中国农业科学

2006—2015年中国小麦质量年度变化

胡学旭，孙丽娟，周桂英，吴丽娜，陆伟，李为喜，王爽，杨秀兰，宋敬可，王步军

中国农业科学. 2016, 49(16): 3063-3072. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.16.001

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【目的】中国小麦由强筋小麦、中强筋小麦、中筋小麦和弱筋小麦4种类型构成，分析近10年来各类型小麦年度质量变化，探讨小麦生产质量现状、存在的问题和解决方法，为小麦生产、科研、购销和加工等环节提供必要的参考。【方法】对2006—2015年中国小麦生产区742个小麦品种7 561份样品的容重、蛋白质含量、湿面筋含量、沉淀指数和面团流变学特性进行测定，分析各类型小麦年度比例和8个主要品质性状年度变化。【结果】小麦品种结构有所改善，但达标样品比例较低。从品种比例看，强筋品种、中强筋品种、中筋品种和弱筋品种比例分别为12.6%、16.7%、68.7%和2.0%，年度间保持稳定。从样品比例看，强筋小麦、中强筋小麦、中筋小麦和弱筋小麦样品比例分别为21.0%、16.9%、49.4%和3.8%；各类型小麦样品比例年度间变化差异较大，年度间强筋小麦和中筋小麦呈此消彼长趋势，中强筋小麦呈缓慢增加趋势，弱筋小麦呈下降趋势。从达标样品比例看，各类型小麦达标比例较低，强筋小麦、中强筋小麦、中筋小麦和弱筋小麦达标比例分别为4.8%、4.6%、25.0%和0.4%。中国小麦总体质量表现为中筋小麦水平，容重、蛋白质含量和湿面筋含量年度间变化趋势不明显，沉淀指数、粉质和拉伸参数呈小幅下降趋势。强筋小麦、中强筋小麦和中筋小麦品质性状年度间保持相对稳定，沉淀指数、粉质和拉伸参数变化趋势基本相同；弱筋小麦近年来蛋白质含量、湿面筋含量和沉淀指数年度平均值增加，品质下降。不同类型小麦品质性状差异较大，容重年度平均值大小依次为中强筋小麦＞强筋小麦＞中筋小麦＞弱筋小麦，蛋白质含量和湿面筋含量年度平均值大小依次为强筋小麦＞中筋小麦＞中强筋小麦＞弱筋小麦，沉淀指数、粉质和拉伸参数年度平均值大小依次为强筋小麦＞中强筋小麦＞中筋小麦、弱筋小麦；年度平均值变幅不同，其中沉淀指数、粉质和拉伸参数年度平均值变幅大小依次为强筋小麦＞中强筋小麦＞中筋小麦、弱筋小麦。【结论】中国小麦品种结构有所改善，各类型小麦达标比例较低，小麦质量有较大提升空间。应通过选育和推广高产优质专用小麦品种、合理增加现有各类型优质小麦品种面积和加大政策扶持力度等途径，优化品种结构，提高小麦质量。

油菜开花期QTL定位及与粒重的遗传关联性

黄吉祥，熊化鑫，潘兵，倪西源，张晓玉，赵坚义

中国农业科学. 2016, 49(16): 3073-3083. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.16.002

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【目的】明确中国和欧洲油菜开花期主控位点及其对粒重的影响，为早熟油菜品种选育提供科学依据。【方法】以欧洲冬油菜Sollux和中国品种高油605的选系（Gaoyou）杂交F1经小孢子培养产生的DH群体为材料，采用7年9种环境下的开花期表型数据和新版SG图谱定位开花期QTL，并采用条件遗传学和QTL分析相结合的条件QTL定位方法，解析开花期对千粒重QTL的影响，最后对各20个极端开花期株系的基因型和表现型进行性状－标记的符合度测定，为标记筛选用于辅助选育提供依据。【结果】应用WinQTLCart 2.5复合区间作图法，共检测到7个在3种以上环境中稳定表达的控制开花QTL，加性效应值在0.58—3.85 d，解释了表型总变异的84%。8对上位性QTL效应总和为加性总效应的41.8%。QTL与环境互作效应只在少数位点和个别环境中显著。在3个主效QTL峰值或相近位置上定位了4个在拟南芥中调控开花的关键基因FT、API、FLC和FY的6个同源拷贝，为发掘控制这些QTL的候选基因提供了有价值的参考信息。条件QTL分析表明，在4个增重效应均来自Gaoyou的千粒重QTL位点（qSWA2、qSWA3、qSWA4和qSWC2），大粒等位基因效应可能与开花早、籽粒灌浆期长有关。通过选择这些位点的早开花标记基因型有望同时提高种子千粒重，这也部分给出了开花期与千粒重之间极显著负相关的遗传解释，但2个粒重主效位点（qSWA7和qSWC8）的遗传效应不受开花期影响。根据SG群体极端开花期株系在3个效应值最大的QTL（qFTA2、qFTC2和qFTC6）区域标记基因型和开花期表现型的关联分析，筛选获得6个高质量、高吻合度的共显性标记推荐育种应用。qFTA2位点，标记辅助准确率为70%－80%；qFTC2和qFTC6位点的选择效率达到80%－100%。基因型组配分析显示，聚合qFTA2、qFTC2和qFTC6的早开花等位基因，可显著提早开花期，同步增加千粒重但不影响含油量和角果粒数。【结论】7个QTL均显示早开花等位基因来自中国亲本。拟南芥中调控开花关键基因FT、API、FLC和FY的6个同源拷贝定位到3个主效QTL峰值位置。开花迟、早显著影响4个千粒重QTL位点，但2个最重要的粒重位点（qSWA7和qSWC8）不受影响；3个主效QTL（qFTA2、qFTC2和qFTC6）的6个共显性标记可用于早熟基因的转育和早熟材料的筛选。

中国3个主栽烟草品种的差异蛋白质组学研究

徐莹，晏国全，张扬，余红秀

中国农业科学. 2016, 49(16): 3084-3097. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.16.003

