中国农业科学

与SP1互作的水稻穗顶部退化基因qPAA3的精细定位

张兴元，罗胜，王敏，丛楠，赵志超，程治军

中国农业科学. 2015, 48(12): 2287-2295. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.12.001

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【目的】水稻顶部小穗退化减少了单穗的总枝梗数和总粒数，严重影响单株产量，是水稻生产上的一个不利性状。因其遗传基础复杂，受环境影响较大，控制顶部小穗退化的相关基因克隆研究报道极少，该不利性状发生的分子机制及其遗传网络还不得而知。对顶部小穗退化基因进行精细定位，可为穗顶部基因的克隆奠定基础；开发的紧密连锁分子标记，也可以运用于分子育种实践，对这一不利性状进行早期识别和淘汰。【方法】首先对小穗突变体sp进行精细定位。用sp分别与粳稻品种ITA182和籼稻品种J160杂交构建2个遗传定位群体。为了研究不同穗退化突变体之间的关系，再以小穗突变体sp和穗顶部退化材料05261杂交，获得了农艺性状稳定的拟双突变体（表型与sp相似）。通过连续自交，纯合拟双突变体的遗传背景。再以高代的拟双突变体为非轮回亲本，穗顶部正常品种IRAT129为轮回亲本，构建含有双突变体的BC₁F₂亚群体。其中一个亚群体14C2017既表现单基因的穗退化性状分离，又出现小穗和穗顶部退化的双突变体表型，被用作顶部小穗退化基因的精细定位材料。【结果】水稻小穗性状是由1对隐性基因（sp）控制的。利用混池方法将SP(t)初步定位于第11染色体分子标记RM26281与RM7391之间；利用新开发的60对SSR分子标记，将其定位在标记sc50和sc66之间。在此区间内设计引物，最终将SP(t)定位在标记sc24和sc66之间，物理距离为54.3 kb的范围内。测序结果表明，突变体在该区间内有15.03 kb的大片段缺失，导致基因SP1的编码序列缺失。对拟双突变体的表型分析表明，sp与一个穗顶部退化基因存在互作。利用亚群体14C2017作为克隆与SP1互作基因的遗传分离群体，利用分布于全基因组的239对引物，筛选出在拟双突变体和IRAT129之间有多态的引物114对，将目标基因精细定位于第3染色体SSR标记RM6929和RM1319之间，物理距离为97.3 kb范围内，该候选基因属于早先报道的QTL——qPAA3。【结论】水稻sp的小穗性状是由基因SP1引起的缺失突变。与SP1互作的qPAA3定位于第3染色体SSR标记RM6929和RM1319之间，物理距离为97.3 kb的范围内。

华南大豆种质对大豆疫霉根腐病的抗性分析

程艳波，马启彬，牟英辉，谭志远，吴鸿，年海

中国农业科学. 2015, 48(12): 2296-2305. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.12.002

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【目的】大豆疫霉根腐病是由大豆疫霉菌引起的严重影响大豆生产的世界性病害之一，选用抗病品种是控制该病最经济有效的措施。筛选抗大豆疫霉菌PGD1的优异抗源和多抗疫霉根腐病种质资源，推导大豆种质抗疫霉根腐病基因，为热带、亚热带地区大豆抗病育种提供有效抗源。【方法】采用下胚轴创伤接种法，利用在广东发现并分离的大豆疫霉菌PGD1菌株，接种鉴定主要来自广东、广西、福建、海南、湖南、江西和四川等华南省份631份大豆种质资源的抗病性，筛选抗大豆疫霉菌PGD1种质资源；再用其他6个不同毒力的大豆疫霉菌株接种鉴定抗大豆疫霉菌PGD1的种质，筛选多抗资源，通过基因推导方法分析抗病种质的抗病基因类型。【结果】631份大豆种质中有101份种质抗大豆疫霉菌PGD1，占鉴定种质的16.0%；73份为中间反应类型，占11.6%；457份表现感病，占72.4%。其中83份抗大豆疫霉菌PGD1的种质对其他6个不同毒力菌株Pm14、Pm28、PNJ1、PNJ3、PNJ4、P6497的侵染率分别为28.9%、34.9%、9.6%、66.3%、57.8%和10.8%。4份种质同时抗7个不同毒力的大豆疫霉菌株，分别为ZDD21538、ZDD21604、ZDD14286和明夏豆1号，占鉴定种质的4.8%。毒力频率为0的种质有15份，占鉴定种质的18.1%。83份大豆种质对7个不同毒力的大豆疫霉菌株共产生20种反应型，1种反应型与单个抗病基因的鉴别寄主Williams79反应型一致，可能含有抗病基因Rps1c；45份种质产生的9种反应型符合一些2个或2个以上已知抗病基因组合的反应型，这些种质可能含有已知抗病基因组合；38份种质共产生11种反应型既不同于任何含有单个已知抗病基因品种的反应型也不同于2个或2个以上已知抗病基因组合的反应型，它们可能含有新的抗病基因或基因组合。【结论】华南地区大豆种质中蕴藏着丰富的抗大豆疫霉菌PGD1和多抗大豆疫霉菌抗源，这些抗病种质可作为热带、亚热带地区大豆抗病育种的重要亲本和抗病基因定位的重要研究材料。

棉花钠尿肽基因GhPNP1的耐旱功能分析

刘小双，刘廷利，袁洪波，张保龙，王荣富

中国农业科学. 2015, 48(12): 2306-2316. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.12.003

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【目的】分析棉花中钠尿肽GhPNP1的结构特征、表达模式以及耐旱功能，并分析其耐旱机制，为将该基因应用于作物改良奠定基础。【方法】通过对从植物中水平转移到大丽轮枝菌中的钠尿肽基因AVE1进行同源性搜索，得到与AVE1蛋白序列相似度较高的其他物种的蛋白序列；使用MEGA5软件对AVE1蛋白序列及其同源序列进行多序列比对分析并构建同源物种间系统进化树；利用MEGA和expasy在线工具进行蛋白序列分析；并根据编码该蛋白的核酸序列设计引物在陆地棉品种奥3503中克隆到其同源基因GhPNP1。使用多种生物信息学软件分析GhPNP1的分子特性，包括GhPNP1编码蛋白的等电点、分子量、信号肽、进化关系等进行预测分析。利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析GhPNP1在不同器官部位的组织表达模式以及受到PEG模拟干旱胁迫处理后的表达模式。将GhPNP1的cDNA序列连入CLCrV沉默载体中，构建GhPNP1的病毒诱导基因沉默载体CLCrV:GhPNP1，转入农杆菌，并通过和辅助载体CLCrVB共侵润2叶期幼苗进行叶片注射，获得GhPNP1的沉默植株。利用PEG模拟干旱处理沉默植株检测其耐旱性，并测定沉默植株的失水率、相对含水量、丙二醛（MDA）含量、总抗氧化活性（T-AOC水平）、离子渗漏率等与植物抗逆相关的生理指标。【结果】从陆地棉奥3503中克隆到的GhPNP1的开放阅读框长度为396 bp，编码131个氨基酸，信号肽长度为15个氨基酸，通过系统进化树分析GhPNP1编码的蛋白含有保守的钠尿肽结构域，与可可树的PNP蛋白进化关系最近。GhPNP1在棉花植株的根、茎、叶中均表达且在茎中表达量较高，PEG模拟干旱处理后根、茎、叶中的GhPNP1均上调表达。GhPNP1沉默后棉花植株耐旱性显著降低。在干旱条件下，GhPNP1沉默植株的MDA含量、离子渗漏率、叶片失水率均高于对照的未沉默植株；而沉默植株的总抗氧化能力（T-AOC水平）、相对含水量显著低于对照的未沉默植株。【结论】从棉花中克隆得到一个植物钠尿肽基因，受干旱胁迫诱导上调表达，沉默后耐旱性降低。推测GhPNP1可能通过cGMP信号途径参与棉花的干旱胁迫，在干旱胁迫下对棉花耐旱性起正调控作用。

