸几乎不表达。Western blotting的结果显示，GPX5蛋白在成年绵羊附睾头高表达，在附睾体和附睾尾有微量蛋白存在，睾丸和输精管中未发现GPX5蛋白。这表明GPX5主要在成年绵羊附睾头表达；经过免疫组化染色分析，GPX5蛋白主要位于附睾头上皮细胞质以及静纤毛，附睾体和附睾尾中的GPX5蛋白主要集中在静纤毛。在附睾头、附睾体和附睾尾中的精子上以及附睾腔都可以观察到GPX5蛋白，表明GPX5蛋白从附睾上皮分泌到附睾腔中，随着精子在附睾中的运输与精子结合。【结论】在成年绵羊附睾中，GPX5主要由附睾头上皮细胞合成和分泌，在附睾管腔中与精子结合，为精子功能的正常发挥提供保护。

8种猪呼吸道和繁殖障碍病病原体GeXP检测方法的建立

张民秀，谢芝勋，邓显文，谢志勤，谢丽基，黄莉，黄娇玲

中国农业科学. 2015, 48(24):  4996-5006.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.24.014

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【目的】建立了一种同时鉴别H1、H3亚型猪流感、猪繁殖与呼吸障碍综合征、猪瘟、猪日本乙型脑炎、猪圆环病毒病、猪细小病毒病和猪伪狂犬病8种病毒性呼吸道和繁殖障碍病病原体的GeXP 高通量检测方法。【方法】根据这8种病原体的基因保守序列，设计并合成了9对特异性引物, 在每对特异性引物的5′端均加上一段通用引物，形成特异性嵌合引物。运用GeXP单重PCR方法，以单一病毒cDNA/DNA为模板验证引物的可行性；建立GeXP多重PCR方法，以单一病毒cDNA/DNA模板、阳性cDNA/DNA混合模板验证GeXP多重检测体系的特异性和准确性；将含猪圆环病毒、猪细小病毒和猪伪狂犬病病毒靶基因的克隆质粒及体外转录的RNA（H1、H3亚型猪流感、猪繁殖与呼吸障碍综合征、猪瘟、猪日本乙型脑炎）分别梯度稀释为10³，10²，10¹拷贝/µL，运用GeXP多重PCR方法进行单一病原体灵敏度分析；根据单一病原体的灵敏度分析结果，优化各对特异性嵌合引物的工作浓度，将含有体外转录好的6种RNA模板和3种克隆质粒等量混合，将混合物梯度稀释为10⁴,10³,10²,10¹拷贝/µL，运用GeXP多重PCR方法分析同时检测8种病原体的灵敏度。运用建立好的GeXP多重检测体系对23份临床样品进行检测，并与常规单重PCR进行比较，对该GeXP多重检测体系的临床应用进行评价。【结果】基于GeXP系统的单重PCR检测体系和GeXP多重PCR检测体系均能扩增出特异性片段，验证了引物的可行性、GeXP多重检测体系的特异性和准确性；GeXP多重检测体系的单一病原模板灵敏度分析结果显示，多重检测体系对单一病原体检测的下限均为10¹拷贝/µL；GeXP多重检测体系在8种病原体同时检测的灵敏度分析结果显示，多重检测体系可在10³拷贝/µL水平可同时检测到8种病原体；比较GeXP多重PCR检测方法和常规PCR方法对临床样品的检测结果，两种检测方法的检测结果相符。【结论】成功建立了基于GeXP系统的多重PCR检测体系，可以同时检测8种猪呼吸道和繁殖障碍性疾病病原体；本研究建立的同时鉴别8种猪呼吸道和繁殖障碍性疾病病原体的GeXP检测方法具有高通量、特异性强和灵敏度高的特点，为猪病毒性呼吸道和繁殖障碍性疾病的分子诊断提供了新型的检测方法。