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【目的】从全蛋白质组学水平研究烟草，筛选具有重要特性的蛋白质，阐明其相关代谢通路，使得烟草的基础科学研究和品种培育工作有所突破。【方法】利用苯酚法提取中国3个主栽烟草品种红花大金元、K326和云烟87叶片的蛋白质，酶解后采用串联质量标签技术（tandem mass tag，TMT）标记，结合二维液相色谱串联质谱技术（2D LC-MS/MS）对3个烟草品种叶片的蛋白质组成进行分析，运用Proteome Discoverer软件提取谱图后在 MASCOT 搜索引擎上鉴定蛋白质和肽段，并对鉴定的蛋白质进行系统的生物信息学分析，包括数据相关性分析、分层聚类分析和主成分分析，同时按照2倍上下调的原则采用火山图筛选不同品种烟草中表达差异显著的蛋白质，最后利用KEGG通路分析烟草中重要蛋白质的分布及功能。【结果】鉴定红花大金元、K326和云烟87烟草样品的蛋白质Group总数为3 079，蛋白质ID数为10 343。从分层聚类分析和主成分分析中蛋白质的整体表达情况可见，K326和云烟87蛋白质表达情况较相似，而红花大金元与前两者相差较大。后续的差异蛋白质筛选也验证了该结果，表现为云烟87和K326之间仅存在29个差异表达的蛋白质，其中13个蛋白质覆盖8条代谢通路，包括类黄酮生物合成，参与类黄酮合成路径的查尔酮合成酶在K326中的相对含量显著高于云烟87。红花大金元和云烟87之间有160个蛋白质差异表达，其中103个蛋白质覆盖42条代谢通路，包括谷胱甘肽代谢，相对定量结果显示谷胱甘肽代谢途径相关的3种酶，谷胱甘肽过氧化物酶、磷脂过氧化氢物谷胱甘肽过氧化物酶和谷胱甘肽S-转移酶在红花大金元中的含量均显著低于云烟87。红花大金元和K326之间存在119个差异蛋白质，其中89个蛋白质覆盖41条代谢通路，包括外源物质细胞色素P450代谢。筛选获得的重要差异蛋白质的相对定量结果显示一些与抗性相关的蛋白质，如蛋白酶抑制剂，在云烟87中的表达量远低于K326和红花大金元，同时结果表明红花大金元中的超氧化物歧化酶含量处于较低水平。【结论】TMT技术结合2D LC-MS/MS可对不同品种烟草的叶片蛋白质进行有效地分离和鉴定，鉴定出的蛋白质大部分是参与光合作用、物质代谢或者与抗逆性相关。

木耳菌糠的5种前处理对水稻育苗基质性质及稻苗生长的影响

刘斌，韩亚男，袁旭峰，朱万斌，王小芬，崔宗均

中国农业科学. 2016, 49(16): 3098-3107. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.16.004

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【目的】以未经处理的木耳菌糠作水稻育秧基质存在腐熟度严重不足的问题，采用5种不同的前处理，探明针对基质性质和秧苗生长情况最优的处理方式，为农业废弃物作水稻育秧基质的开发利用提供参考。【方法】采用菌糠生材料（T1）、堆腐发酵（T2）、加10%猪粪堆腐发酵（T3）、蒸汽灭菌（T4）、干热灭菌（T5）等5种处理方式，以土壤为对照，并模拟东北地区春季气候条件，进行温室水稻育秧试验。综合分析各处理基质容重、孔隙度（总孔隙度、持水孔隙度、通气孔隙度）、养分（总氮、总磷、总钾、有机质含量、碱解氮、速效磷、速效钾）、苗期立枯病发生情况（离乳期的发病面积和病斑数量）和稻苗生长状况（苗龄30 d后，水稻秧苗的农艺性状，包括叶龄、单株根数、株高、茎粗、SPAD值、百株干鲜重）等指标，并采用单位容积营养元素含量的计算方法替代传统的质量比，来比较5种处理间差异。【结果】经处理后，基质的容重均达到理想基质要求；与生材料T1相比，T2和T3总孔隙和持水孔隙度均明显上升，T4和T5孔隙度有所下降。单位容积营养元素含量，全氮以T3最高（3.0×10^-3 g·cm^-3），其他处理全氮为1.6×10^-3—1.8×10^-3 g·cm^-3；全磷为4.0×10^-4—6.0×10^-4 g·cm^-3，全钾含量以T2最高（1.4×10^-3 g·cm^-3），其他处理全钾为7.0×10^-4—9.0×10^-4 g·cm^-3；总有机质含量均为6.6×10^-2—8.0×10^-2 g·cm^-3；碱解氮含量以T3最高（2.1×10^-4 g·cm^-3），其他处理为0.9×10^-4—1.2×10^-4 g·cm^-3；速效磷含量均为3.3×10^-5—5.0×10^-5 g·cm^-3；速效钾含量均为0.6×10^-4—1.2×10^-4 g·cm^-3；另外，通过计算不同处理育秧基质的C/N显示，仅添加猪粪发酵的T3处理在20以下。水稻立枯病发生情况，综合分析离乳期病斑数目和发病面积，得出T1发病率为30.53%，T5发病率为3.27%，T2和T4发病率均为1.09%，而T3未出现立枯病。30 d龄稻苗，株高在12—14 cm，茎粗在0.21—0.23 cm，三叶期叶片总SPAD值为25—35，T3处理在此三方面均表现最好；百株鲜重范围在14.50—16.00 g，百株干重为3.15—3.75 g，最大为T2和T3处理；根冠比最大值为T2和T3（0.30），最小值为T5（0.22），5组处理全株干鲜比均在0.20—0.23。【结论】前处理并不显著影响木耳菌糠等材料的养分含量，其主要由构成基质材料的本身性质决定；堆制腐熟发酵的前处理方式在基质性质和秧苗生长情况上都表现很好，且减轻立枯病的效果明显，尤其是添加10%猪粪堆腐发酵表现最优，是今后利用农业废弃物开发水稻无土育秧基质值得推广的前处理手段。

灌浆期控水和施用控释肥对杂交玉米制种产量和种子质量的影响

任利沙，顾日良，贾光耀，田开新，施秀德，王建华

中国农业科学. 2016, 49(16): 3108-3118. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.16.005