小麦籽粒蛋白质光谱特征变量筛选方法研究

李栓明，郭银巧，王克如，谢瑞芝，戴建国，肖春华，李静，李少昆

中国农业科学. 2015, 48(12): 2317-2326. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.12.004

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【目的】筛选整粒小麦籽粒蛋白质的近红外特征光谱波段并建立优化模型，可实现快速、无损测定整粒小麦籽粒蛋白质含量，为田间便携式小麦籽粒蛋白质含量速测仪设计提供依据。【方法】2012—2013年以蛋白质含量有明显差异的8个冬小麦品种为试验品种，设置3个施氮量和2个灌溉量共6个处理，建立丰富的样本类型，共采集176个小麦籽粒光谱数据；将ASD FieldSpec Pro光谱仪采集到的基于全反射下垫面的整粒小麦籽粒反射光谱通过公式A=log(1/R)转换为吸收光谱，对吸收光谱采用S-G平滑、多元散射校正和基线校正等方法进行预处理，以消除背景噪声，然后采用交叉验证偏最小二乘回归方法进行特征波段压缩；分析比较无信息变量剔除法（UVE）结合交叉验证偏最小二乘回归、连续投影算法（SPA）结合交叉验证偏最小二乘回归、UVE与SPA组合后结合交叉验证偏最小二乘回归、UVE与SPA组合后结合多元线性回归（MLR）及UVE与SPA组合后结合逐步多元线性回归（SMLR）等多种特征光谱筛选方法选出的蛋白质特征波段的优劣，并与凯氏定氮法测定的小麦籽粒蛋白质含量进行回归分析，构建并优选小麦籽粒蛋白质最佳预测模型。【结果】利用无信息变量剔除（UVE）方法可将与小麦籽粒蛋白质含量无关的信息变量剔除，把籽粒的原始光谱由1 621个波段压缩至717个，在保留了蛋白质信息的同时，实现了特征谱段的初次优选；对逐步多元线性回归（SMLR）、连续投影算法（SPA）、连续投影算法（SPA）+逐步多元线性回归（SMLR）及连续投影算法（SPA）+偏最小二乘回归（PLS）+交叉验证（CV）等特征波段优选算法比较发现，不同的方法获得的特征谱段有差异，构建的模型及精度也明显不同。对经过无信息变量剔除（UVE）法筛选光谱特征谱段，利用SPA消除光谱矩阵中波段共线性影响，再利用SMLR筛选出小麦籽粒蛋白质信息贡献最大的15个特征谱段，所得模型的预测均方根误差（RMSEP）和R²分别为0.5898和0.9410，模型预测精度最高。【结论】本研究利用UVE、SPA与SMLR方法有效压缩了整粒小麦籽粒光谱矩阵，基于所筛选的蛋白质含量特征谱段数构建的预测模型可以实现无损、快速测定整粒小麦籽粒蛋白质含量，预测模型精度可靠，方法经济有效，为设计田间便携式整粒小麦籽粒蛋白质测定仪的波段选择和开发奠定了基础。

玉米籽粒比重与灌浆特性的关系

张丽，张吉旺，樊昕，刘鹏，董树亭

中国农业科学. 2015, 48(12): 2327-2334. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.12.005

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【目的】玉米籽粒比重与容重呈显著正相关，容重偏低一直是中国玉米低商品品质的主要问题之一。论文旨在探讨玉米籽粒比重在籽粒灌浆过程中的建成动态及其与籽粒灌浆特性的关系，以期为提高籽粒比重和容重，改善玉米商品品质提供理论依据。【方法】选用普通型品种农大108（ND108）、硬粒型品种费玉4号（FY4）、高淀粉型品种费玉3号（FY3）和郑单18（ZD18）为供试材料，对授粉后玉米籽粒的干比重、鲜比重、百粒干重、单粒鲜体积和水分含量进行测定，采用回归分析讨论比重与灌浆特性的关系。【结果】籽粒鲜比重授粉后随着籽粒的发育呈上升趋势，到成熟期趋于稳定；而干比重在灌浆前期处于下降趋势，授粉后20—35 d是其增长的快速时期，到灌浆后期基本趋于稳定；成熟期FY4、FY3及ZD18籽粒干比重和鲜比重均大于对照ND108。百粒干重和单粒鲜体积在灌浆前期增长迅速，之后增长速率变缓，至成熟期逐渐趋于稳定，其授粉后的变化趋势均可用Logistic曲线较好的模拟，各回归方程的相关系数在0.986—0.999，均达到显著水平，FY4、FY3和ZD18成熟期百粒干重和单粒鲜体积均大于ND108；授粉后随着干物质的不断积累，籽粒水分含量迅速下降，平均每天下降1.302个百分点。籽粒鲜比重与百粒干重（R²=0.851，P＜0.01）、单粒鲜体积（R²=0.594，P＜0.05）均呈显著正相关，而与水分含量（R²=0.803，P＜0.01）呈显著负相关。以灌浆期的百粒干重，单粒鲜体积和水分含量为自变量x，籽粒干比重为依变量y，用二次曲线方程y=a+bx+cx²对它们之间的回归关系进行拟合，方差分析表明各方程回归系数在0.623—0.748，F检验均达到显著水平（P＜0.01），其中干比重与籽粒水分含量的关系最为密切（r=0.731，P＜0.01）。当百粒干重、单粒鲜体积和水分含量分别为18.75 g、0.589 cm³和61.5%时，干比重处于最小值，此时对应的各品种授粉后天数分别在24.0—28.1 d、16.3—20.7 d和21.1—23.6 d，均处在籽粒快速增长期，说明在16—28 d内籽粒快增持续期阶段内，是籽粒干比重形成的关键时期。【结论】籽粒干比重在灌浆前期处于下降趋势，之后快速增长到灌浆后期基本趋于稳定；籽粒灌浆快增持续期是干比重形成的关键时期，此期间影响籽粒灌浆将显著影响干比重的大小；干比重与籽粒水分含量的关系最为密切，回归系数达0.731。

中国橡胶树种植气候适宜性区划

刘少军，周广胜，房世波

中国农业科学. 2015, 48(12): 2335-2345. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.12.006

