中国农业科学

超级杂交稻两优培九产量杂种优势标记与QTL分析

辛业芸1, 2, 袁隆平1, 2

中国农业科学. 2014, 47(14): 2699-2714. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.14.001

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【目的】对超级杂交稻两优培九影响产量及其构成因素性状的杂种优势位点进行定位，在此基础上探讨亲本培矮64S和9311的遗传差异与水稻产量性状的杂种优势间的关系，以探明水稻产量杂种优势的分子预测途径。【方法】应用经单粒传法获得后续世代的219个培矮64S×9311 F8重组自交系（RILs）株系材料与亲本培矮64S回交，并选用151个分布于水稻基因组12条染色体上的SSR多态性标记，构建回交群体RILs BCF1；构建基因组总长为1 617.7 cM、标记间平均距离10.93 cM和含151个分子标记的遗传图谱；采用分子标记技术和自由度不等的单向分组方差两组法、三组法分析，用SAS软件ANOVA分析、混合线性模型复合区间作图等方法，对回交RILs BCF1群体的产量性状及其构成因素的F1表型值进行相关分析、优势预测与QTL定位。【结果】本回交杂种群体RILs BCF1具备多种基因型，遗传变异丰富，性状平均值均显著高于亲本群体重组自交系RILs F8，共筛选到影响RILs BCF1群体产量及其构成因素性状杂种优势的阳性、增效位点74个；其中，三组法所筛选的阳性、增效位点数高于两组法，用这些阳性、增效位点所预测的遗传距离与产量F1性状值的相关性也显著提高；三组法所筛选产量性状的增效位点与两组法所筛选的增效位点完全一致；连锁紧密的位点有成簇分布的现象，每穗空粒数、每穗实粒数、结实率有6个杂种优势位点相同，并与3个产量杂种优势位点重叠，且均处在第7染色体上；通过逐步回归建立了对4个产量性状进行预测的回归方程模型；筛选到28个杂合型的特异性标记，它们与产量性状的表型值显著相关，使用特异性标记可使遗传距离与产量F1性状值的相关系数由全部标记的0.335提高到0.617；定位到3个与产量杂种优势相关的QTL和3个影响每穗实粒数杂种优势的QTL。其中，在第7染色体上影响每穗实粒数和产量杂种优势的QTL QGpp7和QHy7与影响每穗实粒数和产量杂种优势的增效位点的结果相符。【结论】通过增加筛选产量杂种优势阳性位点或增效位点数量、筛选影响杂种优势特异性分子标记的方法，可显著提高分子标记遗传距离与产量F1性状值的相关性，有效提高用分子标记遗传距离对杂种优势预测效率。定位了3个影响产量杂种优势的QTL及3个影响每穗总粒数杂种优势的QTL，分别在第2、3、7、11和12染色体上，其中，影响产量杂种优势的数量性状位点QHy7，贡献率为7.48%，可用于杂种优势的预测和杂交组合的选配。定位于第3染色体RM293—RM468的表型贡献率为14.9%的抽穗期QTL可用于早熟高产水稻的选育。

转基因水稻中GUS蛋白质的检测及其表达特征

牛东东1, 郝育杰2, 荣瑞娟1, 韦汉福2, 兰金苹1、史佳楠1, 魏健1, 李雪姣1, 杨烁1, 奚文辉2, 武鹏程2, 刘丽娟1, 吴琳3, 刘斯奇3, 尹长城2, 刘国振1

中国农业科学. 2014, 47(14): 2715-2722. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.14.002

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【目的】建立转基因水稻中GUS蛋白质的免疫学检测方法，并了解花椰菜花叶病毒（CaMV）35S启动子驱动的GUS蛋白质在转基因水稻中的表达特征。【方法】以细菌基因组DNA为模板，PCR扩增GUS基因后克隆到表达载体pET30a中，测序验证的重组子转入大肠杆菌表达菌BL21中，IPTG诱导获得重组表达的GUS蛋白质，用HIS-tag beads纯化后作为免疫原免疫小鼠制备GUS蛋白质特异的抗体，通过免疫印迹分析筛选高特异性的单克隆抗体，用Broadford法对重组的GUS蛋白质进行定量，对不同浓度的GUS蛋白质进行免疫印迹分析，绘制检测GUS蛋白质的标准曲线，通过与标准曲线的比较对水稻叶片中GUS蛋白质进行定量分析。提取不同时期、不同部位的水稻总蛋白质，包括苗期的地上部、地下部，分蘖期的茎、茎节、叶鞘、叶枕、叶片上部、叶片中部和叶片下部，孕穗期的茎、穗轴、叶鞘、叶枕、叶片、幼穗（长度分别为1、2、10和20 cm），开花期的茎、穗轴、叶鞘、叶片、穗子，成熟期的茎、叶片、授粉后不同时期的种子（分别为授粉后10、20、30和40 d）、乳熟期的胚、胚乳和颖壳、成熟种子的全种子、胚、胚乳和颖壳以及不同时期的叶片和根部材料等。SDS-PAGE分离后用抗体检测其GUS蛋白质的丰度。【结果】筛选获得了高特异性的抗GUS单克隆抗体（编号为#27），用该抗体检测转基因水稻中及重组的GUS蛋白质均呈现特异条带，没有可见的背景信号，用本研究建立的免疫印迹方法对重组GUS蛋白质的检测下限约为4 ng，可检出转基因水稻单粒大米2.5%样品中（约0.6 mg）的GUS蛋白质。在不同时期的转基因水稻叶片中GUS蛋白质的表达丰度基本稳定，而在水稻根部的GUS丰度随生长急剧减少，5叶期根中的表达量不到3叶期的三分之一，到6叶期检测不到GUS蛋白质。在水稻苗期叶片中，GUS蛋白质约占鲜重的0.02‰。另外，除分蘖期以后的根部之外，GUS蛋白质几乎在所有的水稻组织部位中呈组成型表达，只是不同组织中的表达量略有差异，如在孕穗期和开花期的茎及颖壳中的表达量较低。【结论】建立了具有应用价值的对转基因水稻中GUS蛋白质丰度检测的免疫印记方法。该方法特异性高、样品用量少、不依赖于GUS蛋白质的酶活性、测定结果易于在不同实验室间比较。证明了35S启动子驱动的GUS蛋白质在转基因水稻中基本呈组成型表达。

