中国农业科学

小麦耐热性的生理遗传研究进展

辛明明，彭惠茹，倪中福，姚颖垠，孙其信

中国农业科学. 2017, 50(5): 783-791. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.05.001

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小麦是中国第二大口粮作物，其产量直接关系人民的生活水平，所以高产和稳产一直是中国小麦的首要育种目标。小麦起源于温带，属喜凉作物，生长季节内的高温对生长发育会产生不利影响，使其产量下降，品质变劣。由于耐热性是复杂的数量遗传性状，其机制的解析一直是生物学研究难点，也是研究热点。为了解析小麦耐热的生理遗传学及分子生物学基础，国内外研究人员通过正向遗传学方法，构建遗传分离群体，以冠层温度、灌浆持续时间、细胞膜稳定性和叶绿素含量等生理学参数，以及穗粒数和千粒重热感指数为指标，在小麦不同染色体上定位了多个耐热相关的QTL位点。同时利用反向遗传学方法，特别是通过转录组、蛋白组和表观遗传组等组学方法鉴定了大量的高温胁迫响应的基因、miRNA及长片段非编码RNA，并通过转基因等手段证明了部分候选基因在小麦抵御高温胁迫中的重要作用。另外，虽然植物中高温受体至今尚未发现，但是钙离子信号通道以及ABA和SA等激素在高温信号传导中的作用也逐渐引起人们的关注。文中主要综述了现阶段高温对小麦产量品质及生理性状的影响、小麦耐热相关QTL的定位，以及小麦响应高温胁迫的转录组、蛋白组和表观遗传组的研究进展；提出应针对小麦种质资源进行系统的耐热性评价，筛选优异等位基因、解析其分子遗传机理解，通过创新再利用，为选育出适合中国气候条件种植的耐热小麦品种提供新材料，实现品种耐热性与高产的统一。

大豆耐荫性评价体系的建立与中国南方大豆资源耐荫性变异

孙祖东，张志鹏，蔡昭艳，曾维英，赖振光，陈怀珠，杨守臻，唐向民，苏燕竹，盖钧镒

中国农业科学. 2017, 50(5): 792-801. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.05.002

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【目的】耐荫性是影响间套作大豆产量的重要因素，影响大豆间套作模式的应用与推广。建立高效、通用、稳定的耐荫性鉴定体系，以利于发掘耐荫种质，开展耐荫性育种。【方法】以60份不同耐荫性类型的大豆品种为材料，首先对15%、30%和60% 3个遮光度下倒伏品种比例等进行比较，确定遮光处理条件；其次对遮光后的株高、平均节间长、叶柄长和茎叶鲜重等17个性状进行筛选，选定耐荫鉴定指标；再比较播种后第40、50和60天3个时期耐荫指标的误差变异系数和表型变异系数等，明确鉴定时期，最后建立由遮光度、耐荫鉴定指标和鉴定时期构成的耐荫性评价体系；利用该体系对中国南方十二省区453份材料进行耐荫性鉴定和资源筛选。【结果】30%遮光度相对其他遮光梯度较优，表现为倒伏品种有而不太多（22%）、表型变异系数较高（25%）、品种间区分度较好。株高和平均节间长构成的耐荫指标相对其他指标具有以下优点：①较准确，误差变异系数低（9.36%），遗传率高（95.43%）；②较稳定，环境间相关系数高（0.92）；③品种间区分度较好，表型变异系数（31.25%）和遗传变异系数（30.52%）较大；④与田间目测耐荫级别相关性较高（0.73），较能反映田间实际情况。播种后50 d时相对其他时期耐荫指标各参数均最优，如环境间相关系数最大（0.87），误差变异系数最小（7.75%）。据此将30%遮光度条件下，播种后50 d株高和平均节间长相对值的平均数定为耐荫指数，指数越小则越耐荫。中国南方453份大豆耐荫指数的变幅为1.11—2.61，平均1.55，材料个体间差异极显著，且遗传率较高（91.13%），说明表型选择具有较高的准确性。Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ生态区内耐荫指数变幅分别为1.19—2.08、1.17—2.61、1.27—2.37和1.11—2.54，均存在大量的耐荫性变异，各生态区均有耐荫性材料。地方品种和育成品种耐荫指数变幅分别为1.11—2.61和1.17—2.54，都存在较丰富的耐荫性变异，在筛选出的11份耐荫资源中，有8份是育成品种，说明大豆育种过程中耐荫性已得到改良。【结论】由30%遮光度，播种后50 d的株高和平均节间长构成的耐荫指数是相对准确、稳定、灵敏、实用的耐荫性评价体系。中国南方大豆耐荫性存在较为丰富的变异，从453份南方材料中筛选到11份耐荫性强的种质资源。

甘蓝型油菜polCMS育性恢复位点的全基因组关联分析

魏大勇，谭传东，崔艺馨，吴道明，李加纳，梅家琴，钱伟

中国农业科学. 2017, 50(5): 802-810. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.05.003