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【目的】天然橡胶是国民经济建设不可缺少的重要战略物资，受气候因素限制，中国种植橡胶树范围有限，迫切需要厘清天然橡胶树种植的气候适宜性区域。本研究旨在划分出中国橡胶树种植气候适宜性分布，以阐明中国橡胶树种植的气候差异格局。【方法】根据中国橡胶树种植区的自然气候特点和生物学特征，基于橡胶树种植存在概率、橡胶树台风影响概率和橡胶树寒害影响概率，分别采用最大熵模型和影响橡胶树种植的5个主导气候因子（最冷月平均温度、极端最低温度平均值、月平均温度≥18℃月份、年平均气温、年平均降水量）计算橡胶树种植气候适宜性指数。根据台风历史资料和橡胶林台风灾害分级标准计算橡胶树台风灾害指数、参照《橡胶寒害等级（QX/T169-2012）》行业标准计算橡胶树综合寒害指数。根据确定的橡胶树种植的气候区划指标（气候适宜性指数、橡胶树台风灾害指数、橡胶树综合寒害指数），结合模糊综合评价模型，进行中国橡胶树种植气候适宜性区划，区划结果划分为高适宜区、中适宜区、低适宜区。【结果】橡胶树种植的气候高适宜区面积约4.99×10⁴ km²，占研究区面积的20.94%，主要分布在海南儋州、澄迈、定安、乐东、保亭，广东徐闻、雷州、湛江、阳江，云南景洪、勐腊，福建诏安、云霄，广西防城等地。该区域气候条件优越，但部分区域属于台风高影响区，因此需要防御台风灾害对橡胶树的影响。气候中适宜区面积约8.85×10⁴ km²，占研究区面积的35.86%，主要分布在在海南琼中、东方、昌江、万宁、琼海等，广东廉江、高州、茂名、信宜、惠来、潮州，福建漳州、漳浦等，云南瑞丽、旧过，广西北海、合浦。与高适宜区相比，该区域橡胶树寒害发生概率增加，部分区域受台风影响概率也增加，应针对不同灾害特点，加强橡胶寒害和风害的防御。气候低适宜区面积约10.3×10⁴ km²，占研究区面积的43.20%，主要分布在在云南盈江、永德、思茅、屏边等一线，广西玉林、浦北，广东阳春、海丰、陆河，福建华安等地。该区域主要受寒害影响为主。【结论】该方法考虑了农业气候资源与农业气象灾害的综合影响，可以较好地反映中国橡胶树种植的气候优势区域分布，对橡胶树种植的区域布局和科学规划具有重要的参考意义。

中国小麦品种兰天9号慢叶锈性QTL分析

韩柳莎，王佳真，师令智，朱琳，李星，刘大群

中国农业科学. 2015, 48(12): 2346-2353. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.12.007

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【目的】由小麦叶锈菌（Puccinia triticina）引起的小麦叶锈病是影响小麦稳产、高产的一种重要真菌病害。目前防治小麦叶锈病最经济、安全、有效的方法是种植抗病品种。中国小麦品种兰天9号苗期对大多数叶锈菌小种表现感病，成株期对小麦叶锈菌则表现为明显的慢锈性。研究旨在分析中国小麦品种兰天9号的成株抗叶锈性，发掘其中含有的QTL，并利用分子标记进行定位，为小麦分子育种提供理论基础。【方法】利用抗病亲本兰天9号和感病亲本辉县红杂交获得到197个家系的F_2:3群体，2011—2014年连续3年在河北保定种植，并利用3个叶锈菌生理小种混合菌种（THTT、THTS、THTQ）进行田间接菌，小麦成株期调查最终发病严重度，获得表型数据。利用1 232对SSR标记对兰天9号、辉县红以及F_2:3群体进行基因检测，获得基因型数据。结合表型数据和基因型数据，利用Map Manager QTXb20创建连锁图、QTL Icimapping 3.2软件进行抗叶锈病QTL分析。【结果】检测到5个QTL，其中位于2B染色体上的QTL暂命名为QLr.hbau-2BS，在连续两年的数据结果中都被检测到，解释的遗传变异分别为6.0%和9.1%；标记区间分别为Xbarc55-Xgwm148和Xgwm429-Xwmc154；LOD值分别为2.6和3.46；加性效应分别为-6.1和-8.7；显性效应分别为3.03和3.4。1B染色体上1个QTL暂命名为QLr.hbau-1BL.2，连续两年被检测到，解释的遗传变异分别为7.7%和10.7%；标记区间为Xwmc766—Xbarc269；LOD值分别为2.5和3.1；加性效应分别为-1.0和-1.1；显性效应分别为-13.0和-14.9。其他3个QTL只在一个年份被检测到，1B染色体上暂命名为QLr.hbau-1BL.1、4B上暂命名为QLr.hbau-4BS、3A上暂命名为QLr.hbau-3A，均在2011—2012年度检测到，解释的遗传变异分别为11.7%、8.5%、5.6%；标记区间分别为Xbarc80—Xwmc728、Xgwm495—Xwmc652和Xgwm161—Xbarc86；LOD值分别为5.1、4.0和2.8；加性效应分别为6.5、-5.5和-3.1；显性效应分别为-6.5、6.2和6.6。QLr.hbau-1BL.1来源于感病亲本辉县红，其余4个QTL来源于兰天9号。【结论】结合田间表型数据和基因型数据，检测到位于1B、2B、3A、4B染色体上5个控制成株抗叶锈的QTL。

利用酵母双杂交系统筛选介体异沙叶蝉中与小麦矮缩病毒外壳蛋白互作的蛋白质

赵艺泽，刘艳，王锡锋

中国农业科学. 2015, 48(12): 2354-2363. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.12.008

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【目的】利用分离泛素酵母双杂交膜系统（split-ubiquitin yeast membrane system），以小麦矮缩病毒（Wheat dwarf virus，WDV）的外壳蛋白（CP）基因为诱饵对异沙叶蝉（Psammotettix alienus L.）cDNA文库进行筛选，研究异沙叶蝉传播WDV的分子机制。【方法】以笔者实验室饲养的异沙叶蝉为材料，提取其总RNA后取100 ng进行纯化，利用SMART法反转录合成ds cDNA，经过Sfi I酶切纯化，连接到pPR3-N文库载体上，构建得到以pPR3-N为载体的异沙叶蝉分离泛素酵母双杂交膜系统cDNA文库。同时，构建带有Sfi I酶切位点的诱饵载体pDHB1-WDV CP，经功能检测后用诱饵载体初步筛选pPR3-N空文库，寻找适合筛库的条件和确定His基因产物抑制剂3-氨基-1,2,4-三唑（3-AT）的使用浓度。然后用诱饵载体筛选异沙叶蝉cDNA文库，对筛选结果进行分析，再通过共转验证和β-半乳糖苷酶检测进一步验证是否发生互作。利用Uniprot和KEGG在线网站，对筛到的蛋白进行gene ontology（GO）注释和Pathway分析。【结果】初级文库库容量超过2.0×10⁶cfu，文库实际扩增数量大于1.3×10⁶cfu，文库重组率大于97%，扩增文库插入片段平均长度大于1 000 bp，表明异沙叶蝉cDNA文库的质量较高。酶切验证显示诱饵载体pDHB1-WDV-CP中CP的插入完整而准确。功能检测表明融合蛋白能够正确表达。在3-AT浓度为5 mmol?L^-1的筛选条件下，诱饵载体筛选异沙叶蝉cDNA文库得到280个克隆，经测序和Blast比对分析最终得到12个可能与WDV的CP发生互作的异沙叶蝉蛋白质。将这12个蛋白质再次进行共转验证和β-半乳糖苷酶检测，最终得到9个蛋白质与WDV CP互作。GO注释显示，9个蛋白参与的生物过程包括蛋白去磷酸化、碳水化合物代谢过程、先天性免疫应答、模式识别受体的信号通路、运输、同向运输和乙醇氧化等；分子功能包括金属离子结合活性、蛋白磷酸酶活性、信号模式识别受体的活性、水解酶活性、磷酸离子载体活性和叶酸运输活性等。参考KEGG数据库，这些蛋白参与的代谢途径有泛素介导的蛋白水解途径、内吞作用、花生四烯酸代谢途径、cAMP信号通路和模式识别受体的信号通路等。【结论】异沙叶蝉分离泛素酵母双杂交膜系统cDNA文库的成功构建与筛选，为研究异沙叶蝉与小麦矮缩病毒的互作机制研究奠定了基础。

绿盲蝽TRPA1基因的鉴定及功能分析

付婷，杨婷，刘杨，王桂荣

中国农业科学. 2015, 48(12): 2364-2373. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.12.009