中国不同年代主推玉米品种品质性状的变化趋势

孙琦1, 2, 张世煌1, 李新海1, 孟昭东2, 慈晓科1, 张德贵1, 郝转芳1, 翁建峰1, 白丽1, 李明顺1

中国农业科学. 2014, 47(14): 2723-2730. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.14.003

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【目的】以中国20世纪50年代以来各时期生产上大面积应用的主要推广品种为材料，研究中国玉米主推品种籽粒品质性状的变化趋势，以期为未来的优质玉米品种选育提供参考。【方法】选取1950—2000年代各时期生产上大面积推广的品种共35个，种植在中国农业科学院作物科学研究所顺义试验基地，随机区组设计，每个品种种植5行，3次重复，选中间2行收获，收获后考察每小区籽粒产量、容重，利用近红外光谱分析仪测定籽粒中淀粉、蛋白质与脂肪的含量。对所有品种的品质性状、产量进行方差分析，同时对品质性状与产量间的相关性进行分析。根据每个年代的各品质性状、产量的平均值进行回归分析，研究品质性状与产量随年代的变化趋势。【结果】年代内，玉米品种淀粉含量、蛋白质含量与容重的变异系数均在10%以下，脂肪含量的变异系数在9.54%—18.74%，产量的变异系数为4.53%—33.33%，表明每个年代内不同品种的淀粉含量、蛋白质含量、容重差异较小，脂肪含量与产量变异幅度较大。年代间的产量呈极显著差异，淀粉含量、蛋白质含量和容重在年代间的差异也呈极显著水平，但脂肪含量差异不显著。1950—2000年代主推玉米品种的产量随着年代变化呈逐渐上升趋势，平均每10年上升871 kg•hm-2；淀粉含量随着年代变化总体呈上升的趋势，平均每10年上升0.25%；蛋白质含量随年代变化呈逐渐下降趋势，平均每10年下降0.31%；容重随年代变化总体呈上升趋势，平均每10年上升5.97 g•L-1。淀粉含量与产量呈显著正相关（r=0.493），蛋白质含量与产量呈显著负相关（r=-0.678）。由以上说明，1950—2000年代玉米主推品种淀粉含量的上升，蛋白质含量的下降与产量的提高具有相关性。【结论】1950—2000年代主推玉米品种的产量得到大幅度提高，淀粉含量与容重有所提高，蛋白质含量稍有下降趋势，脂肪含量没有显著变化。

作物产量差研究进展

杨晓光, 刘志娟

中国农业科学. 2014, 47(14): 2731-2741. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.14.004

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随着人口的增加以及生活水平的提高，人们对粮食的需求不断增加，因此增加粮食产量、确保粮食安全仍是未来永恒不变的课题。近年来随着育秧、覆膜等技术的应用，灌溉、施肥技术措施的提高以及作物品种的更替和技术的进步等使得农作物产量呈现增加的趋势。即便如此，作物实际产量与其潜在产量间仍然存在较大差距，而这种现象广泛存在于世界各国的农业生产中。文章在阐述产量差内涵的基础上，对目前国内外产量差的研究方法及主要研究进展等方面进行了综述，并对未来产量差的研究做了展望，以期为进一步开展产量差研究提供科学参考。产量差概念发展至今，虽然众多学者都对其做了不同的定义及阐述，但总体而言，作物的最大产量水平为潜在产量，实际产量与潜在产量之间的产量差为该作物的总产量差。造成作物产量差的原因主要包括不可能应用到田间的技术和环境因子、生物因素（品种、病虫害等）和经济因素（投入产出比）、政策、文化水平及传统观念等。为了进一步解析作物产量差，前人根据研究目的的不同，划分了不同等级的产量差。目前国内外产量差的研究方法主要有试验调查统计分析法和作物模拟模型法。前者概念简单，可操作性强，但是要求足够的试验数据，试验费用大，周期长；后者可以设置更多的情景和处理，但难以精确定量实际生产中的所有管理措施。因此，在实际进行产量差研究中，可综合利用统计方法、作物模拟模型及遥感方法，充分发挥各种方法的优势。世界各地主要作物产量差的研究结果显示，发达国家因栽培管理水平相对较高，作物产量提升空间较小。虽然各地学者对当地不同作物产量差进行了详细的研究，为提升该地区产量、缩小作物产量差提供了科学依据和参考。然而，由于产量估算方法不同，使得研究结果之间差异较大，可比性差。同时因数据和方法的限制，大多集中在解析农业生产过程中的气候、土壤、品种、栽培管理措施等因素对产量的限制程度，而往往忽略了在产量形成过程中农民意愿、政策和经济等因素的影响。总之，未来的产量差研究重点应包括准确计算各区域主要作物产量潜力上限，明确针对不同产量差计算方法，综合考虑气候、土壤、品种和栽培技术以及社会经济因素，解析产量差限制程度。