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【目的】研究灌浆期控水和控释肥施用对不同收获期杂交玉米种子产量和质量的影响，明确最适宜的收获时期及有效的水肥管理方式，为中国高质高效玉米制种提供理论和技术支撑。【方法】试验于2014和2015年在甘肃省张掖市甘州区进行，以京科968为试验材料，在田间采用两因素裂区试验设计, 主区为水分管理方式，设常规灌溉浇水和授粉后35 d停止浇水2种方式；副区为施肥处理方式，设施用传统复合肥和施用控释肥配比尿素2种处理。从授粉后44 d开始，每隔3 d采集果穗，至授粉后68 d共9个收获期，测定每个时期种子的籽粒水分、百粒重，并计算每公顷的产量和籽粒数（粒数产量）；籽粒自然晾干后用于种子活力分析，包括标准发芽率、人工加速老化发芽率和电导率测定。【结果】施肥和灌水方式均显著影响京科968的制种产量和粒数产量，但对籽粒水分、百粒重和种子活力没有影响。与传统施肥相比，施用控释肥后，制种产量增加3.10%，粒数产量提高2.13%。如果按粒包装销售，施用控释肥可显著提高制种的经济效益，正常灌溉条件下每公顷增收0.44—2.17万元，控水条件下增收0.12—1.35万元。灌浆期控水导致制种产量降低2.01%，粒数产量降低2.48%，经济效益降低0.11—1.78万元。收获期对制种产量、籽粒水分、百粒重和种子活力均有显著影响，但对粒数产量无显著影响。随着收获期推后，籽粒灌浆进程逐渐完成，籽粒水分逐渐降低，而百粒重不断增加。至授粉后68 d，百粒重仍在增加，说明此时京科968种子尚未达到生理成熟。两年的结果表明，授粉后56—65 d，京科968种子的标准发芽率、人工加速老化发芽率均达到最高，而种子浸出液电导率值达到最低，说明此阶段是京科968种子的最佳收获期，既可以保证种子的高活力，又可以有效避免当种子达到生理成熟时收获可能遇到的低温冻害风险。【结论】授粉后56—65 d为京科968种子的最佳收获期，此时收获既可保证种子的高活力，也不影响种子的粒数产量。施用控释肥和常规灌溉可提高京科968制种的产量和粒数产量，但对种子活力没有显著影响，在节省劳动力的同时提高制种经济效益。

三重PCR检测黄瓜靶斑病菌、炭疽病菌和细菌性角斑病菌

高士刚，曾蓉，徐丽慧，罗金燕，陈磊，戴富明

中国农业科学. 2016, 49(16): 3119-3129. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.16.006

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【目的】开发一种可同时检测黄瓜靶斑病菌（Corynespora cassiicola）、黄瓜炭疽病菌（Colletotrichum orbiculare）和黄瓜细菌性角斑病菌（Pseudomonas syringae pv. lachrymans）的三重PCR快速检测方法。【方法】根据ITS或16S rDNA序列分别设计黄瓜靶斑病原菌、黄瓜炭疽病菌和黄瓜细菌性角斑病菌特异性检测引物；通过鉴定引物的特异性，筛选可在目标菌株中扩增出特异片段的特异引物；选择可以组合的3种病原菌特异性引物进行三重PCR，对引物浓度、退火温度、延伸时间和循环数分别进行优化，优化三重PCR体系。【结果】针对黄瓜靶斑病菌、黄瓜炭疽病菌和黄瓜细菌性角斑病菌分别设计出5对、7对和6对特异性引物，其中引物CC4F/CC4R和CC5F/CC5R可特异扩增黄瓜靶斑病菌ITS，引物CL1F/CL1R、CL2F/CL2R、CL3F/CL3R、CL3F/CL4R、CL3F/CL5R、CL3F/CL6R和CL3F/CL7R可特异扩增黄瓜炭疽病菌ITS，引物PS3F/PS4R和PS4F/PS4R可特异扩增黄瓜细菌性角斑病菌16S rDNA。引物CC5F/CC5R、CL3F/5R和PS3F/4R扩增片段长度分别为370、275和698 bp，其混合扩增产物可在3%琼脂糖凝胶上得到充分分离，这3对引物选择作为三重PCR引物。在三重PCR反应体系中，当引物CC5F/CC5R、CL3F/5R和PS3F/4R的终浓度分别为0.16、0.4和0.16 μmol·L^-1时，3个目的片段能同时得到有效扩增；当退火温度大于65℃时，部分目的片段不能有效扩增。最终建立并验证了适合上述3种黄瓜主要病原菌的三重PCR检测体系，即25 μL PCR反应体系中含有12.5 μL 2×HiffTM PCR Master Mix（With Dye）、0.16 μmol·L^-1 CC5F/CC5R、0.4 μmol·L^-1 CL3F/CL5R、0.16 μmol·L^-1 PS3F/PS4R。反应程序：95℃预变性3 min；95℃变性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸2 min，35个循环；最后72℃延伸10 min。【结论】建立的三重PCR方法能够快速检测田间采集的黄瓜发病叶片中的黄瓜靶斑病菌、黄瓜炭疽病菌和黄瓜细菌性角斑病菌，灵敏度均可达到0.4 pg·μL^-1。

Bt Cry1类毒素共性结构域的分析、表达及鉴定

刘贝贝，张霄，谢雅晶，焦凌霞，刘媛，张存政，赵岩岩，武爱华，刘贤金

中国农业科学. 2016, 49(16): 3130-3139. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.16.007

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【目的】分析定位Bt Cry1类毒素Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1B、Cry1C、Cry1F的共性结构域，克隆并表达共性结构域蛋白，为筛选Bt毒素广谱抗体及建立广谱检测方法打下基础。【方法】利用生物信息学和分子模拟技术，通过SWISS-MODEL同源建模分别对5种Cry1类毒素进行三维建模，并结合Ramachandran plot、ERRAT和Verify3D方法评价模型构象的合理性。通过分析比对5种Cry1类毒素的三维结构，确定Domain I 区域作为5种Cry1毒素的共性结构域。以含Cry1Ac基因的苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种为模板设计引物，PCR扩增获得共性结构域Domain I基因，将其经Nco I和Not I双酶切连接至原核表达载体pET-26b(+)，构建原核表达载体pET-26b-Domain I。重组质粒经菌液PCR、双酶切以及测序鉴定验证正确后，转化至E.coli BL21（DE3），经终浓度为1 mmol·L-1的IPTG在20℃下诱导表达16 h后检测共性结构域蛋白的表达情况。离心收集诱导表达的大肠杆菌菌液，进行超声波破碎处理，收集上清及沉淀，采用 SDS-PAGE 分析融合蛋白的表达。利用His-Trap HP镍亲和柱纯化上清中的可溶性融合蛋白，经SDS-PAGE电泳、Western blot和ELISA试验验证纯化的共性结构域蛋白的生物活性。【结果】基于氨基酸序列及三维空间比对分析，发现5种Cry1类毒素的Domain I 的序列一致性最高，而且它们的DomainⅠ三维结构几乎完全重合，确定Domain I 区域作为5种Cry1毒素的共性结构域；通过PCR、双酶切及测序鉴定成功构建原核表达载体pET-26b-Domain I，经IPTG诱导表达、His-Trap HP镍亲和柱纯化获得了可溶性的Domain I共性结构域蛋白；SDS-PAGE和Western blot证实表达的共性结构域蛋白的分子量约为33.4 kD，且能与抗His标签鼠单克隆抗体发生特异性反应；ELISA试验证实共性结构域蛋白与5种Cry1类毒素特异性抗体均具有很强的结合能力，抗原表位分析结果显示共性结构域蛋白具有和完整的Cry蛋白存在多个潜在抗原表位位点的特征，抗原表位区域所占的比例分别为48.4%和63.6%，表明共性结构域蛋白具有良好的免疫原性和免疫反应性。【结论】基于分子模拟与分子克隆技术，成功定位及表达纯化获得共性结构域蛋白，为下一步利用共性结构域为靶标分子制备广谱特异性识别Cry1类毒素抗体打下基础。