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【目的】甘蓝型油菜波里马细胞质雄性不育（pol CMS）在中国已被广泛应用于杂交种育种，其育性恢复程度表现出受1对主效基因的控制，并受微效修饰基因的影响。通过全基因组关联分析方法挖掘育性恢复位点，并对候选基因进行比较分析。【方法】通过芸薹属60K SNP芯片对308份甘蓝型油菜自然群体进行基因型分型，并用pol CMS系301A作母本，与上述材料分别进行杂交得到308份F₁，每份F₁分别于2013年和2014年进行种植，每年2次重复，于始花期根据花粉育性和花蕊发育情况调查F₁植株的育性等级，同时对测交父本自然群体进行群体结构分析和亲缘关系评估，并结合测交父本的基因型分型结果和F₁的育性等级进行全基因组关联分析（GWAS）。从GWAS分析中显著的SNP左右100 kb区间或与显著SNP处于同一单体型块（R²＞0.5）的区间内预测候选基因，并对候选基因进行QTL比较分析和单体型或等位基因的效应分析。【结果】方差分析结果显示，两年F₁的育性等级存在显著差异（P＜0.01），但相关分析发现，两年的育性等级存在显著的正相关（r = 0.52，P＜0.001）。群体结构分析显示，所有测交父本被分为3个亚群（冬性、春性和半冬性），亲缘关系分析发现，任何2个材料之间平均亲缘关系值为0.072，73%的任意材料间亲缘关系值小于0.1，其中，约53%的材料亲缘关系值为0。GWAS分析共检测到13个与育性恢复程度显著关联的SNP，构成了6个候选区间，分别位于A01、A09、C03、C06和C08 5条染色体上，单个SNP解释的表型变异介于2.53%—9.96%。从中共预测到6个与育性恢复位点相关的候选基因，其中4个编码的蛋白含有恢复基因特有的PPR保守基序。共线性分析发现，4个候选基因中的2个（BnaA09g46700D和BnaC08g40710D）位于A09和C08染色体部分同源区间，且与已克隆的pol CMS育性恢复位点ORF2同源。另外2个新鉴定到的候选基因（BnaC03g45840D和BnaC06g13000D）连锁的SNP等位基因或单体型变化都与育性等级显著相关（P＜0.001）。【结论】通过GWAS分析鉴定到多个与油菜育性恢复有关的候选基因，开发基于与这些基因连锁位点或SNP的功能标记将有助于对该不育系统进行恢复系和保持系的筛选。

24-表油菜素内酯对盐碱胁迫下大豆生育、生理及细胞超微结构的影响

吴杨，高慧纯，张必弦，张海玲，王全伟，刘鑫磊，栾晓燕，马岩松

中国农业科学. 2017, 50(5): 811-821. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.05.004

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【目的】探讨外源EBR（24-表油菜素内酯）对盐碱复合胁迫下大豆的生长指标、生理特性及超微结构的影响，为改善大豆生长、保障粮食安全、实现农业可持续发展奠定基础。【方法】以大豆品种黑农44号为试材，分别在110 mmol·L^-1的盐碱复合胁迫条件下培养3 d和7 d进行取材，研究1.2 mg·L^-1外源EBR对大豆株高、根系生长，叶片3种抗氧化酶超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、过氧化物酶（peroxidase，POD）及抗坏血酸过氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）活性，相对电导率、超氧阴离子（O₂^-）产生速率、过氧化氢（H₂O₂）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量、游离脯氨酸和叶绿素含量以及叶片和根尖细胞超微结构的影响。【结果】盐碱胁迫处理3 d和7 d时，与对照组相比，3种抗氧化酶（SOD、POD、APX）的活性、游离脯氨酸含量、相对电导率、O₂^-产生速率、H₂O₂和MDA含量均升高；各项生长指标、叶绿素含量均降低；叶片细胞结构中叶绿体和线粒体遭到严重破坏；根尖细胞中线粒体、内质网结构破坏较重，液泡破裂。盐碱胁迫条件下，施加外源EBR使大豆的株高、根长和根鲜重分别提高了6.45%、9.60%和19.85%；使大豆叶片SOD、POD、APX的活性显著升高，在3 d和7 d时分别增加了16.92%和9.68%、48.85%和61.44%、19.05%和20.36%；相对电导率、O₂^-产生速率、H₂O₂和MDA的含量显著降低，分别降低了19.58%和28.26%、28.06%和40.92%、28.62%和31.21%、31.03%和37.17%；脯氨酸和叶绿素含量显著升高，分别升高了3.67%和15.96%、13.34%和16.87%；同时维护了大豆叶片和根尖细胞超微结构的稳定性，延缓了细胞的衰老、解体。【结论】在盐碱胁迫下，施加外源EBR通过提高抗氧化酶活性和脯氨酸及叶绿素含量，降低了活性氧（ROS）的积累，维护了细胞结构的完整，促进了幼苗生长，增强了大豆幼苗耐盐碱胁迫的能力。

矮秆高粱辽杂35光合特性与产量构成因素

黄瑞冬，高悦，周宇飞，吴奇，张姣，尚培培，张壮，高铭悦，韩熠，许文娟

中国农业科学. 2017, 50(5): 822-829. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.05.005