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【目的】克隆绿盲蝽（Apolygus lucorum）TRPA1基因，明确其在成虫不同组织中的表达分布，研究绿盲蝽TRPA1基因的功能，阐明绿盲蝽感受温度的分子基础。【方法】在绿盲蝽转录组测序的基础上，通过生物信息学方法分析转录组数据,得到编码绿盲蝽TRPA1基因的cDNA序列片段。根据已知的cDNA序列，设计引物。采用RT-PCR及RACE（rapid-amplification of cDNA ends）技术克隆TRPA1基因的全长序列，并通过DNAMAN软件及BLAST分析测序结果。测序正确后，使用在线工具SMART及TMpred预测TRPA1蛋白的锚蛋白重复序列（Ankyrin repeats）及跨膜结构域序列。通过序列比对，构建昆虫TRP（transient receptor potential）通道的家族进化树，分析绿盲蝽TRPA1与其他物种同源基因的相似性及进化地位。以GADPH为内参基因，利用RT-PCR检测绿盲蝽TRPA1在成虫触角、头、喙、足、腹等不同组织中的相对表达量。通过爪蟾卵母细胞体外表达结合双电极电压钳记录技术研究绿盲蝽TRPA1对温度刺激的反应。【结果】通过绿盲蝽转录组数据预测得到TRPA1基因的4个cDNA序列片段，经过RT-PCR及RACE技术克隆得到了绿盲蝽TRPA1的全长序列，并命名为AlucTRPA1。AlucTRPA1开放阅读框全长3 672 bp，编码1 223个氨基酸。通过在线工具SMART及TMpred预测分析结果表明，AlucTRPA1含有16个锚蛋白重复序列结构及6个保守的跨膜结构域。序列比对及进化树分析结果显示，昆虫TRPA家族包含TRPA1、Painless、Pyrexia及Water witch，AlucTRPA1属于昆虫TRPA1亚家族。AlucTRPA1与其他昆虫的同源基因具有很高的相似性，特别是与同属半翅目的豌豆蚜（Acyrthosiphon pisum）的同源性高达65.1%。成虫组织表达谱分析结果表明，AlucTRPA1在成虫触角中的表达量最高，头、喙、足、腹中也都有表达。爪蟾卵母细胞体外表达结合双电极电压钳记录结果表明20℃至40℃逐渐上升的温度可以直接激活AlucTRPA1通道，且两次连续重复的温度刺激未引起AlucTRPA1通道的钝化。【结论】AlucTRPA1在绿盲蝽成虫的触角、头等组织中均有表达，且在爪蟾卵母细胞表达的AlucTRPA1能被20℃至40℃逐渐上升的温度刺激直接激活，推测AlucTRPA1在绿盲蝽体内是直接的温度感受器，参与调控绿盲蝽对生活环境温度的感知行为。

中国耕地保育技术创新不足已危及粮食安全与环境安全

张维理，徐爱国，张认连，冀宏杰

中国农业科学. 2015, 48(12): 2374-2378. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.12.010

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中国自20世纪80年代初以来随作物产量的提高，化肥等农用化学品投入量增加了3.6倍，而同期农民耕地保育技术水平却没有明显提升，盲目施肥、大量施肥、用药不当、灌溉不当，即以“费”的方式补偿技术不足现象普遍，由此不仅引起肥、水资源的过度消耗，还导致土壤质量退化、农民生产成本增加，水、土、大气环境和农产品污染加剧，对粮食安全、环境安全和食品安全造成隐患。研究显示，导致农民耕地保育技术水平难以提升的两大主要原因分别是耕地保育应用与应用基础研究的弱化与现代农技服务业的缺失。多年来，国家级和省部级公益性土壤肥料农业专业研究机构均质化、碎片化、行政化问题不断加深，使得需要长期研究才能有所突破的土壤肥料应用与应用基础研究难以为继并被空洞化，至今难以为各农区提供易于为农民掌握和应用的耕地保育分区、分类、量化技术指标，难以推动现代专业化农技服务业的发展。要在根本上解决这一问题，亟需在3个方面进行改进：第一，重视稳定和保持国家与省级公益性土壤肥料专业科研院所的专业特征，发挥其在耕地保育技术创新研究中的核心作用。第二，在国家科研计划中，对耕地保育应用与应用基础领域研究主题适度稳定，执行年限也应适度延长，以便中国能够逐步为各主要农区建立一批科学、可靠的耕地保育技术规程，并对其进行持续的升级换代。第三，探索与中国农村经济技术条件更相适应的现代农技推广模式，发展现代信息技术、通讯技术、智能技术在耕地保育技术推广传播中的作用，以技术创新带动中国农技推广方式的转变，全面提升中国农民耕地保育技术水平。

不同生长阶段水分胁迫对旱区冬小麦生长发育和产量的影响

姚宁，宋利兵，刘健，冯浩，吴淑芳，何建强

中国农业科学. 2015, 48(12): 2379-2389. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.12.011

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【目的】为了探究不同生长阶段水分胁迫对旱区冬小麦生长发育和产量形成的影响，通过2012—2013和2013—2014两个生长季在遮雨棚人工控水试验，对比分析不同分段受旱条件下冬小麦的株高、叶面积指数、生物量、物候期和产量等生理生态指标的动态变化过程。【方法】试验将冬小麦整个生育期划分为越冬、返青、拔节、抽穗和灌浆5个主要生长阶段，每相邻两个生长阶段连续受旱，形成4个不同的受旱时段水平（D1—D4），根据小麦生育期的需水量，设置灌水定额分别为40和80 mm两个水平（I1和I2），共形成8个处理，每处理3次重复，在遮雨棚内采用裂区试验布置，此外在旁边设置1个各生育期全灌水的对照处理。【结果】在冬小麦营养生长阶段进行连续水分胁迫时，明显影响小麦的正常生长发育，越冬期和返青期受旱时冬小麦的株高和叶面积指数都最小，但是拔节后受旱对小麦植株生长影响不明显，且拔节期后冬小麦株高和叶面指数的平均生长速率均为拔节前的10倍；拔节期前各处理小麦的生物量都没有明显的差异，但是拔节后各处理差异明显，越冬期和返青期受旱处理的生物量明显低于其他各处理，并且后期复水也不能弥补生物量的严重损失；干旱胁迫能缩短冬小麦的生育期，在同一灌溉水平下，受旱阶段D1、D2、D3、D4的抽穗期和开花期比对照处理延迟1-3 d，且受旱时期越早、胁迫程度越大，则生育期越提前，成熟期最多可提前5 d；相同灌溉水平下，若抽穗和灌浆期受旱（即越冬、返青、拔节期灌水）可获得较高的有效穗数和穗粒数，但千粒重较低；而抽穗和灌浆期灌水，可以提高冬小麦千粒重，但穗数和穗粒数较低；在I1和I2水平下，越冬期和返青期受旱处理的产量最低，仅为对照处理产量的42%左右，但I1水平下拔节期和抽穗期受旱的处理产量最高，约为对照处理的63%，I2水平下返青期和拔节期受旱的处理产量最高，约为对照处理的75%。【结论】灌水定额和受旱阶段具有明显的交互作用，返青期和灌浆期为旱区冬小麦田间水分管理的关键时期，生产中需加强这两个生长阶段的田间水分管理以确保高产。

根层调控措施对甜玉米-黄瓜设施蔬菜轮作体系土壤硝态氮的影响

郝晓然，彭亚静，张丽娟，王琳，巨晓棠，吉艳芝，任翠莲

中国农业科学. 2015, 48(12): 2390-2400. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.12.012