不同土壤类型冬小麦-夏玉米轮作施肥效应

黄晓婷，赵亚丽，杨艳，张星，张谋彪，李潮海

中国农业科学. 2016, 49(16): 3140-3151. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.16.008

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【目的】研究冬小麦-夏玉米轮作在不同类型土壤上的养分吸收特点及施肥增产效应，为因土施肥和资源高效利用提供依据。【方法】采用池栽试验，选用4种土壤（中壤潮土、砂壤潮土、砂姜黑土、黄褐土），设置3个施肥水平（不施肥、中量施肥、高量施肥），研究不同土壤的养分供应特点和施肥增产效应及肥料利用效率。【结果】在不施肥条件下，冬小麦、夏玉米的植株氮素、磷素、钾素积累量和产量在4种土壤上均表现为：中壤潮土＞砂姜黑土＞黄褐土＞砂壤潮土，表明不同土壤的养分供应能力和基础生产力差别较大。施肥显著增加了冬小麦、夏玉米植株的养分积累量和产量，周年植株氮素积累量增加37.7%—98.7%，磷素积累量增加23.6%—75.3%，钾素积累量增加29.3%—76.1%，周年作物增产26.5%—64.4%。冬小麦、夏玉米植株氮素、磷素、钾素积累的增加量和增产效果均表现为：砂壤潮土＞黄褐土＞砂姜黑土＞中壤潮土，整体表现出基础生产力较高的土壤，养分供应能力较强，施肥增产效应较小。冬小麦、夏玉米的肥料农学效率均表现为：砂壤潮土＞黄褐土＞砂姜黑土＞中壤潮土，即基础生产力较低的土壤，肥料的利用效率更高。高量施肥使砂壤潮土和黄褐土上冬小麦、夏玉米的植株养分积累量及产量显著增加，中壤潮土和砂姜黑土增加不显著。【结论】不同类型土壤的基础生产力不同，较高基础生产力的土壤养分供应能力较强，施肥增产效应较小，肥料利用效率较低；较低基础生产力土壤表达趋势相反。肥力较高的中壤潮土和砂姜黑土，应提高土壤养分的利用，降低肥料的施用量；肥力较低的砂壤潮土和黄褐土，应注意培肥地力，不断提高土壤的生产力。

放线菌JXJ-0136对白菜和豇豆生长的影响及其解磷作用

张炳火，李汉全，罗娟艳，杨建远，石红璆，孙凤珍

中国农业科学. 2016, 49(16): 3152-3161. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.16.009

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【目的】确定放线菌JXJ-0136的分类地位，分析其溶解不溶性磷的能力，在作物根际土壤定殖的情况及对蔬菜种子萌发、幼苗生长和蔬菜产量的影响，评价该菌在研制微生物肥料方面的潜在应用价值。【方法】利用培养特征、形态学特征和16S rRNA基因序列系统发育分析，初步确定菌株JXJ-0136的分类学地位；以白菜和豇豆为指示植物，采用琼脂平板法，研究该菌对蔬菜种子萌发和幼苗生长的影响；采用田间栽培试验，研究菌株对作物生长和产量的影响，测定栽培前后土壤总磷的含量，分析该菌对作物利用土壤磷效率的影响，并对作物根际土壤微生物进行分离纯化，分析该菌在根际土壤中的定殖情况；采用液体纯培养方式，研究菌株对不溶性无机磷和有机磷的溶解效率，分析其解磷机理。【结果】放线菌JXJ-0136在6—45℃、pH 4.0—13.0和0—4%（w/v）的盐浓度下均能生长，其中最适生长温度、pH和盐浓度分别约为28℃、pH 8.0和1%（w/v），在ISP2培养基上该菌气丝较发达，灰白色，孢子丝簇生，孢子长卵圆形；该菌16S rRNA基因序列与链霉菌Streptomyces violascens、S. somaliensis、S. hydrogenans、S. albidoflavus和S. daghestanicus的亲缘关系最近，相似性依次为97.98%、97.71%、97.30%、97.23%和97.03%，但在系统进化树上与这些菌聚在不同分支上；该菌培养液能够显著提高作物种子萌发率，促进幼苗生长，在0.2%—0.8%的剂量下，白菜种子萌发率、幼苗株高和根长分别比对照组增加3.55%—12.61%、13.91%—53.03%和7.37%—51.92%，豇豆种子萌发率、幼苗株高和根长分别比对照组增加4.71%—21.18%、3.60%—22.33%和2.37%—20.08%；田间栽培试验显示，该菌能够定殖于根际土壤，促进作物对土壤磷的利用，提高作物产量，当每穴施加5 mL该菌培养液，试验结束时，白菜和豇豆试验组的土壤总磷含量分别下降（23.56±2.65）%和（37.10±1.98）%，分别为对照组的（1.77±0.29）和（2.70±0.15）倍（P＜0.01），而白菜和豇豆的产量却分别比对照组增加（27.59±6.15）%和（70.29±5.15）%（P＜0.01）；液体纯培养条件下接种培养5 d后，无机磷和有机磷培养基pH值由起始的7.0分别降至5.0和6.0，有效磷元素含量比对照组分别增加（73.94±0.94）和（7.12±0.28）mg（P＜0.01）。【结论】放线菌JXJ-0136是链霉菌属的成员，能够显著提高作物种子的萌发率，增加幼苗株高和根长，并定殖于根际土壤中，增加土壤可溶性磷的含量，提高作物对土壤磷的利用效率，促进它们的生长，增加其产量，在微生物肥料研制中具有较大的潜在应用价值。

不同降雨条件下紫色土横垄坡面地表微地形变化特征

罗键，尹忠，郑子成，何淑勤，李廷轩

中国农业科学. 2016, 49(16): 3162-3173. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.16.010