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【目的】通过对矮秆高粱新品种群体光合特性和产量形成规律的研究，为新型高粱品种的选育与推广提供理论依据。【方法】以适于机械化生产的矮秆高粱新品种辽杂35为主要试验材料，分别设置3个种植密度（90 000株/hm²、120 000株/hm²和150 000株/hm²），并以生育期相近的同区域主栽品种中高秆高粱辽杂19作为对照（设置为生产上适宜种植密度，105 000株/hm²），通过分析测定高粱群体植株形态指标、光合生理指标、环境生态指标和产量构成因素探究矮秆高粱群体的光合特性和产量形成规律。【结果】随种植密度的增加，在群体表现最为繁茂的灌浆期，辽杂35冠层中下部的光照强度、透光率、气孔导度和光合速率显著降低，并明显低于对照品种辽杂19，冠层上部上述各指标间的差异不显著。辽杂35在开花期和灌浆期上数第二片叶的电子传递速率（ETR）、光化学猝灭系数（qP）、最大光化学效率（Fv/Fm）均随密度增加呈降低趋势，而初始荧光（Fo）呈升高趋势，辽杂19各荧光参数指标均优于中高密度条件下的辽杂35。叶面积指数随着密度的增加呈增加趋势，在开花期达到最大值后逐渐下降，辽杂35密度为150 000株/ hm²处理的叶面积指数下降速度最快，但在后期仍能保持较高的叶面积指数；冠层下部叶片SPAD值呈显著下降的趋势。辽杂35高粱在中高密度条件下，其群体中下部形态指标、光合生理指标和环境生态指标劣于辽杂19，可能与其株型有关，其植株矮，但叶片数基本没有减少，叶着生角度未有实质变化。随种植密度增加，辽杂35高粱生物产量、籽粒产量呈增加趋势，单穗粒数呈显著下降趋势，千粒重无显著变化。辽杂35高粱种植密度为150 000株/hm²时，籽粒产量最高，为9 923.5 kg·hm^-2，其产量也高于对照辽杂19。【结论】适当提高种植密度是促进矮秆高粱籽粒产量提升的关键，但增加种植密度对冠层中下部叶片光合特性和物质生产可产生负面影响，通过高粱株型改良和肥水密等栽培技术的调节，协调矮秆高粱群体和个体之间的关系，实现群体结构和个体功能的协同增益将是提高矮秆高粱产量的重要途径。

一年一季农作物遥感分类的时效性分析

刘焕军，于胜男，张新乐，郭栋，殷继先

中国农业科学. 2017, 50(5): 830-839. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.05.006

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【目的】基于遥感影像的作物分类研究是提取作物种植面积和长势分析及产量估测的基础，也是推动现代化农业快速发展的动力。研究结果可为农业等相关部门掌握农情，进行宏观调控提供依据。目前，农业遥感研究主要集中于中低分辨率遥感影像，影响植被信息提取的精度，应用高分辨率多时相遥感影像和选择最优分类方法可以提高植被信息提取精度。明确农作物遥感分类的时效性与最优分类方法，为快速、准确地获取作物空间分布数据和农情定量遥感监测提供依据。【方法】基于黑龙江省虎林市2014年5—10月覆盖完整生长期的20幅遥感影像，构建16 m分辨率NDVI时间序列曲线，建立决策树分类模型，通过分类影像进行系列阈值分割，并结合辅助背景数据及专家知识，成功提取虎林市土地利用覆被信息；利用20幅影像依次波段合成的方式进行作物分类，明确最优时相；将提取的耕地范围作为作物分类规则，并与未提取耕地范围的作物分类结果进行比较；同时通过最大似然法、马氏距离法、神经网络法、最小距离法、支持向量机、波谱角分类法、主成分分析法多种分类方法进行作物分类；利用农业保险投保地块数据进行精度验证。【结果】（1）7月初、7月末到8月初、9月末是研究区一年一季作物遥感分类的3个关键时相；（2）决策树分类方法在提取土地利用覆被信息的结果中精度最高，总体精度90.24%，Kappa系数0.87；（3）6月初与7月初2幅影像结合采用最大似然法对作物进行分类的总体精度高达94.01%，Kappa系数为0.79，6月初与7月初的影像结合，可以解决作物分类的时效性；（4）结合9月21日的影像，总体精度进一步提高，大豆分类精度明显提高，最终确定最大似然法为最优作物分类方法。【结论】通过遥感数据能实现在7 月上旬对作物进行精准分类，拓展了遥感数据在农业领域的应用价值，对一年一季地区作物快速分类与农情定量遥感监测有重要意义。

核糖体失活蛋白（α-MC）亚细胞定位及对TMV的抑制作用

魏周玲，彭浩然，潘琪，张永至，蒲运丹，吴根土，青玲，孙现超

中国农业科学. 2017, 50(5): 840-848. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.05.007