氮磷互作对水稻冠层光谱的影响及其PNN识别

李颖1, 薛利红2, 潘复燕1, 杨林章2

中国农业科学. 2014, 47(14): 2742-2750. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.14.005

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【目的】氮、磷均为作物必需的大量营养元素，其丰缺诊断直接关系到合理科学施肥，进而影响产量、效益以及环境。本文旨在研究准确、快捷、无损地区分水稻缺氮和缺磷信息的光谱识别方法，从而指导田间施肥决策，精确作物管理、节约种植成本并控制农田面源污染。【方法】基于水稻6个氮素及两个磷素营养水平交互下的盆栽试验，分别在分蘖、拔节和抽穗期测定水稻冠层的可见近红外反射光谱（350—1 330 nm）及植株全氮（TN）和全磷（TP）含量等数据，分析氮磷互作对水稻植株体内TN和TP含量以及冠层反射光谱的影响，并运用概率神经网络(PNN)分别对不同生育时期的冠层光谱进行氮水平、磷水平、氮磷交互水平和缺素水平4个尺度下的分类识别。为避免光谱测量时仪器误差和光照、风力、温度、水分等环境条件所造成光谱数据批次间的差异，PNN分类识别前对光谱数据进行标准化处理，并将其中2/3作为训练集，另外1/3作为测试集。【结果】植株全氮含量受氮肥、磷肥和氮磷交互作用的影响显著；植株全磷含量则主要受磷肥和氮肥水平的双重影响，但不存在氮磷交互作用。水稻冠层光谱对氮肥的响应规律不受磷肥水平的影响，缺氮使可见光区反射率升高，近红外区反射率下降。缺磷使近红外区反射率下降，但可见光区的响应则受氮肥水平的影响，施氮处理呈上升趋势，氮胁迫处理则呈现分蘖期下降、拔节期上升、抽穗期下降的趋势。利用冠层光谱PNN模型可以对各个生育时期氮水平、磷水平、氮磷交互水平和缺素水平等不同施肥尺度进行识别，拔节期分类精度最高，抽穗期分类精度相对最低。4种分类尺度下PNN模型对磷素水平的分类精度最高，分蘖期和拔节期分别为83%和94%；其次是缺素水平，分别为78%和88%；对氮素水平以及氮磷交互水平等有较多个分类输出的识别精度较低，为61%—75%。值得一提的是，PNN模型对水稻施肥关键生育时期分蘖期和拔节期水稻植株缺氮缺磷、缺氮不缺磷、缺磷不缺氮、不缺氮不缺磷等4种缺素水平的分类中，所有只缺氮处理没有被预测为只缺磷处理，所有只缺磷处理也没有被误判为只缺氮处理，表明冠层光谱PNN模型能有效区分开氮磷胁迫。【结论】水稻的冠层光谱受到氮、磷水平的共同影响，利用水稻冠层光谱建立的PNN模型不仅能分别辨识各氮素、磷素施肥水平，并且能有效地区分开水稻缺磷和缺氮处理，避免混淆，对有目的性的指导施肥具有重要的意义和价值，可避免不恰当的施肥策略造成的环境、产量和经济损失。

拔节期和开花期不同土层深度测墒补灌对北方小麦旗叶叶绿体超微结构和荧光特性的影响

刘月兰, 于振文, 张永丽, 石玉, 王东

中国农业科学. 2014, 47(14): 2751-2761. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.14.006