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【目的】以甜玉米作为填闲作物，探讨不同的根层调控措施对消减土壤剖面累积硝态氮及下茬黄瓜生长的影响。【方法】在华北平原传统棚室蔬菜的休闲季种植甜玉米，针对甜玉米设置添加土壤调理剂和秸秆还田2种根层调控措施，以甜玉米传统种植作为对照，进行田间小区试验。试验于2008年5月至2011年5月进行，共3次甜玉米-黄瓜轮作，6季作物。每年6月初至9月底种植甜玉米，10月初至次年1月底扣棚育黄瓜苗，当年2月初种植黄瓜。在甜玉米季，共3个处理，随机排列，重复3次。小区面积为4 m×2 m，小区间隔0.3 m，区组之间布设1 m的保护行。【结果】甜玉米种植季，调理剂处理的玉米籽粒产量最高，2008、2009和2010年的产量分别为6.2、7.4和7.9 t·hm^-2；土壤调理剂和秸秆还田2种根层调控处理的甜玉米总吸氮量高于传统种植。秸秆还田和调理剂处理能够促进20—60 cm土层根系的生长发育，促使根系吸收更深层的土壤养分。2种根层调控措施均能降低土壤剖面NO₃^--N的累积，尤其对100—200 cm的作物根区NO₃^--N的消减能力更强，NO₃^--N消减趋势大致为：调理剂>秸秆还田>传统种植。3季黄瓜种植季，不同前茬处理的黄瓜产量、生物量和吸氮量差异均不显著；3季平均土壤NO₃^--N在0—200 cm土层的残留量为秸秆还田<调理剂<传统种植。3个轮作季后，传统种植、调理剂和秸秆还田处理在0—200 cm土层的氮素盈余量分别为1 911.6、1 966.3和1 930.2 kg·hm^-2，调理剂处理显著高于传统种植。【结论】在硝态氮高累积的设施土壤上，随着种植年限的增加，加入土壤调理剂和适当的秸秆还田对100—200 cm的作物根区土壤剖面NO₃^--N的消减能力更强。填闲作物种植第二年对下茬黄瓜土壤NO₃^--N的消减作用最为明显。土壤调理剂和秸秆还田措施能够显著提高甜玉米对土壤剖面NO₃^--N的消减能力，减缓土壤NO₃^--N 的淋失，提高经济效益。

MaCaM在采后香蕉果实温度胁迫及后熟中的作用

王海波，龚家建，苏新国，张昭其

中国农业科学. 2015, 48(12): 2401-2407. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.12.013

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【目的】研究香蕉CaM在温度胁迫及香蕉果实后熟过程中的表达模式，了解CaM在增强香蕉果实对温度胁迫的适应性作用，解释CaM参与调控香蕉果实褪绿转黄的机制。【方法】通过比对NCBI数据库中已有物种的CaM氨基酸序列，设计兼并引物。采用热硼酸法，从香蕉果皮中提取总RNA，通过RT-PCR与RACE方法扩增目的基因。利用DNAMAN软件和NCBI网站对CaM的氨基酸序列进行氨基酸比对和同源树分析。利用地高辛探针合成试剂盒（PCR DIG Probe Synthesis Kit）合成特异基因带有DIG标记的探针，使用Northern杂交法对MaCaM在采后香蕉果实温度胁迫及后熟中的表达规律进行分析。钙离子螯合剂EGTA及钙信号恢复处理采用香蕉果皮离体培养，采用真空渗透的方法对香蕉果皮进行试剂处理，利用色差计测定颜色h值。【结果】从香蕉果皮中克隆得到一个CaM，长648 bp，编码138个氨基酸，命名为MaCaM（登录号：HM061077），序列分析表明，MaCaM包含4个EF-Hand钙离子结合区域，与MaCaM、OsCaM、ZmCaM、AtCaM3、TaCaM1-2等基因同源性极高。Northern杂交结果表明，热激（52℃，3 min）处理香蕉果实0.5 h后，MaCaM表达迅速增强；香蕉果实在冷害温度（7℃）下放置10 d，MaCaM在冷藏的第7—10 d表达逐渐增强，当采后香蕉果实先经热激处理再放入7℃下贮藏，MaCaM表达在第4天和第7天强于7℃处理；乙烯催熟处理诱导香蕉MaCaM表达逐渐增强；30 mmol·L^-1钙离子螯合剂EGTA处理在一定程度上抑制了香蕉果实的后熟，同时也抑制了MaCaM的表达。而在EGTA处理的同时，利用30 mmol·L^-1 CaCl₂进行钙信号恢复处理，能一定程度地恢复香蕉果实的正常后熟，也恢复了MaCaM的表达。【结论】MaCaM能增强香蕉果实对温度胁迫的适应性；MaCaM作为一种调控因子参与了香蕉果实后熟的褪绿转黄过程。

UV-A诱导大豆芽苗菜下胚轴中花青苷积累的分子机理

戚楠楠，张晓燕，苏娜娜，邬奇，耿殿祥，齐学会，魏圣军，崔瑾

中国农业科学. 2015, 48(12): 2408-2416. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.12.014

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【目的】研究长波紫外光（UV-A）、白光（W）和蓝光（B）对大豆芽苗菜下胚轴中花青苷含量、花青苷合成相关酶活性、花青苷合成途径相关基因及光受体基因表达量的影响,以探明UV-A诱导大豆芽苗菜下胚轴中花青苷生物合成的分子机理，为光质调控技术应用于大豆芽苗菜工业化生产提供理论依据。【方法】以大豆‘东农690’为试材，以黑暗培养为对照，连续的UV-A、白光（W）和蓝光（B）光照培养作为试验处理，在处理0 h、12 h、24 h和36 h后各采样一次，分别测定花青苷含量，苯丙氨酸解氨酶（PAL）、查尔酮异构酶（CHI）以及类黄酮半乳糖苷转移酶（UFGT）活性，相关基因（PAL、CHS、CHI、DFR、ANS、UFGT、MYB75、CRY1、CRY2、UVR8）表达量。花青苷含量采用分光光度法测定，苯丙氨酸解氨酶（PAL）及查尔酮异构酶（CHI）活性采用分光光度法测定，类黄酮半乳糖苷转移酶（UFGT）活性采用超高效液相色谱法（UPLC）测定。材料总RNA采用Trizol试剂法提取，基因表达量采用qRT-PCR测定。【结果】黑暗培养下的大豆芽苗菜子叶为黄色，而白光（W）、蓝光（B）和UV-A培养下的大豆芽苗菜子叶为绿色。与黑暗培养及其他光质处理相比，UV-A显著提高大豆芽苗菜下胚轴中花青苷含量；随着处理时间的延长，花青苷积累逐渐增加。0 h处理下，大豆芽苗菜下胚轴中花青苷含量较低，约2 U·g^-1FW。经36 h的UV-A处理，大豆芽苗菜下胚轴中花青苷含量达到最大值（43 U·g^-1FW），显著高于黑暗及其他光照处理。0 h处理下，PAL和CHI酶活性较高。与黑暗培养及其他光质处理相比，24 h及36 h UV-A处理显著提高了PAL酶活性；12 h及24 h UV-A处理显著提高了UFGT酶活性。0 h处理下，不同处理间的花青苷合成相关基因表达均无差异。与黑暗培养及其他光质处理相比， UV-A处理36 h显著上调了MYB75、CRY1、CRY2及UVR8的表达，分别上调约12倍、30倍、6倍和2倍；UV-A处理12 h显著上调了花青苷合成相关结构基因（PAL、CHS、CHI、DFR、ANS、UFGT）的表达，分别上调约5倍、58倍、10倍、6倍、44倍和47倍。【结论】UV-A通过提高PAL、UFGT酶活性及上调花青苷合成和光受体相关基因的表达，诱导了大豆芽苗菜下胚轴中花青苷的积累。