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【目的】克隆获得苦瓜α-MC、商陆PAP，在烟草中异源表达观察两个蛋白在细胞中的定位情况。研究α-MC对烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）的抑制作用及其引起的抗性防御反应。【方法】根据已报道的商陆抗病毒蛋白PAP基因全序列和苦瓜素基因全序列，设计并合成扩增PAP和α-MC基因全长引物，通过RT-PCR及基因克隆方法，从苦瓜和商陆春叶克隆得到苦瓜α-MC、商陆PAP；用WolfPSORT预测蛋白定位，将苦瓜α-MC、商陆PAP分别融合在GFP和DsRed2的N端，构建融合蛋白表达载体，采用GFP和DsRed2标记进行亚细胞定位，验证预测结果；通过农杆菌介导在本氏烟中瞬时表达α-MC，再接种烟草花叶病毒，利用酶联免疫吸附试验（ELISA）和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分别检测病毒在接种叶片的蛋白积累量和RNA表达量，分析瞬时表达α-MC的抗病毒效果。利用qRT-PCR分析植物防卫相关基因NPR1、PR1、PR2的表达，探究其抗病毒机理。【结果】克隆得到基因α-MC和PAP全长，分别为861和939 bp。Wolf PSORT预测显示α-MC和PAP主要定位于细胞质膜上。共聚焦荧光显微镜下观察发现，分别用GFP和DsRed2标记的α-MC和PAP均定位在本氏烟叶片表皮细胞质膜上，与Wolf PSORT预测的α-MC和PAP定位结果相一致。异源表达的PAP对植物细胞毒性作用强，导致表达部位细胞坏死，异源表达α-MC的植物细胞无明显毒性，表达部位细胞完整。在本氏烟中异源表达α-MC后，再接种TMV-GFP，在紫外灯下观察发现α-MC处理后的本氏烟在接种TMV-GFP 48 h后没有出现绿色荧光，而对照组出现荧光。72 h后处理组出现零星荧光，但对照组的绿色荧光开始扩散，连续观察，处理组几乎没有变化，接种TMV-GFP 6 d后，发现处理组的绿色荧光几乎没有扩大的趋势，而对照组的绿色荧光已扩散至心叶；ELISA检测表明，在接种TMV-GFP 6 d后的叶片中，对照组与健康植物的OD₄₉₂比值几乎已达到处理组的10倍以上；qRT-PCR检测TMV RNA的含量，结果显示对照组TMV RNA表达量是处理组的149倍左右，表明α-MC对TMV复制和移动均有明显抑制；qRT-PCR结果分析显示，NPR1在只注射TMV、单独表达α-MC以及表达α-MC后注射TMV的本氏烟中均被诱导表达，但后者的表达量是前两个处理的约2.5倍左右，在只接种α-MC和表达α-MC后注射TMV的本氏烟中均检测到PR1、PR2，但后者的表达量显著高出前者5—7倍，表明异源表达α-MC可诱导植物中防卫相关基因NPR1、PR1、PR2的表达，从而引起更强的防御反应。【结论】异源表达α-MC显著抑制TMV，能够激活植物防卫反应，且对植物细胞无明显毒性。研究结果为利用异源表达α-MC方法开发控制植物病毒新产品提供了参考依据。

美国白蛾几丁质脱乙酰酶的克隆、表达及酶学性质

闫晓平，赵丹，郭巍，王伟，张雅昆，郜玉杰，赵坤莉

中国农业科学. 2017, 50(5): 849-858. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.05.008

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【目的】研究美国白蛾（Hyphantria cunea）几丁质脱乙酰酶（chitin deacetylase，CDA）基因的酶学性质，了解其在昆虫生命过程中如何发挥功能，为美国白蛾的生物防治提供新靶标。【方法】对家蚕（Bombyx mori）、棉铃虫（Helicoverpa armigera）和云杉卷夜蛾（Choristoneura fumiferana）3种鳞翅目昆虫的几丁质脱乙酰酶2序列保守域进行分析，采用同源比对方法，设计几丁质脱乙酰酶2基因特异引物，利用PCR扩增该基因全长cDNA序列；构建原核重组表达载体pET30a-HcCDA2，克隆获得编码美国白蛾HcCDA2的基因，IPTG诱导蛋白表达，SDS-PAGE电泳检测；构建重组杆状病毒表达载体pFastBac-HcCDA1 和pFastBac-HcCDA2，脂质体转染法转染昆虫细胞Hi5，分别获得P1、P2、P3病毒，收集P3病毒上清，得到美国白蛾HcCDA1（前期研究所得）和HcCDA2重组蛋白，Western blot分析；重组蛋白HcCDA1和HcCDA2经硫酸铵粗纯化后，以对硝基乙酰苯胺为底物，测定重组几丁质脱乙酰酶HcCDA1&2的酶活力，对其最适反应温度、最适pH以及金属离子的影响等酶学性质进行研究。【结果】获得了编码美国白蛾几丁质脱乙酰酶2基因全长cDNA序列，命名为HcCDA2 (GenBank登录号：KT781841)，基因全长1.6 kb，该基因在大肠杆菌中成功表达61 kD目的蛋白，免疫家兔获得HcCDA2蛋白的特异性多克隆抗体。Western blot分析结果表明，HcCDA1和HcCDA2在昆虫细胞（Hi5）中均成功表达约80 kD蛋白。酶学性质研究表明，昆虫细胞中分泌表达的HcCDA1和HcCDA2均具有催化活性，两种酶的最适反应温度均为50℃，当温度达到80℃时，HcCDA2几乎失去酶活力；HcCDA1酶促反应适宜的pH范围为7.0—9.0，并且HcCDA1和HcCDA2酶促反应的最适pH均为8.0；在最适反应条件下，HcCDA2蛋白酶活力均高于HcCDA1蛋白酶活力；Mg²⁺、Zn²⁺、Mn²⁺和Ca²⁺对HcCDA1和HcCDA2酶促反应整体呈抑制趋势，随浓度增大，Zn²⁺对HcCDA1抑制作用逐渐增强，而Mg²⁺对HcCDA1的抑制作用则呈现先升高后降低的趋势，而且Mg²⁺和Ca²⁺对HcCDA2的抑制作用也是呈现先升高后降低的趋势。Co²⁺和Fe²⁺对HcCDA1和HcCDA2酶促反应有激活作用，随浓度增大，Fe²⁺激活作用越强，而Co²⁺激活作用则呈现先升高后降低的趋势。【结论】克隆了编码美国白蛾几丁质脱乙酰酶2基因（HcCDA2），在原核细胞中表达61 kD目的蛋白，免疫家兔获得HcCDA2蛋白的特异性抗体。得到具有活性的美国白蛾几丁质脱乙酰酶HcCDA1和HcCDA2，两者在体外均检测到催化活性，两种酶的最适反应温度均为50℃，最适pH均为8.0。