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【目的】研究拔节期和开花期土层深度测墒补灌对北方小麦旗叶叶绿体超微结构和叶绿素荧光特性的影响，为小麦节水高产栽培提供理论依据和技术参考。【方法】以济麦22小麦品种为试验材料，于2011—2012年和2012—2013年小麦生长季，在大田条件下设置4个测墒补灌土层深度（0—20 cm、0—40 cm、0—60 cm和0—140 cm，各处理土壤相对含水量均补灌至75%，以生育期不灌水为对照），用透射电镜观察旗叶叶绿体超微结构、乙醇提取法测定叶绿素含量、叶绿素荧光仪测定叶绿素荧光参数，研究不同处理对小麦旗叶叶绿素含量、叶绿体超微结构、叶绿素荧光特性及籽粒产量、水分利用效率和经济效益的影响。【结果】（1）依据0—40 cm土层测墒补灌，开花后22 d旗叶叶绿体呈椭圆形，沿细胞膜紧密排列，叶绿体膜和细胞膜完整，基粒片层清晰且沿叶绿体长轴方向排列，基粒片层间由清晰的基质片层连接；依据0—20 cm土层测墒补灌和生育期不补灌的处理旗叶叶绿体超微结构均有损伤，不补灌的处理损伤最重，叶绿体变为圆形，在细胞内排列紊乱，叶绿体膜和细胞膜溶解，细胞壁断裂。依据0—60 cm土层测墒补灌与依据0—40 cm土层测墒补灌叶绿体超微结构无显著差异，测墒补灌土层加深至0—140 cm，叶绿体膜完整，细胞膜部分损伤，基粒片层间出现缝隙。（2）相关分析表明，旗叶叶肉细胞叶绿体数、叶绿体基粒数和基粒片层数均与叶绿素含量呈极显著正相关（r＝0.99**，0.99**，0.96**）。依据0—40 cm土层测墒补灌，开花后22 d旗叶叶肉细胞叶绿体数、叶绿体基粒数和基粒片层数比依据0—20 cm土层测墒补灌和生育期不补灌的处理显著增加，是其叶绿素含量较高的主要原因；测墒补灌土层加深至0—60 cm和0—140 cm，旗叶叶肉细胞叶绿体数、叶绿体基粒数和基粒片层数无显著增加，叶绿素含量亦无显著增加。（3）依据0—40 cm土层测墒补灌，灌浆中后期旗叶最大光化学效率（Fv/Fm）、实际光化学效率（ΦPSⅡ）、表观光合电子传递速率（ETR）和千粒重、籽粒产量及经济效益均比依据0—20 cm土层测墒补灌和生育期不补灌的处理显著增加，水分利用效率比依据0—20 cm土层测墒补灌的处理显著增加。测墒补灌土层加深至0—60 cm或0—140 cm，Fv/Fm、ΦPSⅡ和ETR均无显著增加，千粒重、籽粒产量、水分利用效率和经济效益亦无显著提高。【结论】依据0—40 cm土层测墒补灌，旗叶叶绿体超微结构保持良好，叶肉细胞叶绿体数、叶绿体基粒数和基粒片层数较多，小麦灌浆中后期叶绿素含量和荧光参数较高，是其千粒重和籽粒产量较高的主要原因。综合籽粒产量、水分利用效率和经济效益，依据0—40 cm土层测墒补灌的处理为本试验条件下的最优处理。

中国主要稻区稻曲病菌的生物学特性及群体遗传多样性

王文斌1, 2, 张荣胜2, 罗楚平2, 尹小乐2, 刘永锋2, 陆凡1, 2, 陈志谊1, 2

中国农业科学. 2014, 47(14): 2762-2773. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.14.007

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【目的】明确采自中国10个水稻主产省份111个稻曲病菌（Ustilaginoidea virens）菌株的生物学特性、群体遗传多样性与地理区域的关系。【方法】采用生物学方法测定111个稻曲病菌菌株的产孢能力、生长速率和致病力，并采用SPSS 20.0软件对稻曲病菌菌株的产孢能力、菌丝生长速率及致病力进行相关性分析。提取111个稻曲病菌基因组DNA，采用3对特异性引物BOX、REP、ERIC对稻曲病菌菌株的全基因组DNA进行PCR扩增，通过聚类分析对其群体遗传多样性进行研究。【结果】111个稻曲病菌菌株的致病力与产孢量的Pearson相关系数为0.765，显著性概率为0.001；致病力与生长速率的Pearson相关系数为0.035，显著性概率为0.685。采用3对特异性引物BOX、ERIC、REP对稻曲病菌菌株的全基因组DNA进行了PCR扩增，群体遗传多样性值分别为0.73、0.62和0.60。111个稻曲病菌菌株的DNA用BOX引物分别扩增出7—13条不等的带谱，DNA指纹相似性在0.70相似水平上，供试菌株被划分为6种基因类群，其中第1类群为优势类型，有57个菌株，占总数的51.4％；来自安徽、四川、广西、湖北和云南的菌株主要划分在类群1和4，第2类群主要是来自江苏的菌株，有18个菌株，占总数的16.2%；第3类群是来自浙江的菌株，有8个菌株，占总数的7.2%；第5类群是来自黑龙江的菌株，有9个菌株，占总数的8.1%，第6类群是来自辽宁的菌株，有12个菌株，占总数的10.8％。稻曲病菌基因类群与地理区域之间有一定的相关性，与致病力、生长速率和产孢量之间没有相关性。【结论】来自中国10个省份的111个稻曲病菌菌株的致病力与产孢量之间具有显著相关性，相关程度为中等；致病力与菌丝的生长速率没有相关性。根据BOX-PCR扩增的稻曲病菌菌株基因组DNA指纹图谱的多态性进行划分的基因类群与地理区域之间显著相关，推测稻曲病菌属于局域性传播；基因类群与生物学特性之间没有相关性。

叶锈菌及信号分子诱导小麦TcLr35中β-1,3-葡聚糖酶基因的表达分析

栗小英, 高琳, 张艳俊, 王海燕, 刘大群

中国农业科学. 2014, 47(14): 2774-2783. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.14.008