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【目的】地表微地形是影响坡面侵蚀过程的重要因素之一。它影响着地表填洼量、渗透速率、地表径流等过程，同时这些过程也会对微地形变化产生影响。论文探讨了不同降雨条件下地表微地形动态变化特征，为深入理解坡面水蚀机理，以及坡耕地水土流失的有效防治与耕作措施的合理布设提供科学依据。【方法】以川中丘陵区横坡垄作坡面为研究对象，以直线坡面为对照，通过室内人工模拟降雨方法，结合GIS技术，从地表糙度的角度，分析递增和递减降雨条件下，紫色土坡面地表微地形的变化特征。【结果】不同降雨条件下横垄坡面高程值变化范围最高可达-180—80 mm，主要集中在-20—20 mm，地表高程减小区域所占比例相对较大。直线坡面高程变化量在-10—10 mm，主要集中-5—5 mm。不同措施在递增降雨系列下的土壤侵蚀面积均大于递减降雨系列；不同降雨条件下横垄坡面地表糙度值介于57.47—65.32 mm，且不同坡位地表糙度值均呈现出上坡＞下坡＞中坡。直线坡面地表糙度值在5.71—6.28 mm内变动，不同坡位受随机糙度的影响具有明显的空间变异性；横垄坡面不同降雨条件下微坡度栅格数随坡度的增加呈现出先减小后增加再减小的变化趋势，坡度主要集中于0°—5°和30°—35°。对于直线坡面，栅格统计数随坡度的增加呈现出逐渐减小的变化趋势，微坡度主要集中在0°—10°。不同降雨条件下横垄坡面微坡向栅格数主要分布在北坡和南坡，且其余坡向分布较为均匀。直线坡面在不同降雨条件下微坡向分布差异较大。【结论】水蚀过程中，地表高程值变化、地表糙度体现了微地形垂直方向上的变化，地形因子体现了微地形的空间分布，将其结合起来可较好的反映横垄坡面微地形变化特征。递增型降雨雨型与紫色土区夏季主要侵蚀雨型特点相似，更易造成的土壤侵蚀的发生，是研究区坡耕地土壤侵蚀防控的主要雨型。该研究结果可以为地表微地形量化、揭示坡耕地土壤侵蚀效应本质提供新思路。

新疆红肉苹果杂种一代4个株系类黄酮含量及其合成相关基因表达分析

许海峰，王楠，姜生辉，王意程，刘静轩，曲常志，王得云，左卫芳，张晶，冀晓昊，张宗营，毛志泉，陈学森

中国农业科学. 2016, 49(16): 3174-3187. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.16.011

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【目的】研究新疆红肉苹果（Malus sieversii f. neidzwetzkyana（Dieck）Langenf.）与‘富士’（M. domestica cv. Fuji）等苹果品种杂交后代株系间果实类黄酮合成差异的分子机理，为进一步完善功能型苹果育种的理论与技术体系提供科学依据。【方法】以紫红2号及红脆1、2、4号等红肉程度存在明显差异的4个苹果株系发育后期的果实为试材，进行MYB10启动子基因型鉴定，并测定类黄酮组分和含量，分析类黄酮合成相关基因的表达。【结果】红脆1、2、4号MYB10启动子基因型均是R6R1型，而紫红2号启动子类型为R6R6型。红脆1号和紫红2号果实成熟期类黄酮含量分别为3.0 mg·g^-1和3.1 mg·g^-1；紫红2号花青苷含量（23.9 U·g^-1 FW）是红脆1号（12.2 U·g^-1 FW）的2倍，其他类黄酮组分含量（1 635.3 mg·kg^-1）仅是红脆1号的69%。紫红2号MYB10和UFGT等转录因子及花青苷合成基因在果实发育后期（花后110—125 d）均具有较高的表达量；红脆4号的MYB10虽然在果实发育后期（花后110—125 d）表达量较高，但bHLH3、TTG1、ANS和UFGT表达量较低。红脆1、2、4号类黄酮组分含量分别为2 355.0、1 247.5和1 337.5 mg·kg^-1，差异显著；红脆1号MYB12转录因子及FLS、LAR和ANR等类黄酮生物合成相关结构基因表达量较高，而MYB16和MYB111表达量较低；红脆2、4号MYB12转录因子及FLS、LAR和ANR等类黄酮生物合成相关结构基因表达量较低，而MYB16和MYB111转录因子表达量较高。【结论】MYB10、bHLH3和TTG1等转录因子及ANS和UFGT等花青苷生物合成结构基因在果实发育后期高水平表达，可能是导致紫红2号成熟期果肉花青苷含量高的主要原因，而MYB12、MYB16和MYB111等转录因子及DFR、FLS、LAR和ANR类黄酮生物合成相关结构基因的差异表达，可能是导致红脆1、2、4号等3个株系类黄酮组分及含量差异的主要原因。

李属（Prunus）果树品种资源果实糖和酸的组分及其构成差异

刘硕，刘有春，刘宁，张玉萍，章秋平，徐铭，张玉君，刘威生

中国农业科学. 2016, 49(16): 3188-3198. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.16.012

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【目的】分析李属主要种果实糖酸含量及构成特点，为李品种资源品质性状的科学评价、挖掘优异种质和育种利用提供依据。【方法】应用高效液相色谱（HPLC）技术对李属8个主要种、3份新疆野生欧洲李和4份李杏杂交种等共57份代表品种的果实糖酸组分、含量进行检测。【结果】（1）李果实中的可溶性糖包括蔗糖、葡萄糖、果糖和山梨醇；蔗糖含量在供试品种间差异显著，樱桃李（Prunus cerasifera Enrhart）、美洲李（P. americana Marsh）、黑刺李（P. spinosa L.）和野生欧洲李（Wild type of P. domestica L.）不含蔗糖，欧洲李（P. domestica L.）、加拿大李（P. nigra Ait.）和李杏杂交种蔗糖含量居中（12.78—20.25 mg·g^-1 FW），而杏李（P. simonii Carr）、中国李（P. salicina Lindl.）和乌苏里李（P. ussuriensis Kov.et Kost.）蔗糖含量较高（37.55—57.83 mg·g^-1 FW）；欧洲李、野生欧洲李和黑刺李果实糖组成共同特点是葡萄糖为主，山梨醇次之；供试种中，杏李总糖含量最高，其次是中国李、乌苏里李和欧洲李，樱桃李最低。（2）欧洲李果实中以奎宁酸和苹果酸为主，占总酸含量的93.12%，而其他种均以苹果酸为主，占总酸的比例在63.24%—96.05%，其中樱桃李、美洲李、加拿大李、黑刺李和野生欧洲李等果实中除苹果酸外还有较高含量的奎宁酸；供试种中樱桃李总酸含量最高，其次是野生欧洲李和黑刺李，乌苏里李最低。（3）供试李果实糖酸含量的前3个主成分（PCs）累积方差贡献率为71.26%，直观反映了各品种和类型果实糖酸含量的构成特点。【结论】供试李属栽培种类型（欧洲李除外）以蔗糖为主，其次是葡萄糖和果糖，苹果酸是主要有机酸。野生种类型不含蔗糖，以葡萄糖、果糖和山梨醇为主，苹果酸为主要有机酸，奎宁酸次之。主栽类型中欧洲李果实糖酸组成有别于其他种/类型，以葡萄糖和山梨醇为主，奎宁酸和苹果酸是主要的有机酸组分；而中国李糖组分以蔗糖为主，其次是葡萄糖和果糖，苹果酸是主要的有机酸组分，由此形成二者不同的风味。