保护性耕作对西北旱区土壤微生物空间分布及土壤理化性质的影响

李彤，王梓廷，刘露，廖允成，刘杨，韩娟

中国农业科学. 2017, 50(5): 859-870. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.05.009

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【目的】保护性耕作在中国西北旱区已得到了广泛应用，是农业生产中重要的技术措施。探析保护性耕作对土壤肥力和土壤微生物群落结构的影响，有助于农业生产的可持续发展。本试验从土壤理化性质和微生物相结合的角度，探讨保护性耕作对土壤微生物空间结构的影响，以及旱作麦田微生物群落丰度和土壤理化性质的相关性，为推广保护性耕作措施提供理论依据和实践支持。【方法】以中国西北旱区土壤为研究对象，常规耕作翻耕（PT）为对照，设计深松耕（CPT）和免耕（ZT）两种保护性耕作方式，采用实时荧光定量PCR技术，测定土壤微生物群落丰度和土壤理化性质指标，并分析微生物群落空间分布与土壤理化性质和保护性耕作之间的关系。【结果】长期应用保护性耕作已对旱作麦田的环境产生显著影响，不同的耕作方式对土壤真菌和细菌群落丰度有不同的影响，两者对3种耕作方式均有不同程度的响应；在不同的耕作方式下，土壤微生物空间分布不均，连续性较差，空间变异程度较高，表现出强烈的空间聚集分布。耕作方式对土壤理化性质和酶活性也有显著的影响，与传统翻耕相比，深松耕和免耕方式能显著提高土壤黏粒、水分、全氮、铵态氮含量和脲酶、蔗糖酶活性。典范主分量分析（CPCA）结果表明，土壤微生物群落丰度和理化性质变化主要受到耕作方式的影响，并且土壤微生物群落丰度与理化性质密切相关，在免耕方式下，土壤黏粒、水分和铵态氮含量等显著影响土壤细菌群落分布；在深松耕方式下，土壤可溶性碳含量和过氧化氢酶活性等显著影响土壤真菌群落分布。【结论】旱作麦田采用保护性耕作，可以影响土壤微生物群落丰度和空间分布，并且显著影响土壤理化性质，进而影响土壤微生物空间结构。同时，土壤水分和碳氮含量分别显著影响土壤细菌和真菌丰度。

基于高光谱遥感的冬小麦叶水势估算模型

陈智芳，宋妮，王景雷，孙景生

中国农业科学. 2017, 50(5): 871-880. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.05.010

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【目的】采用高光谱技术，建立快速、无损与准确获取冬小麦叶水势的估算模型，为小麦灌溉的精确管理提供科学依据。【方法】利用不同水分处理的大田试验，于小麦主要生育期同步测定冠层光谱反射率、叶水势、土壤水分等信息，并探讨高光谱植被指数与冬小麦叶水势之间的定量关系。通过相关性分析、回归分析等方法，基于不同水分处理，构建4种植被指数与冬小麦叶水势的估算模型。【结果】不同水分处理和不同生育期的冬小麦，其冠层光谱反射率具有显著的变化特征。在可见光波段，冬小麦冠层反射率随着水分含量的增加而逐渐降低，而在近红外波段，其冠层反射率则随着土壤水分含量的增加而升高。随着小麦生育期的推进，在近红外波段，抽穗期的冠层反射率比拔节期的高，在灌浆期之后，红波段（670 nm）、蓝波段（450 nm）的反射率上升加快；4种植被指数与叶水势显著相关（P＜0.05），相关系数|r|均在0.711以上，四者均可用于冬小麦叶片水势的定量监测。在充分供水条件下（70% FC），植被指数OSAVI和EVI2与叶水势的相关系数|r|（分别为0.75和0.771）均低于植被指数NDVI和RVI与叶水势的相关系数|r|（分别为0.808和0.896），而在重度水分亏缺条件下（50% FC），植被指数OSAVI和EVI2与叶水势的相关系数|r|（分别为0.857和0.853）均高于植被指数NDVI和RVI与叶水势的相关系数|r|（分别为0.711和0.792）；所建模型对45个未知样的预测结果与实测值相似度较高，其回归模型R²、验证模型MRE、RMSE的范围分别为0.616—0.922、-17.50%—-12.52%、0.102—0.133。在70% FC水分处理下，基于EVI2（enhanced vegetation index）所得叶水势估算模型的R²最高，为0.922,而在60% FC和50% FC水分处理下，由于考虑了土壤背景的影响，基于OSAVI所建模型的R²最高，分别为0.922和0.856。【结论】4种植被指数均可用于冬小麦叶水势的定量监测。但是，在构建不同水分处理的叶水势估算模型时，应考虑土壤背景对冠层光谱的影响。研究结果可以为小麦精准灌溉管理提供技术依据，为星载数据的参数反演提供模型支持。