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【目的】β-1, 3-葡聚糖酶是一种病程相关（pathogenesis-related，PR）蛋白，了解小麦TcLr35中β-1, 3-葡聚糖酶基因在叶锈菌（Puccinia triticina）与TcLr35小麦互作体系中的表达模式，明确其与TcLr35小麦抗叶锈病相关性，进而探讨PR蛋白介导的小麦成株抗叶锈病的分子机理。【方法】在前期研究基础上，利用生物信息学方法分析已克隆β-1, 3-葡聚糖酶类病程相关蛋白基因TaLr35PR2结构特征，利用半定量RT-PCR方法结合genetools和SPSS软件检测叶锈菌及信号分子诱导后不同时间点该基因表达量，并明确其在小麦根、茎和叶各生长器官及小麦不同生长时期的基因表达模式。【结果】小麦TaLr35PR2含有信号肽，编码定位于液泡的碱性蛋白，蛋白序列与其他物种PR2类蛋白序列具有较高同源性，与普通小麦病程相关蛋白2亲缘关系最近，与水稻病程相关蛋白亲缘关系最远。小麦成株期接种叶锈菌后不同时间点，TaLr35PR2在亲和反应（Thatcher）中表达量变化不大，趋于平缓；而在非亲和反应（TcLr35）中的表达有显著差异，总体上，该基因在非亲和组合中表达量明显高于亲和组合中表达量。检测TaLr35PR2在成株小麦TcLr35各器官中基因表达，该基因在叶片中表达量随接菌时间点延长明显增加，并在接菌后48 h达到表达高峰；而在根中接菌后各时间点均未检测到基因表达；在茎中接菌后48 h开始有少量表达，但表达量变化不大，趋于平缓，总体表达丰度为叶＞茎＞根。在小麦生长发育的不同时期，除1叶期外，该基因在TcLr35和Thatcher中均有表达，Mock（未接菌处理）反应中，TaLr35PR2在小麦不同生长期的表达呈上升趋势；接种叶锈菌后，TaLr35PR2在亲和反应和非亲和反应小麦各生长时期的表达量均高于Mock反应，且在成株期表达稳定。信号分子水杨酸（salicylic acid，SA）、脱落酸（abscisic acid，ABA）均能诱导该基因的表达，信号分子预处理后接种叶锈菌，基因表达量显著上调。【结论】TaLr35PR2的表达受叶锈菌诱导，TaLr35PR2可能参与SA、ABA介导的信号通路，并参与小麦TcLr35成株抗叶锈病防御反应。

利用酵母双杂交技术筛选介体灰飞虱中与水稻条纹病毒病害特异蛋白互作的蛋白质

秦发亮, 刘文文, 李莉, 王锡锋

中国农业科学. 2014, 47(14): 2784-2794. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.14.009

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【目的】筛选介体灰飞虱（Laodelphax striatellus，SBPH）中与水稻条纹病毒（RSV）病害特异蛋白（disease-specific protein，SP）可能发生相互作用的蛋白质，为明确介体灰飞虱传播RSV的分子机制及SP在传毒过程中的作用打下基础。【方法】提取高质量灰飞虱总RNA并通过TaKaRa D9086 OligtexTM-dT30 mRNA Purification Kit对mRNA进行纯化。利用SMART技术合成双链cDNA，利用Axygen的PCR纯化回收试剂盒将ds cDNA回收纯化，纯化后的ds cDNA再经SfiⅠ限制性内切酶处理纯化后与文库载体pPR3-N相连接以构建高质量灰飞虱cDNA文库，通过电转化的方法对灰飞虱cDNA文库进行扩增并进行cDNA文库质量和滴度检测。设计带有SfiⅠ酶切位点的引物以扩增得到目的基因即RSV SP。将带有酶切位点的SP基因序列连接到载体pDHB1上构成诱饵载体pDHB1-SP。将诱饵载体pDHB1-SP转化酵母菌NMY51中并提取总蛋白，通过Western Blot方法检测诱饵载体上的目的基因SP是否表达，并通过功能验证试验验证诱饵载体是否适合本研究采用的分裂泛素酵母双杂交系统。确定构建的诱饵载体适合本系统后，用诱饵载体与文库质粒pPR3-N共转化到酵母菌NMY51中以优化cDNA文库筛选条件并明确3-AT浓度。对灰飞虱cDNA文库进行筛选并对筛选结果进行分析，对筛选出来的蛋白进行体内试验以进一步验证是否发生互作。【结果】提取到高质量的灰飞虱总RNA，通过SMART技术合成的ds cDNA大小介于0.1—4.5 kb。构建的灰飞虱cDNA文库的库容量超过1.2×106 cfu，文库滴度为1.12×108 cfu/mL，扩增文库插入片段平均长度大于1.5 kb。载体酶切验证表明诱饵载体pDHB1-SP成功构建；Western Blot结果表明诱饵载体pDHB1-SP能够在NMY51中正常表达；功能验证表明诱饵载体pDHB1-SP适合该系统。在3-AT浓度为20 mmol?L-1的筛选条件下从构建的高质量的灰飞虱cDNA文库中筛选得到534个克隆，经测序、Blast比对最终得到76个可能与RSV的SP发生互作的灰飞虱蛋白质。根据SP在灰飞虱体内的亚细胞定位结果以及通过gene ontology(GO)对蛋白质的功能分析，挑选出20个蛋白质进行共转和β-galactosidase检测，结果表明这20个蛋白质均与RSV SP互作。【结论】通过构建高质量灰飞虱cDNA文库及酵母双杂交技术，筛选出了与RSV SP互作的蛋白质，为明确介体灰飞虱传播RSV的分子机制，及RSV的SP在传毒过程中的功能打下了基础。