宰后肌肉中肌球蛋白磷酸化调控肌动球蛋白解离作用机制

高星，李欣，李铮，杜曼婷，张彩霞，张德权，丁武

中国农业科学. 2016, 49(16): 3199-3207. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.16.013

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【目的】研究宰后肌肉中肌球蛋白磷酸化与肌动球蛋白解离之间的关系，分析其磷酸化水平的变化对肌动球蛋白解离的影响，探究肌球蛋白磷酸化对宰后肌肉肌节长度与嫩度的作用。【方法】取宰后30 min内的羊背最长肌，在4℃条件下分别成熟6、24、48和72 h，通过SDS-PAGE电泳、Pro-Q染色和蛋白质免疫印迹测定肌球蛋白的磷酸化水平和肌动球蛋白解离程度随宰后时间的变化；测定肌动球蛋白ATP酶的活性，分析宰后不同时间点肌球蛋白与肌动蛋白结合作用力的强弱；采用透射电镜分析宰后肌节长度随时间的变化。【结果】研究发现宰后肌肉中肌球蛋白轻链2的磷酸化水平在0.5—48 h快速降低（P＜0.05），并在48 h达到最低点，在48—72 h有所升高（P＜0.05），但其最终磷酸化水平明显低于初始值。肌动球蛋白的解离程度在宰后初期（0.5—6 h）显著降低（P＜0.05），在6—48 h显著升高（P＜0.05），并于48—72 h维持稳定，其最终解离程度显著高于宰后0.5 h的初始值。肌动球蛋白ATPase活性在宰后初期（0.5—6 h）略有升高，6—24 h快速上升（P＜0.05），并在24 h达到最高点，24—72 h逐渐降低；而肌节长度的变化则与之相反，呈先下降后上升的趋势，并在24 h达到肌节最短点。【结论】羊宰后肌肉中的肌球蛋白轻链2磷酸化水平的变化对肌球蛋白与肌动蛋白的相互作用有较大的影响，且肌节收缩（肌球蛋白与肌动蛋白的相互作用力）与肌动球蛋白的解离（肌球蛋白与肌动蛋白的相互作用量）并不是一个同步的进程。肌球蛋白轻链2的磷酸化修饰负向调控肌动球蛋白解离和肌动球蛋白ATPase活性，导致肌节的收缩与舒张，进而调控肉品最终的嫩度。

超临界CO₂流体萃取兔肉腥味物质

谢跃杰，贺稚非，李洪军

中国农业科学. 2016, 49(16): 3208-3218. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.16.014

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【目的】探讨超临界CO₂流体（SFE-CO₂）萃取兔肉腥味物质的条件，确定腥味物质的种类、组成和含量，为兔肉脱腥以及加工提供理论基础。【方法】采用超临界CO₂流体对兔肉腥味物质进行萃取，以提取率为指标，在单因素试验基础上进行Box-Behnken响应面分析；定量加入内标物质2,4,6-三甲基吡啶（TMP），通过气相色谱质谱仪（GC-MS）对兔肉腥味物质进行分析鉴定。计算气味活度值（OAV），结合气相色谱-嗅闻（GC-O）和感官评价，确定兔肉腥味物质主体成分。【结果】单因素试验结果表明，当萃取温度为40℃时，提取率最高达到97.91%，峰面积为1.58×10⁹；当萃取时间为4 h时，提取率最高，为97.83%，峰面积为2.42×10⁹；萃取压力为25 MPa时，最高提取率为97.78%，峰面积3.78×10⁸。其中，萃取温度和萃取压力不仅影响溶质扩散系数，还影响CO₂流体密度。温度增加时，尽管扩散系数增大，由于CO₂流体密度下降，提取率随之减小。虽然CO₂流体密度在高压下较大，但随着压力增加，可压缩性随之减小，由于扩散系数降低，溶质溶解度下降，因而提取率降低。当萃取时间过长时，一些非挥发性物质被溶出，使得萃取物质总量增加，降低了挥发性风味物质的比重。根据响应面分析，得出最优萃取条件为：萃取温度40.67℃、萃取压力25.67 MPa、萃取时间3.13 h，提取率为98.01%。而实际操作时，提取条件修正为萃取温度40℃、萃取压力25 MPa、萃取时间3 h，在此条件下提取率为98.11%。通过定量加入内标物质TMP，GC-MS定性定量分析得到兔肉挥发性风味物质5类，包括醛类、酸类、酯类、杂环类化合物和烃类，共计38种风味化合物。其中，酸类（（1 394.25±3.45）μg?kg^-1）＞酯类（（569.26±1.23）μg?kg^-1）＞烃类（（471.82±1.11）μg?kg^-1）＞醛类（（168.46±0.97）μg?kg^-1）＞杂环类（（86.71±0.64）μg?kg^-1）。通过计算得到兔肉挥发性风味物质中戊醛、己醛、己酸和2-戊基-呋喃的OAV值均大于1，且己酸＞己醛＞2-戊基-呋喃＞戊醛，表明这4种物质对兔肉腥味有重要贡献，而己酸对兔肉腥味的贡献最大。同时，气相色谱-嗅闻（GC-O）分析认为这4种物质均具有不同程度异味，包括肝脏腥味、草腥味、羊膻味和豆腥味等，感官分析表明萃取物有明显兔肉腥味。【结论】超临界CO₂流体萃取兔肉腥味物质可行，为研究兔肉腥味提供了新的提取方法。其最佳萃取条件为：时间3 h，温度40℃，压力25 MPa。戊醛、己醛、己酸和2-戊基-呋喃初步确定为兔肉腥味的主体成分。