富氢水浸种增强黄瓜幼苗耐冷性的作用及其生理机制

刘丰娇，蔡冰冰，孙胜楠，毕焕改，艾希珍

中国农业科学. 2017, 50(5): 881-889. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.05.011

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【目的】氢气（H₂）是近年来发现的一种新型气体信号分子，它参与植物对高温、干旱、盐害、重金属等多种逆境胁迫的响应。探讨外源氢气（H₂）对黄瓜幼苗耐冷性的调控作用及其生理机制，为增强日光温室黄瓜对低温的适应能力提供技术指导。【方法】以‘津优35号’黄瓜品种为试材，用饱和富氢水（HRW，H₂供体）浸种，蒸馏水浸种作对照（CK），常温下育苗。幼苗长至2叶1心时转移至光照培养箱中进行低温（昼/夜温度8℃/5℃）处理，分别于处理后0、1、3和5 d后测定相关生理指标。【结果】低温胁迫可使黄瓜幼苗叶片的电解质渗漏率（EL）、冷害指数、过氧化氢（H₂O₂）和丙二醛（MDA）含量及超氧阴离子（O₂^-）产生速率持续升高，超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）、抗坏血酸过氧化物酶（APX）和谷胱甘肽还原酶（GR）活性及还原型谷胱甘肽（GSH）、抗坏血酸（AsA）、脯氨酸和可溶性糖含量先升高后降低，相对含水量呈下降趋势。与CK相比，低温胁迫下HRW处理的EL和冷害指数的增加幅度较小，H₂O₂和MDA含量及O₂^-产生速率较低，而SOD、POD、CAT、APX和GR活性及GSH和AsA含量较高。胁迫结束时（5 d），HRW处理的EL比CK低11.3个百分点，冷害指数较CK低15.9%，H₂O₂和MDA含量分别比CK低29.4%和9.9%，O₂^-产生速率较CK低54.3%；而SOD、POD、CAT、APX和GR活性分别比CK高12.6%、20.1%、20.9%、53.0%和58.1%，GSH和AsA含量分别较CK高24.0%和17.6%。低温下HRW处理的黄瓜幼苗叶片的相对含水量降低幅度明显小于CK，而脯氨酸和可溶性糖含量始终高于CK。胁迫5 d时，HRW的相对含水量比CK高6.4个百分点，脯氨酸和可溶性糖含量分别比CK高23.0%和41.5%。【结论】富氢水浸种可增强黄瓜幼苗耐冷性，其主要作用机理是：（1）增强低温下黄瓜幼苗抗氧化系统活性，减少活性氧（ROS）积累，从而减轻膜脂过氧化伤害；（2）通过提高低温下黄瓜幼苗叶片的渗透调节能力，减缓幼苗失水速度，以较长时间地维持生理功能。

中国11种野生葡萄果皮中黄烷-3-醇类物质的组成及含量

严静，江雨，樊秀彩，姜建福，张颖，孙海生，刘崇怀

中国农业科学. 2017, 50(5): 890-902. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.05.012

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【目的】探讨中国野生葡萄果皮中黄烷-3-醇类物质的组成及含量的差异，为中国野生葡萄的加工利用及种质资源的评价提供依据。【方法】以变叶葡萄、刺葡萄、华东葡萄、桦叶葡萄、毛葡萄、秋葡萄、桑叶葡萄、山葡萄、腺枝葡萄、燕山葡萄和蘡薁等11个野生种98个株系的葡萄果实为试材，以欧亚种品种‘赤霞珠’为对照，利用超高效液相色谱（UPLC）对不同野生种成熟葡萄果皮中的黄烷-3-醇类物质进行检测分析。【结果】不同野生种葡萄果皮中黄烷-3-醇含量存在较大差异，桑叶葡萄果皮中黄烷-3-醇类物质的含量高于对照，其余野生种葡萄果皮中黄烷-3-醇含量低于对照，其中桦叶葡萄和变叶葡萄最低，仅为对照的64%。供试野生葡萄果皮中黄烷-3-醇类物质的组成与对照相似，均由儿茶素、表儿茶素、表棓儿茶素和表儿茶素没食子酸酯组成，并以表棓儿茶素和表儿茶素为主；这4种组成单元均可以末端单元和延伸单元的形式参与聚合黄烷-3-醇的形成。11个野生种葡萄果皮中90%以上的黄烷-3-醇类物质以聚合体的形式存在；不同野生种葡萄果皮中聚合黄烷-3-醇的平均聚合度存在较大差异，其中山葡萄果皮聚合黄烷-3-醇的平均聚合度高达50，而桦叶葡萄果皮中聚合黄烷-3-醇的平均聚合度仅为25左右，而其余野生种则介于25—45。对不同野生种葡萄果皮中黄烷-3-醇的代谢路径分析结果表明，毛葡萄和秋葡萄果皮中黄烷-3-醇的积累更偏向于F3′5′H代谢路径。主成分分析结果表明，不同野生种之间有一定的差异，而刺葡萄与其他野生种之间的差异更为明显。【结论】刺葡萄、桦叶葡萄、桑叶葡萄、山葡萄和腺枝葡萄均有黄烷-3-醇含量高于‘赤霞珠’的株系，这些株系均可作为提高黄烷-3-醇的育种材料。此外，不同野生种葡萄果皮中黄烷-3-醇的含量存在较大差异，这对中国野生葡萄种质资源的评价具有重要意义。