长期施氮引起的黄土高原旱地土壤不同形态碳变化

李小涵1, 2, 李富翠1, 刘金山1, 2, 郝明德3, 王朝辉1, 2

中国农业科学. 2014, 47(14): 2795-2803. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.14.010

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【目的】提高土壤碳固持，特别是增加有机碳累积、减少碳损失，对于提高旱地土壤肥力、缓解大气温室效应具有重要意义。黄土高原旱地土壤有机碳含量低，增施氮肥是这一地区重要的作物增产措施，但氮肥投入对土壤碳的影响如何，一直没有报道。【方法】利用黄土高原旱地持续23年的长期定位试验，在每年施磷39 kg P2O5•hm-2条件下，设置0、45、90、135、180 kg N•hm-2 5个氮水平种植冬小麦，在小麦收获期采集0—40 cm不同土层的土壤样品，研究长期施用不同用量的氮肥对旱地土壤总碳、有机碳、轻质有机碳及无机碳的影响，分析不同氮肥用量引起的土壤有机碳、轻质有机碳及无机碳累积量的变化，定量分析氮肥用量对旱地土壤不同形态碳的影响。【结果】随氮肥用量增加，旱地土壤不同土层总碳无显著变化，但0—30 cm土层有机碳含量却随之增加，与不施氮肥相比，增幅可达7%—28%；0—40 cm土层轻质有机碳含量也增加，增幅达31%—106%，但施氮量过高不利于有机碳累积。对不同形态土壤碳累积量与氮肥用量的回归分析表明，施氮量120 kg N•hm-2时，0—30 cm土层有机碳累积量达最高值36.6 Mg；施氮量161 kg N•hm-2时，0—40 cm土层轻质有机碳累积量达最高值2.69 Mg；每千克肥料氮每年可使土壤有机碳增加1.34 kg•hm-2，轻质有机碳增加0.31 kg•hm-2；0—20 cm表层土壤轻质有机碳占有机碳的百分比也随施氮量增加而升高。相反，5—20 cm土层土壤无机碳含量却随氮肥用量增加而显著降低，施氮量180 kg N•hm-2时，无机碳累积量比不施氮减少2.8 Mg，每千克肥料氮每年可使无机碳减少0.67 kg•hm-2。【结论】在黄土高原旱地长期施用不同用量的氮肥虽不显著影响土壤的总碳数量，却显著地改变了旱地土壤碳的组成，即通过增加土壤的轻质有机碳，增加了土壤的有机碳累积量，同时降低了土壤的无机碳累积。因此，合理调控氮肥用量，不仅是旱地作物增产的关键措施，对增加土壤有机碳固持、培肥土壤也有重要意义。同时，施用氮肥引起的土壤无机碳损失不容忽视，其潜在的农业、生态与环境效应需引起大众关注。

施氮方式对玉米根系生长、产量和氮素利用的影响

漆栋良, 吴雪, 胡田田

中国农业科学. 2014, 47(14): 2804-2813. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.14.011

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【目的】垄植沟灌技术在西北内陆地区应用广泛，但往往施氮方式单一，在大田常规沟灌条件下，研究不同施氮方式对春玉米根系生长及产量和氮素利用效率的影响，揭示不同施氮方式下根系的生长分布及产量和氮素利用规律，探求西北内陆干旱、半干旱地区沟灌条件下合理施氮方法。【方法】以金穗4号春玉米为供试材料，连续两年在大田条件下，采用垄植沟灌技术，设均匀沟氮（CN，即两侧沟同时均匀施氮）、交替施氮（AN，即两侧沟交替施氮）和固定施氮（FN，即始终给一侧沟施氮）3种处理。各处理施氮量均为200 kgN•hm-2，氮肥选用尿素，分3次开沟施入，基施50%，大喇叭口期和抽雄期各追肥25%；磷肥选用过磷酸钙，作为底肥开沟前均匀撒施，施磷量45 kgP2O5 •hm-2。灌溉定额3 750 m3•hm-2,分别在播后、拔节期、大喇叭口期、抽雄期和灌浆期灌水，灌水定额相同。分别在抽雄期、灌浆期和成熟期监测0—100 cm土层各层（每20 cm一层）植株下方、植株左侧和右侧的玉米根系长度，并根据采样土体折算根长密度。收获后测定产量及植株全氮量，折算氮素利用效率。【结果】玉米根系主要聚集在植株下0—40 cm土层，随着土层深度增加，根长密度呈递减趋势。监测期内，根长密度大小表现为：均匀沟施＞交替施氮＞固定施氮。0—40 cm土层根长密度以均匀施氮较大，60—100 cm土层中根长密度以固定施氮较大。固定施氮下，植株两侧根长密度值差异明显；均匀施氮和交替施氮下，植株两侧根长密度值相近。均匀施氮下，两年平均氮素吸收量、产量和氮素利用效率的值分别为217.8 kgN•hm-2、10 318 kg•hm-2和47.3 kg•kg-1N。较固定施氮和交替施氮，氮素吸收量平均提高了4.3%和2.5%；产量平均提高了8.5%和4.4%；氮素利用效率平均提高了4.1%和1.9%。【结论】均匀施氮在监测生育期内维持了较大根量，植株左右两侧根系分布最均匀；固定施氮下，根系在植株左右两侧分布差异明显；交替施氮表现介于均匀施氮和固定施氮之间。在维持玉米根系的生长和产量形成方面，均匀施氮表现最好，交替施氮次之，固定施氮最差。常规沟灌条件下，氮肥均匀撒施在两侧沟内为较好的施氮方式。