‘华红’苹果果肉的流变特性及其主成分分析

杨玲，张彩霞，康国栋，田义，丛佩华

中国农业科学. 2015, 48(12): 2417-2427. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.12.015

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【目的】研究‘华红’苹果果肉在贮藏期间的流变特性（蠕变、松弛）变化规律，并进行流变特性参数间的相关性分析，用流变学方法预测评价果实质地品质，完善苹果果实品质评价体系。【方法】通过对‘华红’苹果果肉蠕变、松弛特性的研究，分别建立四元件Burger’s蠕变模型和三元件Maxwell应力松弛模型；分析蠕变、松弛参数随贮藏时间的变化规律，进行蠕变、松弛特性参数之间相关性分析，并利用SPSS软件进行蠕变、松弛特性主要参数的主成分分析。【结果】在‘华红’苹果贮藏过程中，蠕变特性参数初始弹性系数E₁，延迟弹性系数E₂，黏性系数η₁、η₂变化规律基本一致,均呈下降趋势，且这些参数间两两都呈极显著正相关；蠕变量呈缓慢上升趋势，与以上4个蠕变特性参数呈极显著负相关；延迟时间τ也呈缓慢上升趋势，达到最大硬度时做功呈先升高后降低的趋势，这两个蠕变特性参数和以上5个蠕变特性参数相关性较差；松弛特性参数零时弹性模量E₀、平衡弹性模量E_e、衰变弹性模量E₁、黏滞系数η、硬度、应力和总功变化规律基本一致，呈先下降略有升高后下降的变化趋势，且这7个松弛特性参数之间都呈极显著正相关。松弛时间T与其他7个松弛特性参数变化规律不一致，而且与它们相关性较差。运用主成分分析蠕变、松弛特性参数，第一主成分对10个变量指标的提取很充分，贡献率为88.828%。第一主成分‘流变因子’F1在贮藏过程中随着果实质地变软、食用品质的下降而呈下降趋势。【结论】‘华红’苹果果肉具有压缩黏弹性力学性质，四元件Burger’s模型和三元件Maxwell模型可以很好地拟合‘华红’苹果蠕变、松弛模型，可表征‘华红’苹果果肉贮藏期间流变力学特性变化规律，反应果肉质地变化状况。

猪宰后肌肉体系中μ-calpain及肌原纤维蛋白理化特性的变化规律

魏秀丽，谢小雷，张春晖，李侠，王春青

中国农业科学. 2015, 48(12): 2428-2438. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.12.016

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【目的】研究猪宰后1—168 h，肌肉体系中μ-calpain及肌原纤维蛋白理化特性变化规律，并探究肌肉持水性变化机理，为冷鲜肉汁液流失控制提供理论依据。【方法】取宰后1 h内的猪背最长肌，在4℃条件下分别成熟6、12、24、72、120和168 h，通过活性电泳（casein zymography）对μ-calpain活性定量分析，对肌原纤维小片化指数（myofibril fragmentation index，MFI）进行过程测定，利用SDS-PAGE变性凝胶电泳分析肌原纤维蛋白降解聚合情况，研究宰后肌肉的成熟与肌原纤维蛋白的结构变化规律；通过测定肌原纤维蛋白表面疏水性和溶解性，考察肌原纤维蛋白水合力的变化，利用加压滤纸法测定肌肉的持水性（water-holding capacity，WHC），并借助低场核磁共振技术（low field nuclear magnetic resonance，LF-NMR）定性定量考察肌肉3种不同状态水（结合水、不易流动水及自由水）的分布和迁移。【结果】宰后1—24 h，μ-calpain活性升高，肌原纤维蛋白未发生明显降解，MFI无显著变化（P＞0.05）。宰后24 h肌肉进入成熟期，μ-calpain活性逐渐下降，MFI值显著升高（P＜0.05），肌原纤维蛋白显著降解，肌肉持水性随之改变。肌肉成熟过程中，μ-calpain作用于肌肉蛋白导致蛋白质结构伸展并降解，一方面会有低分子量的蛋白生成，增加蛋白质的比表面积，使其溶解度增加；另一方面也有疏水残基的暴露及蛋白的交联聚合，导致蛋白溶解度降低，表面疏水性增加，这两者之间的竞争结果决定了降解后蛋白质的水合特性。其中，宰后24—120 h，μ-calpain适度降解肌原纤维蛋白，溶解度显著升高（P＜0.05），使肌肉中不易流动水P₂₂升高（r=0.286，P＜0.01），自由水P₂₃下降（r=-0.246，P＜0.05）；肌原纤维蛋白内部疏水性残基的暴露引起表面疏水性显著升高（P＜0.05），致使肌肉自由水P₂₃升高(r=0.319，P＜0.01)；LF-NMR-T₂结果表明结合水P₂₁与不易流动水P₂₂的相关系数为r=-0.890（P＜0.01），不易流动水P₂₂与自由水P₂₃的相关系数为r=-0.360（P＜0.01），表明结合水和自由水会“态变”为不易流动水，蛋白结合水随着蛋白质的高级结构被破坏，结合水被释放，转变为不易流动水，同时肌肉蛋白的降解导致位于肌纤维细胞外的自由水流回肌纤维细胞内部，肌肉持水性升高。宰后120—168 h，肌原纤维蛋白的高度降解，引发低分子量蛋白相互聚集，表面疏水性和溶解度下降，肌肉中不易流动水P₂₂降低（P＜0.05），自由水P₂₃升高（P＜0.05），不易流动水“态变”成自由水，肌原纤维结构内的不易流动水逐渐流向肌原纤维外的空隙，变为自由水，从而造成新的汁液流失，肌肉持水性下降。【结论】宰后24—120 h，μ-calpain介导的肌原纤维蛋白降解，使蛋白溶解度和表面疏水性增加，水合力上升，肌肉中结合水和自由水“态变”为不易流动水，肌肉持水性升高。宰后120—168 h，肌原纤维蛋白进一步降解，低分子量蛋白发生交联聚合，蛋白水合力降低，肌肉中不易流动水“态变”成自由水成为汁液流失。

EGF、EGFR在牦牛卵母细胞中的表达及对胚胎发育能力的作用

潘阳阳，李秦，崔燕，樊江峰，杨琨，何俊峰，余四九

中国农业科学. 2015, 48(12): 2439-2448. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.12.017