巴马香猪周身皮肤厚度的测量及其与7号染色体候选SNPs位点的关联分析

黄涛，黄晓畅，邱恒清，严国荣，黄贻忠，张弋峰，江嘉程，周李生，任军，麻骏武，肖石军，黄路生，杨斌，艾华水

中国农业科学. 2016, 49(16): 3219-3228. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.16.015

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【目的】测定中国地方小型猪品种巴马香猪成年时周身9个典型部位的皮肤厚度，揭示巴马香猪不同部位皮肤厚度变化规律；进行9个部位皮肤厚度与候选SNPs位点的关联分析，在巴马香猪群体中验证影响皮肤厚度的7号染色体主效QTL，为进一步在巴马香猪群体中大规模开展皮肤厚度等形态变化的分子遗传控制机理及其相关基因功能研究奠定基础，从而增强人们对猪皮肤的认知。【方法】从一个由319头300日龄巴马香猪组成的成年屠宰群体中，随机选取50头，包括27头母猪和23头阉割公猪，分别取头脸、肩、背、肷、臀、胸、下腹、腋下和管等9个部位的皮肤，利用电子游标卡尺对这些不同部位皮肤厚度进行精确测量，利用R语言基本统计包进行不同部位和不同性别间皮肤厚度的差异分析以及不同部位间皮肤厚度的相关分析。在猪7号染色体34.5—36.2 Mb的区域选取46个SNPs位点，利用MassARRAY时间飞行质谱技术进行基因分型，结合上述测定的皮厚表型，利用广义混合线性模型及 R 语言SNPassoc软件包进行目标候选区域的关联分析。根据关联分析结果和基因的生物学功能确定可能的位置候选基因。【结果】（1）单因素方差分析表明巴马香猪9个部位的皮肤厚度存在极显著差异（P = 2.95×10^-117），肷部和背部的皮肤最厚，分别为（5.15 ± 0.92）和（4.97 ± 0.85）mm，下腹和腋下的皮肤最薄，分别为（1.77 ± 0.36）和（1.97 ± 0.68） mm。皮肤厚度从厚到薄依次是肷部、背部、肩部、头脸、臀部、管部、胸部、腋下和下腹。（2）阉割公猪腋下皮肤厚度显著小于母猪的（P = 0.021），其它部位皮肤厚度在母猪和阉割公猪间差异均不显著。（3）除了下腹皮肤厚度与背部、肩部、头脸部的不相关（P＞0.05）外，巴马香猪不同部位两两之间皮肤厚度均呈现不同程度地显著或极显著正相关。（4）关联分析结果表明，9个不同部位的皮肤厚度表型均与候选区域的某些SNPs存在极显著的关联，从强到弱依次是肷部、肩部、背部、腋下、臀部、胸部、头脸、管部和下腹。从而，证实了巴马香猪群体存在影响猪皮肤厚度的7号染色体主效QTL。（5）3个与皮肤厚度关联性最强的SNPs值得进一步关注，分别位于7号染色体的34856565、35543837和35573869位置。肷部的皮肤厚度与SNP(chr7:34856565)的关联显著性最强（P_cor = 5.15×10^-6），这个SNP也是肩部皮肤厚度最关联（P_cor = 5.75×10^-6）的位点。SNP(chr7:35543837)是腋下（P_cor = 3.05×10^-5）、臀部（P_cor = 0.010）、胸部（P_cor = 0.013）和头脸（P_cor = 0.025）皮肤厚度的最关联位点，也是肩部皮肤厚度的次最关联位点。SNP(chr7:35573869)则是背部皮肤厚度的最关联位点（P_cor = 1.17×10^-5），SNPs（chr7:35543837和chr7:34856565）次之。（6）根据最强关联SNPs所在基因及基因生物学功能，初步推测ANKS1A和HMGA1基因可能是影响皮肤厚度的候选因果基因。【结论】较全面地测量了中国小型地方猪品种巴马香猪周身皮肤厚度，揭示了巴马香猪皮肤厚度在不同部位之间的变化规律。在巴马香猪群体中验证了影响皮肤厚度的7号染色体主效QTL位点，肷部、背部和肩部皮肤厚度表型性状与候选SNPs位点关联性更强，可能适合下一步大规模深入分析。ANKS1A和HMGA1基因可能是影响皮肤厚度的候选因果基因，但需要进一步生物学功能试验证明。

可持续挖掘草原生产潜力的途径、技术及政策建议

侯向阳

中国农业科学. 2016, 49(16): 3229-3238. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.16.016

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草原是中国第一大陆地生态系统，面积近4亿hm²，占国土面积的41.7%，是中国发展现代农业和现代畜牧业的重要资源，是保障国家生态安全的重要屏障带。然而，由于长期不合理开发利用，中国草原面临严峻的生态退化、植被生产力衰减、草畜矛盾突出、畜产品生产效率低下等问题，生态和生产功能均严重下降，成为国家实施可持续发展战略的制约性区域之一。系统地、可持续地挖掘草原生产潜力，有效提升草原生态和生产功能，是加强生态安全和生态文明建设，加速现代畜牧业转型发展的重要保障。挖掘草原生产潜力主要有三方面途径，一是进行退化草原恢复，提高草原生产力；二是进行旱作栽培草地建设；三是发展高效草业。针对不同类型退化草原，采取自然恢复、优化利用、人为改良等改良与恢复措施，可加速退化草原恢复进程，并提高退化草原生产力20％—30%甚至40％—50%。在半干旱区由于水土资源的限制，应重点发展以粮改饲为主的旱作栽培草地，以挖掘本土牧草优异资源为主，选育和扩繁抗旱、抗寒、耐牧型牧草品种，研发和应用旱作草地栽培技术、收获加工技术、土壤保育及耐旱材料等，提高水土资源利用率和旱作栽培生产效率，可提高生产力2—3倍。在区域水资源条件较好且综合平衡的基础上，适度发展高效节水灌溉人工草地，如按提高生产力10—20倍计，每年可增加饲草1.5×10⁷—3×10⁷ t，可解决2×10⁶—4×10⁶ hm²草地的优质饲草的生产问题。为保障可持续挖掘草原生产潜力，提出相关政策建议。一是发挥草原生态补奖机制的长效驱动作用，紧紧把握推进方式转变，在草畜平衡的范畴中鼓励草地优化利用，以不断挖掘政策效益和可持续挖掘草地的第一性生产潜力和第二性生产力；二是建议和实施可持续挖掘草原生产潜力研发计划行动。重点开展天然草原饲草生产力提质增效关键技术研究与集成示范，半农半牧区高效草牧业技术模式和示范，突破生产饲草生产土地资源的高效开发利用技术、水土生物等资源的综合高效利用技术，提高资源利用效率；制约草畜结合的饲草质量差、调制利用差、转化效率差的技术难题，综合提高饲草转化利用效率。三是建立不同类型区现代草业大示范区。针对不同草地类型的特点和面积进行战略布局，建立区域性的大示范区，形成较为完善的产业链条，实现区域内各种资源的整合和优化配置。四是培育新型生产经营主体，建立完善市场体系，鼓励建立多元主体综合体形式运作市场，助推草业经济的发展。