西瓜遗传图谱构建及果实相关性状QTL分析

刘传奇, 高鹏, 栾非时

中国农业科学. 2014, 47(14): 2814-2829. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.14.012

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【目的】利用CAPS及SSR标记构建西瓜遗传图谱，对西瓜果实相关性状进行QTL分析，为西瓜果实性状改良、主效基因精细定位及克隆奠定基础。【方法】授粉后40 d对母本PI186490、父本LSW-177以及两者杂交获得的F2群体的果实进行采摘，对每个果实的果形指数、中心和边缘可溶性固形物、中心和边缘果肉硬度、果皮硬度、种子长度、种子宽度、种子厚度以及种子百粒重进行调查，将所得数据用软件SPSS19进行统计分析。通过Illumina HiSeq 2000高通量测序平台对两亲本材料进行基因组重测序，每样品产出10 G数据量，覆盖西瓜基因组20×以上，所得数据以已经发布的基因组数据为参考基因组，用bwa软件进行基因组组装，组装后利用Samtools软件进行SNP发掘，利用perl语言自编脚本提取SNP位点前后1 000 bp的序列，将SNP及其侧翼序列输入软件SNP2CAPS以转化为CAPS标记。在每条染色体上平均选取20个CAPS酶切位点，利用Primer Premier 5软件在突变位点上下游100-500 bp左右设计CAPS引物，进行PCR扩增和酶切检验，酶切产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。SSR引物来源于前人发表文献，PCR扩增产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。对所有分子数据进行卡方检验，在其中选择符合1﹕2﹕1比例的标记用于构建遗传连锁图谱。利用Mapmaker/Exp version 3.0软件构建遗传连锁图谱，用Group命令对标记进行连锁分组，标记数目少于8的连锁群用Compare命令进行排序优化，标记数多于8的连锁群用Try命令排序。绘制遗传图谱使用Map Chart 2.1软件。QTL分析运用QTL Network 2.0软件，利用置换测验做1 000次重复，临界阈值为P=0.005，采用复合区间作图法，在每条染色体上以1.0 cM步行速度在全基因组范围内扫描，分析QTL加性效应和上位效应。【结果】本遗传连锁图谱共包含16个连锁群，涉及CAPS标记87个，SSR标记9个，覆盖基因组1 484.3 cM，平均图距15.46 cM。利用QTL Network 2.0分析，检测到6个西瓜果实相关性状的8个QTL位点和1对上位效应位点，其中包括果形指数QFSI 1、中心可溶性固形物QCBR、中心果肉硬度QCFF、边缘果肉硬度QEFF、种子长度QSL各1个，种子宽度QSWD 1、QSWD 2、QSWD 3 3个；上位效应位点包括果形指数FSI 2、FSI 3。表型贡献率大于等于10%的QTL有6个，可解释11.7%—18.8%的遗传变异。【结论】以CAPS标记为主要标记构建西瓜遗传图谱，并且定位了控制西瓜果实相关性状的8个加性QTL与1对上位性QTL，可用于进一步精细定位与克隆西瓜果实优良性状基因。

轮作不同作物对苹果园连作土壤环境及平邑甜茶幼苗生理指标的影响

吕毅1, 宋富海1, 李园园2, 沈向1, 陈学森1, 吴树敬1, 毛志泉1

中国农业科学. 2014, 47(14): 2830-2839. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.14.013