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【目的】探明表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）及其受体（EGFR）在牦牛卵母细胞成熟过程中的表达动态，并且研究EGF对牦牛卵母细胞成熟的影响及可能的分子作用机制。【方法】采集牦牛卵巢，捡取质量较好的牦牛卵丘-卵母细胞复合体（cumulus-oocyte complexes，COCs），进行体外成熟培养；分别处理未成熟和成熟的牦牛COCs，采用Real-time PCR和间接免疫荧光方法检测COCs成熟过程中EGF及EGFR在基因和蛋白水平的表达动态；牦牛COCs成熟培养时在基础培养基中分别添加0、50、100和200 ng·mL^-1EGF及最佳作用浓度的EGFR抑制因子Gefitinib，比较作用前后卵母细胞成熟率、受精后卵裂率及囊胚率；Real-time PCR方法分析不同浓度EGF和Gefitinib作用后成熟COCs中凋亡相关基因Bax和Baxi的相对表达量。【结果】EGF，EGFR基因在成熟COCs的表达显著高于未成熟COCs，成熟COCs中EGF基因的相对表达量为未成熟COCs 的2.17±0.36倍，EGFR基因在成熟COCs的表达量为未成熟COCs 6.82±0.21倍，且在未成熟和成熟COCs中EGFR基因表达量均显著高于EGF。免疫荧光检测显示未成熟COCs和成熟COCs均表达EGF和EGFR蛋白，EGF和EGFR蛋白的标记荧光主要集中在卵丘细胞，卵母细胞表达较弱。100 ng·mL^-1 EGF可以显著提高COCs成熟率（73.45±2.09）%及其受精后的卵裂率（59.46±1.41）%和囊胚率（26.23±1.08）%；对照组中（0 EGF）COCs成熟率为(54.16±3.25)%，卵裂率为 (48.33±1.93)%，囊胚率为(15.34±0.43)%；EGF浓度为50 ng·mL^-1时成熟率、卵裂率及囊胚率分别为(61.79±1.04)%、(51.76±0.61)%和(18.62±1.13)%；200 ng·mL^-1成熟率、卵裂率及囊胚率分别为(71.26±4.18)%、(57.13±2.06 )% 和(23.96±0.53)%；而加入EGFR抑制因子Gefitinib显著的降低了COCs的成熟率及其受精后的卵裂率及囊胚率，分别为(43.63±1.46)%、(41.79±2.81)%和(12.65±0.67)%。COCs成熟过程中EGF的作用可以显著抑制促凋亡基因Bax的表达，在50 ng·mL^-1、100 ng·mL^-1、200 ng·mL^-1EGF作用后成熟COCs中Bax基因的相对表达量分别仅为对照组（0 EGF）的0.83±0.12，0.21±0.02，0.27±0.03倍，EGF浓度为100 ng·mL^-1时Bax基因表达量最低，而Gefitinib作用后可以显著促进成熟COCs中Bax基因的表达，其相对表达量为对照组的4.24±0.10倍；EGF在COCs成熟过程中可以显著促进抗凋亡基因Baxi的表达，其相对表达量在EGF浓度为50、100、200 ng·mL^-1EGF分别为对照组的2.18±0.12、7.06±0.59和6.73±0.31倍，EGF浓度为100 ng·mL^-1时Baxi基因表达量最高，而Gefitinib作用后可以显著降低成熟COCs中Baxi基因的表达，其相对表达量为对照组的0.32±0.04倍。【结论】EGF和EGFR作为牦牛COCs体外成熟过程中重要的自分泌因子，且外源的EGF可以显著提高卵母细胞成熟率、卵裂率及囊胚率，最佳作用浓度为100 ng·mL^-1，其作用机制可能与调控凋亡相关基因Bax和Baxi表达有关。

基于¹H NMR技术的奶牛I型和II型酮病血浆代谢谱分析

李影，徐闯，夏成，张洪友，孙玲伟，许楚楚

中国农业科学. 2015, 48(12): 2449-2459. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.12.018

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【目的】运用代谢组学中¹H NMR技术方法筛选出Ⅰ型酮病、Ⅱ型酮病与健康对照组之间血浆差异性代谢物。【方法】选取产后7—28 d，平均胎次为2—3胎的实验奶牛50头。根据血糖（Glc）、β-羟丁酸（BHBA）和游离脂肪酸（NEFA）的含量与临床发病特点分为Ⅰ型酮病、Ⅱ型酮病与健康对照组，其中Ⅰ型酮病20头，Ⅱ型酮病为20头，健康对照组为10头。当患病牛血中BHBA＞1.20 mmol·L^-1，Glc＜2.50 mmol·L^-1，NEFA＞0.50 mmol·L^-1时，被认为患I型酮病；当患病牛血浆中BHBA＞1.20 mmol·L^-1，Glc＞2.80 mmol·L^-1, NEFA＞0.50 mmol·L^-1时，被认为患II型酮病；当奶牛血中BHBA＜1.00 mmol·L^-1，Glc＞3.75 mmol·L^-1，NEFA＜0.40 mmol·L^-1时，被认为健康对照组。运用代谢组学中¹H NMR技术对实验奶牛的血浆代谢物分析，获得相应的代谢图谱，并结合多元统计分析中的主成分分析（PCA）、正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）的模式判别，从而寻找潜在的生物标记物。【结果】通过¹H NMR分析，Ⅰ型酮病、Ⅱ型酮病与健康对照的代谢图谱差异明显，3组代谢产物各自聚集，分散区域显著。Ⅱ型酮病与健康对照比较，获得7种血浆差异代谢物，主要为丙氨酸、赖氨酸、β-羟丁酸、丙酮、乳酸等，其中血浆中β-羟丁酸、丙酮、乳酸浓度升高；丙氨酸、赖氨酸、酪氨酸、肌酸浓度呈现下降。Ⅰ型酮病与健康对照组比较，获得19种血浆差异代谢物，主要为酪氨酸、苯丙氨酸、肌酸、β-羟丁酸、丙酮等，其中β-羟丁酸、丙酮浓度升高；酪氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、组氨酸、丙氨酸、肌酸、肌醇、β-葡萄糖、谷氨酰胺、谷氨酸、柠檬酸、α-葡萄糖、甲酸、甘氨酸、O-乙酰葡萄糖胺、磷酸胆碱浓度呈现下降。Ⅰ型酮病与Ⅱ型酮病比较，获得24种血浆差异代谢物，主要为柠檬酸、组氨酸、β-葡萄糖、异亮氨酸、极低密度脂蛋白/低密度脂蛋白等，其中β-羟丁酸、低密度脂蛋白和极低密度脂蛋白、异亮氨酸、缬氨酸、丙酮、亮氨酸、乙酸浓度升高；柠檬酸、酪氨酸、组氨酸、肌醇、谷氨酰胺、β-葡萄糖、苯丙氨酸、谷氨酸、α-葡萄糖、赖氨酸、甲酸、甘氨酸、磷酸胆碱、丙氨酸、O-乙酰葡萄糖胺浓度呈现下降。【结论】¹H NMR技术与多元统计分析的有效结合能够有效的筛选出Ⅰ型酮病、Ⅱ型酮病与健康对照组之间血浆差异性代谢物，为进一步探究奶牛Ⅰ型酮病、Ⅱ型酮病的发病机理和诊断与防治提供了新的方向。

TGF-β/Smad信号通路在Follistatin调节鸭骨骼肌卫星细胞增殖过程中的作用机制

林凯，虞德兵，解晓东，于敏莉，李东锋，杜文兴

中国农业科学. 2015, 48(12): 2460-2468. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.12.019