连续周年耕作对砂姜黑土农田蓄水保墒及作物产量的影响

靳海洋，谢迎新，李梦达，刘宇娟，贺德先，冯伟，王晨阳，郭天财

中国农业科学. 2016, 49(16): 3239-3250. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.16.017

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【目的】筛选利于改善黄淮区砂姜黑土农田蓄水保墒效果及提高作物产量的夏玉米-冬小麦周年耕作方式。【方法】在秸秆全量还田条件下设置5个夏玉米季-冬小麦季周年耕作方式处理：免耕-旋耕（对照）、免耕-深耕、深松-旋耕、深松-免耕、免耕-免耕，通过多年定位试验研究周年耕作方式对砂姜黑土农田土壤容重、土壤水分及作物籽粒产量的影响。【结果】与对照处理相比，免耕-深耕处理显著降低夏玉米收获期15—25 cm土层土壤容重和冬小麦收获期20—35 cm土层土壤容重，深松-免耕和深松-旋耕处理显著降低夏玉米收获期15—40 cm土层土壤容重和冬小麦收获期20—25 cm土层土壤容重，而免耕-免耕处理显著增大夏玉米收获期0—10 cm土层土壤容重和冬小麦收获期5—20 cm土层土壤容重。免耕-深耕、深松-旋耕和深松-免耕处理显著增加夏玉米收获期0—40 cm土壤贮水量，而深松-旋耕和免耕-免耕处理却降低冬小麦收获期0—40 cm土壤贮水量。与对照免耕-旋耕处理相比，深松-免耕处理提高夏玉米-冬小麦整个周年内20—40 cm土层土壤含水量，免耕-免耕处理提高作物收获期40—160 cm土壤含水量，而深松-旋耕处理在冬小麦收获期则降低40—160 cm各土层土壤含水量。深松-旋耕和深松-免耕处理显著增加夏玉米-冬小麦周年籽粒产量，增幅分别为7.67%和10.21%，免耕-深耕处理冬小麦籽粒产量增加而夏玉米产量降低，最终周年籽粒产量降低0.44%，免耕-免耕处理夏玉米-冬小麦周年籽粒产量降低2.19%。【结论】深松-旋耕和深松-免耕处理能够降低土壤容重、提高作物籽粒产量，其中深松-免耕处理能够改善土壤蓄水保墒能力，产量及经济效益增加效果较优，可作为相对较适宜的黄淮区砂姜黑土农田夏玉米-冬小麦周年耕作方式。

牛支原体等温扩增冻干试剂盒研究

吴彤，刘旭，李佳禾，闫新博，张宁，吴文学

中国农业科学. 2016, 49(16): 3251-3260. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.16.018

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【目的】牛支原体(Mycoplasma bovis)是导致牛多种疾病综合征的病原体之一，在世界范围广泛流行。为了有效监测此病在中国的流行情况，迫切需要敏感、便捷的诊断试剂产品。【方法】通过构建含有牛支原体uvrC基因片段的重组质粒并转化TOP10感受态细胞，获得重组大肠杆菌rP-uvrC。重组大肠杆菌大量表达并提取重组质粒后，获得质粒浓度为10⁴拷贝/μL的溶液，作为质控用阳性对照品。根据文献报道的浓度配制甜菜碱溶液和显色液(主成份为SYBR Green I和HNB)，分别作为冻干品溶解用溶液和等温扩增产物显色溶液。在已建立的牛支原体环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)检测技术的基础上配制等温扩增试剂，并通过考察等温扩增反应情况在常用的8种冻干疫苗耐热保护剂中选择对等温扩增反应没有影响的3种冻干保护剂，每种保护剂分别选用3种不同的浓度，共设计27种保护剂组方，通过观察冻干品物理性状选择最佳的一组保护剂配制冻干用等温扩增试剂，放到冻干机中测定共晶点，并优化一次干燥升温时间、干燥时间和二次干燥时间。通过对冻干制品物理性状的检验、真空度的检测以及残余水分含量的测定，筛选出一条适合等温扩增试剂的冻干曲线，并以此制备等温扩增试剂冻干品。取一定量等温扩增试剂冻干品、甜菜碱溶液、阳性对照品溶液和显色液，组装成试剂盒。利用6个浓度梯度(10⁰—10⁵个拷贝)重组质粒溶液检测试剂盒的敏感性，利用浓度为10⁴ CCU·mL^-1的PG-45株、HB-1株、SD-2株牛支原体菌液、10⁸ CCU·mL^-1的牛鼻支原体和无乳支原体菌液、10⁸CFU·mL^-1的多杀性巴氏杆菌和结核分枝杆菌，检测试剂盒的特异性。另外，将等温扩增冻干试剂盒分别置于不同温度下保存，检测其稳定性。【结果】8种冻干保护剂中只有海藻糖、甘露醇和牛血清白蛋白不影响等温扩增反应，在此基础上优选的冻干保护剂配方为5%海藻糖+1.25%甘露醇+1.25%牛血清白蛋白，等温扩增试剂共晶点为-16℃，一次干燥的升温时间3 h，一次干燥时间6 h，二次干燥时间4 h。组装后的试剂盒最低可检测到10个拷贝数的重组质粒，检验PG45株、HB-1株以及SD-2株牛支原体均为阳性，检验牛鼻支原体、无乳支原体、多杀性巴氏杆菌和结核分枝杆菌均为阴性。试剂盒在20℃保存6个月、37℃保存10 d后，敏感性仍为10个拷贝数，与第0 天相同，推测4℃保存有效期为24个月左右。【结论】笔者研制的等温扩增冻干试剂盒敏感性高、特异性好、稳定性好、操作便捷，适合基层兽医现场检测使用。

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