提取时间对鸡骨蛋白凝胶特性和蛋白二级结构的影响

岳鉴颖，王金枝，张春晖，杜桂红，许雄

中国农业科学. 2017, 50(5): 903-912. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.05.013

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【目的】研究提取时间对鸡骨蛋白（chicken bone protein，CBP）凝胶特性的影响，为利用鸡骨副产物制备食用凝胶提供参考。【方法】采用热压抽提法提取CBP，于4℃孵育制备CBP凝胶，测定不同抽提时间的抽提液中总固形物、粗蛋白、羟脯氨酸含量、蛋白质二级结构、分子量分布的变化，探讨抽提时间对CBP凝胶色差、凝胶强度的影响，并分析各指标之间的相关性。【结果】抽提时间显著影响鸡骨蛋白的提取率（P＜0.05），导致蛋白结构发生显著变化进而影响其凝胶特性。抽提时间从0—120 min，抽提液中总固形物、粗蛋白和羟脯氨酸含量均显著增加（P＜0.05）；随着提取时间延长（40—120 min），蛋白发生显著降解，分子量10—30 kDa的肽段从40 min的59.82%降低到120 min的13.99%，分子量＜10 kDa的肽段从40 min的35.46% 升高到120 min的86.01%；提取时间延长引起蛋白发生部分程度变性，导致其二级结构改变，0—40 min时的CBP酰胺Ⅰ带由100%的α-螺旋组成，60—90 min时出现9.9%—17.6%的β-折叠结构，120 min时β-折叠全部降解；对CBP凝胶特性的分析表明，抽提时间为0 min时，鸡骨蛋白不形成凝胶，而抽提20、40和60 min时的凝胶强度无显著性差异，均优于90、120 min组；随着提取时间延长（20—120 min），提取液的透明度显著增加（P＜0.05），但40和60 min组的CBP制备的凝胶色泽最佳（P＜0.05）；抽提时间（20—120 min）对凝胶持水性无显著影响（P＞0.05）。相关性分析表明，CBP中羟脯氨酸含量、CBP降解程度与凝胶特性显著相关（P＜0.05）。【结论】热压抽提时间对CBP凝胶特性有显著影响，综合考虑蛋白得率、凝胶色泽、强度等因素，40和60 min提取的鸡骨蛋白较适合制备凝胶。

基于宏基因组学技术分析不同贮藏条件下鲶鱼片中的菌相变化

朱迎春，王洋，樊晓盼，马俪珍，王凯丽

中国农业科学. 2017, 50(5): 913-923. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.05.014

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【目的】分析鲶鱼肉片贮藏过程中微生物多样性和菌群动态变化，探究天然保鲜剂对鲶鱼肉片菌相及菌落组成的影响。【方法】试验分8组，即新鲜鲶鱼片（CK0）；空气包装（air-package，AP）鲶鱼片低温贮藏（4±1）℃第4、7天（AP4和AP7）样品；气调包装（modified atmosphere package，MAP，60% CO₂/40% N₂）鲶鱼片冰温贮藏（-0.7±0.02℃）第10、30天（MAP10和MAP30）样品；添加5%天然保鲜液（由壳聚糖、蜂胶、溶菌酶、Nisin和茶多酚复配而成）MAP鲶鱼片冰温贮藏第10、30和40天（MAPP10、MAPP30和MAPP40）样品。采用宏基因组学技术，测定并分析不同贮藏方式鲶鱼片全部微生物的16S rDNA序列，比较各组菌群的物种组成和丰度信息，通过Alpha多样性分析和主成分分析，考察包装方式、贮藏温度和天然保鲜液对微生物的抑制作用。【结果】8组样品中454焦磷酸测序共鉴定出25个门、433个属的细菌。MAP10、MAPP10、MAPP30中的最优势菌属和CK0一致，均为Actinomyces；而AP4和AP7中的最优势菌分别为Aeromonas（70.49%）和Pseudomonas（59.01%）。从微生物角度来看，MAP+冰温贮藏优于AP+冷藏。随着贮藏时间的延长，气调包装中的Lactococcus丰度由15.78%（MAP10）急剧上升为82.85%（MAP30）。添加天然保鲜液的MAPP10和MAPP30中Lactococcus几乎检测不到。【结论】气调包装协同冰温贮藏显著降低了鲶鱼片中细菌菌群的丰度和多样性，有利于延长鲶鱼肉的保质期。天然保鲜液中的茶多酚、Nisin和壳聚糖等能显著抑制MAP+冰温贮藏的鲶鱼片中的主要腐败菌属Lactococcus的生长繁殖。

热应激对猪睾丸Cyt-C和Caspase-3表达的影响

范小瑞，张禛，席华明，梁亚俊，贺俊平

中国农业科学. 2017, 50(5): 924-931. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.05.015