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【目的】卵泡抑素（Follistatin）能够调节骨骼肌肥大和脂肪沉积，可促进骨骼肌卫星细胞增殖。拟采用体外重组 Follistatin处理增殖期的鸭骨骼肌卫星细胞，阐明TGF-β/Smad信号通路在Follistatin调节鸭骨骼肌卫星细胞增殖过程中的作用机制。【方法】以孵化14 d的鸭胚为试验材料，采用差速贴壁的方法分离骨骼肌卫星细胞，待细胞长到70%—80%时，将培养基换成含有浓度分别为0、1、10、100 ng·mL^-1的Follistatin培养基，继续培养36 h后，采用CCK-8检测骨骼肌卫星细胞增殖情况；使用抗pax7抗体染色，DAPI染核，鉴定骨骼肌卫星细胞；采用real-time qPCR方法检测Follistatin对骨骼肌卫星细胞增殖过程中的标记基因PCNA、生肌因子基因MyoD和TGF-β信号通路中TGF-β、Smad2和Smad3的表达的影响。【结果】在倒置显微镜下观察，传代培养12 h鸭骨骼肌细胞一部分未贴壁呈圆形，一部分贴壁呈梭形。24 h后细胞全部贴壁，细胞略有变长。2 d后细胞继续增多，且呈长梭形。3 d后细胞数目增加，个别细胞融合。4 d后细胞数目进一步增加，细胞变粗，个别细胞融合。5 d后有少量细胞开始分化，细胞进一步融合。Pax7免疫荧光染色分析显示，95%以上的细胞中Pax7呈阳性表达；CCK-8检测细胞增殖分析表明，不同浓度的Follistatin处理鸭骨骼肌卫星细胞后，各处理组细胞增殖均显著高于对照组(P＜0.01)，且10 ng·mL^-1 Follistatin处理鸭骨骼肌卫星细胞增殖效果最明显，为最佳处理浓度；与对照组相比，10 ng·mL^-1 Follistatin处理组的MyoD基因表达量显著下降(P＜0.05)，PCNA基因表达量显著升高(P＜0.05)，Myf5基因表达量显著升高，TGF-β和Smad2基因表达显著升高(P＜0.05)，且Smad3基因表达量极限著升高(P＜0.01)；Western blotting检测蛋白表达水平结果表明，与对照组相比，TGF-β、Smad2 和Smad3磷酸化水平也显著升高。【结论】10 ng·mL^-1 Follistatin能显著促进鸭骨骼肌卫星细胞增殖，这一过程可通过TGF-β/Smad信号通路实现。使用最佳Follistatin处理浓度能够显著促进鸭骨骼肌卫星细胞增殖,该研究为鸭骨骼肌生长发育调控机理研究奠定分子基础。

利用全基因组SNP芯片分析油菜遗传距离与杂种优势的关系

桑世飞，王会，梅德圣，刘佳，付丽，王军，汪文祥，胡琼

中国农业科学. 2015, 48(12): 2469-2478. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.12.020

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【目的】利用单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，简称SNP）标记估算油菜优异亲本间的遗传距离，分析其与杂种优势间的关系，探讨利用SNP标记预测油菜杂种优势的可行性，为油菜杂种优势利用育种提供指导。【方法】将油菜波里马细胞质雄性不育系的6个保持系（1019B、1055B、6098B、8908B、6019B、ZS11B）和8个恢复系（R1、R2、R3、R6、R9、R10、R11、OR1）采用不完全双列杂交试验设计配制得到的46个F₁杂种及其亲本，在湖北武汉、贵州贵阳和安徽巢湖3种生态环境下考察株高、分枝部位高度、一次有效分枝数、结角密度、主花序有效长、主花序有效角果数、单株有效角果数、每角粒数、千粒重及单株产量共10个产量相关性状，统计各性状在每个F₁组合中的杂种优势，包括中亲优势和超亲优势。利用油菜全基因组60K SNP芯片对14个亲本进行基因型分型，对分型得到的SNP标记经质控后利用MEGA5.0软件估算亲本间的遗传距离，采用非加权类平均法（unweighted pair group method arithmetic averages，UPGMA）对亲本进行聚类分析，利用SAS9.1软件进行遗传距离与性状杂种优势的相关性分析。【结果】14个亲本经油菜全基因组60K SNP芯片进行基因型分型后共得到52 157个SNP位点，经质量控制后，最终筛选出40 201个SNP有效位点用于亲本遗传距离计算及聚类分析。14个亲本中以6098B与6019B的遗传距离最小，ZS11B与R6的遗传距离最大，所有亲本间的遗传距离介于0.1883—0.8811，平均为0.5217。14个亲本被分成4个主群，6个保持系为一个主群，8个恢复系中OR1单独为一个主群，R1、R3、R11为一个主群，R2、R6、R9、R10为一个主群，证明恢复系群体的遗传变异大于保持系，分群结果与实际系谱相符。所考察的10个性状的中亲优势均值变幅为-0.07%—38.78%，超亲优势均值变幅为-7.74%—20.78%。10个性状中除了一次有效分枝数外，其他性状的杂种优势效应显著，尤其是株高、每角粒数、分枝部位高度和单株产量，平均中亲优势分别达到6.83%、15.31%、16.13%和38.78%，正向中亲优势组合数分别有45、41、46和46个；平均超亲优势分别达到3.18%、5.19%、7.85%和20.78%，正向超亲优势的组合数分别有41、31、42和44个。10个性状中株高、分枝部位高度和单株产量的杂种优势与遗传距离的相关系数达到极显著正相关水平，该3个性状的中亲优势与遗传距离的相关系数分别为0.4200、0.5033和0.4711，超亲优势与遗传距离的相关系数分别为0.3884、0.4051和0.4038，而其他性状的杂种优势与遗传距离的相关性不显著。【结论】SNP标记在油菜基因型分型、遗传距离估算及聚类分析的研究中优势明显，基于全基因组SNP标记估算的遗传距离与油菜株高、分枝部位高度和单株产量的杂种优势相关性极显著，说明基于油菜60K SNP芯片分析亲本的遗传关系预测油菜杂种优势的效果显著。

TRV介导的大豆基因瞬时沉默体系的建立

刘晓彬，刘娜，李福宽，吴立柱，张洁，王冬梅

中国农业科学. 2015, 48(12): 2479-2486. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.12.021

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【目的】病毒诱导的基因沉默（virus-induced gene silencing，VIGS）技术已在植物基因功能研究领域得到广泛应用。建立以TRV为载体介导的大豆基因瞬时沉默体系，为将烟草脆裂病毒（Tobacco rattle virus，TRV）介导的基因沉默技术在大豆与大豆花叶病毒（Soybean mosaic virus，SMV）互作体系中对大豆基因功能进行研究提供基础。【方法】从大豆品种冀豆7号（J7）叶片中特异性扩增八氢番茄红素脱氢酶基因（GmPDS）的部分片段，并将该基因片段插入质粒pTRV﹕RNA2中；向J7的第一位真叶注射携带有TRV或TRV﹕GmPDS的农杆菌，注射后对上部未接种病毒的叶片进行表型观察，并通过半定量RT-PCR检测GmPDS的表达量。为探讨接种TRV是否影响大豆对SMV的抗性表现，在大豆第一片真叶上预接种TRV病毒后10 d，再分别接种SMV株系N3和SC-8，以单独接种N3或SC-8作为对照。待接种SMV后第5天观察未接种的上位叶表型并检测SMV的外壳蛋白基因CP。【结果】大豆叶片注射携带有TRV﹕GmPDS的农杆菌后25 d，上部未接种病毒的叶片出现了白化现象，通过半定量RT-PCR分析，发生白化的植株中GmPDS的表达量明显降低。在此基础上，向大豆叶片预注射携带有TRV的农杆菌后再接种SMV，SMV株系N3和SC-8与J7分别组成不亲和与亲和组合。发现J7第一片真叶上预接种TRV后再接种SMV株系N3，与单独接种N3对上位叶的影响在表型上表现一致，对未接种的上位叶片进行病毒外壳蛋白基因CP检测，发现J7单独接种N3以及预接种TRV后再接种N3的上位叶片上均未能检测到CP表达。而J7单独接种SMV株系SC-8，以及预接种TRV后再接种SC-8均在上位叶上能够检测到CP。说明在J7上预接种TRV不影响J7对SMV的抗性。在感病品种南农1138-2上也获得了相似结果。【结论】建立了以TRV为载体介导的大豆基因瞬时沉默体系，并证明在大豆上先接种TRV不改变大豆对SMV的抗性表现。

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