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【目的】环境高温影响猪精子发生和精液品质，但其分子机制尚不清楚。为此探索环境温度升高导致的热应激对猪睾丸细胞凋亡调节蛋白Cyt-C和Caspase-3表达的影响。【方法】性成熟长白公猪9头，对照组3头，饲养在20—27℃的猪舍环境；短期热应激处理组（heat stress 7 d，HS7d）3头，每天置37—40℃的猪舍环境3 h，连续7 d；一个精子发生周期热应激处理组（heat stress 42 d，HS42d）3头，每天置37—40℃的猪舍环境3 h，连续42 d；每天于热应激处理后将猪驱赶回20—27℃的猪舍。手术摘取睾丸组织，用QRT-PCR、Western blot和免疫组织化学方法检测Cyt-C和Caspase-3表达与定位的变化。【结果】 QPT-PCR结果显示，与对照组相比，热应激处理7 d组和42 d组，Cyt-C和Caspase-3mRNA的相对表达量均显著升高；热应激处理7 d组Cyt-C和Caspase-3mRNA的相对表达量最高。Western blot结果显示，热应激处理7 d组和42 d组Cyt-C和Caspase-3蛋白水平与对照组相比均显著升高；热应激处理7 d组Cyt-C和Caspase-3的蛋白表达水平最高。免疫组织化学研究发现，Cyt-C在猪睾丸组织中免疫反应阳性物定位于间质细胞、支持细胞和各个发育阶段生精细胞的胞质中，在生精细胞Cyt-C低表达于精原细胞，高表达于减数分裂后精母细胞和精子细胞。热应激处理导致Cyt-C的胞质内定位更加弥散，提示Cyt-C从线粒体到胞质的释放。Caspase-3在间质细胞和精原细胞低表达，大量减数分裂后的生精细胞呈Caspase-3阳性。与对照组相比，热应激处理导致部分支持细胞Caspase-3的表达，大量生精细胞的细胞核呈Caspase-3阳性着色。【结论】高温热应激处理导致猪睾丸Cyt-C和Caspase-3的蛋白和mRNA表达水平升高、细胞定位改变，提示Cyt-C和Caspase-3可能与热应激导致的猪精液品质下降存在关联。

16S rRNA高通量测序技术筛选牦牛瘤胃细菌基因组DNA提取方法及菌群结构

杨琦玥，黄勇，陈亚冰，刘洛川，李键，兰道亮

中国农业科学. 2017, 50(5): 932-941. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.05.016

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【目的】确定理想的牦牛瘤胃细菌基因组DNA提取方法及初步分析牦牛瘤胃细菌的群体结构。【方法】采用物理法（珠磨法、反复冻融法）、化学法（CTAB、SDS）及酶解法(溶菌酶、蛋白酶K)三者与瘤胃细菌特点相结合的方法，组合生成9种不同方法，即方法1（CTAB+SDS+Lysozyme+无特殊物理处理法）、方法2（CTAB+ SDS+Lysozyme+反复冻融法）、方法3（CTAB+SDS+Lysozyme+珠磨法）、方法4（CTAB+Lysozyme+无特殊物理处理法）、方法5（CTAB+Lysozyme+反复冻融法）、方法6（CTAB+Lysozyme+珠磨法）、方法7（SDS+Lysozyme+无特殊物理处理法）、方法8（SDS+Lysozyme+反复冻融法）、方法9（SDS+Lysozyme+珠磨法），同时以QIA amp DNA Stool Mini Kit（方法10）为对照，以这10种方法来提取瘤胃微生物基因组DNA，并通过DNA浓度、纯度、DNA电泳图等基本性质及16S rRNA高通量测序结果对其进行分析比较，同时通过测序结果初步分析牦牛瘤胃细菌群体结构。【结果】不同DNA提取方法效率比对结果显示，同样的化学及生物酶裂解条件下，结合珠磨法及反复冻融法能够显著地增强细胞裂解效率，提高DNA产量。其中方法3及方法6提取的DNA具有较高的浓度及纯度，方法7—10缺乏CTAB阳离子去污剂，提取的DNA量显著低于其他方法（P<0.05），除方法2和8所提取的样品经多次试验，PCR 产物目的条带太弱或未检测到外，其余8种方法提取的样品PCR 产物目的条带大小正确，浓度合适，符合高通量测序的要求。16S rRNA高通量测序共生成了191 349条原始数据，质控后得到有效序列171 231条。稀释性曲线分析表明，数据量合理并达到饱和，能够完整反映样品的菌群种类。OTU聚类数据统计、分类学和多样性指数分析显示方法6和10包含的细菌较丰富。不同提取方法对革兰氏阳性菌提取效果比对结果表明方法6裂解革兰氏阳性菌细胞壁的能力比其他方法相对较高。综上，方法6（CTAB-Lysozyme-珠磨）提取的DNA产量、样品多样性指数及革兰氏阳性菌破壁能力均优于其他方法。菌群结构分析表明牦牛瘤胃细菌菌群结构包括21门、35纲、75科、112属，丰度较高的菌群依次是拟杆菌Bacteroidtes (64%)、厚壁菌Firmicutes（20%）、螺旋体Spirochaetae（2.3%）和变形菌Proteobacteri（1.8%），纤维杆菌Fibrobacter (1.7%)。牦牛瘤胃细菌群体结构与黄牛相比存在着一定的差异，这可能归因于饮食及环境的不同。【结论】利用16S rRNA高通量测序筛选出了牦牛瘤胃细菌基因组DNA理想提取方法，即方法6（CTAB-Lysozyme-珠磨），并初步分析了牦牛瘤胃细菌群体结构，为研究牦牛瘤胃微生物群体特殊性及挖掘牦牛体内的基因资源奠定了基础。

基于物联网技术的生猪存亡远程监测系统设计与验证

陈桂鹏，秦文婧，丁建，万明春，郭雷风，王文生

中国农业科学. 2017, 50(5): 942-950. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.05.017

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