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【目的】以25年苹果园连作土壤为对象，研究轮作不同作物对该土壤环境及平邑甜茶幼苗生理指标的影响，筛选适宜的轮作植物，为防控苹果连作障碍提供依据。【方法】取老龄苹果园土壤，混匀后填入试验沟，并在试验沟中分别种植一茬小麦（Triticum aestivum）、花生（Arachis hypogaea）、苜蓿（Medicago sativa Linn）、小葱（Allium schoenoprasum）、马铃薯（Solanum tuberosum L.）后，测定土壤有机质，速效氮、磷、钾，有效铁、锰、铜、锌含量和土壤细菌、真菌、放线菌数量变化，以及土壤酚酸类物质含量；取轮作不同作物后的土壤盆栽平邑甜茶幼苗，测定平邑甜茶幼苗生物量及根系活力、SOD、POD、CAT酶活性。【结果】与对照土壤相比，轮作小麦、小葱能够显著增加土壤有机质含量，分别增加了48.37%、36.7%；轮作马铃薯和休茬土壤有机质含量较对照降低，分别降低了8.61%、9.26%；轮作马铃薯能够显著增加土壤速效氮、磷，有效铜、铁、锌的含量，与对照相比分别增加了217.32%、240.55%、47.03%、91.38%、158.30%；轮作花生较对照能够显著降低土壤速效钾含量，但增加了有效铁、锰含量；轮作小葱、小麦、花生可增加土壤细菌总量，降低土壤中有害真菌数量，其中轮作小葱较对照细菌总量增加了200%、真菌总量下降了44.7%，轮作小麦较对照细菌总量增加了141.9%。轮作小葱、小麦使土壤细菌/真菌比值分别提高了435.8%、211.1%；轮作小葱使土壤中酚酸类物质总量较对照降低了45.3%，较轮作马铃薯降低了241.15%，较轮作小麦降低了190.07%，其中根皮苷含量较对照下降了84.2%，较轮作马铃薯下降了55.80%，较轮作小麦下降了9.30%；与对照相比，轮作小葱能显著提高平邑甜茶幼苗根系SOD、POD、CAT酶活性，分别增加了48.12%、58.33%、65.77%。从平邑甜茶生物量可以看出，轮作小葱与对照相比地上鲜重增加49.7%，地下鲜重增加76.5%，与轮作花生相比，地上鲜重显著增加了40.63%、与轮作小麦相比，地下鲜重显著增加了56.84%。【结论】轮作不同植物对连作土壤环境和平邑甜茶幼苗根系影响差异较大，轮作小葱能够增加土壤有机质含量，同时增加土壤中细菌/真菌值，降低土壤中酚酸类物质总量，提高平邑甜茶幼苗根系保护性酶活性，增加地上和地下生物量。从轮作防控苹果连作障碍角度看，轮作小葱更有利于减轻苹果连作障碍。

不同产地苦荞籽粒中多酚的组成、分布及抗氧化性比较

刘琴, 张薇娜, 朱媛媛, 胡秋辉

中国农业科学. 2014, 47(14): 2840-2852. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.14.014

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【目的】对不同产地的不同品种苦荞中多酚在壳、麸皮和粉中的含量以及多酚含量与抗氧化性的相关性进行比较研究，为苦荞的育种及深度加工利用提供科学依据。【方法】用Folin-酚法测定来自3个省份的17个品种苦荞的壳、麸皮、粉及全谷中的总酚含量，用液相色谱与质谱联用（HPLC/MS）结合串联质谱法（MS/MS）对多酚的成分进行鉴定和定量分析，并用DPPH和ORAC法对不同样品的多酚提取物的抗氧化性进行比较。【结果】Folin-酚法和HPLC法测定结果均表明，苦荞麸皮中的总酚含量最高，按HPLC法测定结果，17个品种苦荞麸皮中总酚平均含量为4 410.23 mg/100 g,分别是壳和粉中总酚平均含量的4.8倍和15.5倍。在所有样品中共鉴定出8个多酚组分，其中芦丁为主要成分，在壳、麸皮和粉中的含量分别为342.55—1758.06 mg/100 g、2 653.84—5 488.55和148.23—542.68 mg/100 g，分别占壳、麸皮和粉的总酚含量的82.13%—90.16%、87.71%—92.09%和80.85%—86.53%。绿原酸只在壳中被检出，而金丝桃苷主要存在于壳和麸皮中。不同产区的不同品种苦荞中多酚的分布及含量差异显著，其中，云南产的苦荞壳中的总酚含量显著低于四川和陕西产的苦荞壳中总酚含量，但麸皮中的总酚平均含量却高于四川产苦荞麸皮中的平均含量，与陕西产苦荞接近。DPPH和ORAC抗氧化性结果均显示,所有苦荞样品麸皮的抗氧化性最高,粉的抗氧化性最低；总的来说，陕西产苦荞的壳、麸皮和粉均具有最高抗氧化性，云南产的苦荞壳和粉的抗氧活性最低，但全谷具有最高的抗氧化活性。【结论】不同产地不同品种苦荞的多酚含量分布及抗氧化活性显著不同，所有样品的DPPH和ORAC抗氧化值均与总酚含量正相关。

基于SSR标记的中美紫花苜蓿品种遗传多样性研究

强海平1, 余国辉1, 刘海泉1, 高洪文1, 刘贵波2, 赵海明2, 王赞1

中国农业科学. 2014, 47(14): 2853-2862. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.14.015

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【目的】紫花苜蓿是世界上最重要的栽培牧草。传统的育种方式对其产量及品质的改良幅度多年来徘徊不前，已经远远不能满足生产需要。对于品种的改良，一方面依赖于所掌握资源的数量，另一方面则是对其农艺性状遗传基础的了解程度。本试验基于SSR分子标记，研究现有中美两国的紫花苜蓿品种遗传变异，分析两国紫花苜蓿种质资源的遗传多样性和群体结构，为利用全基因组关联分析发掘紫花苜蓿重要产量与品质性状显著关联的优异标记、等位位点提供基础，为分子育种提供信息，加快育种进程。【方法】利用覆盖紫花苜蓿全基因组的40对SSR分子标记（每条染色体上选取3-9对SSR标记），采用基于测序的基因型鉴定技术对中美16个紫花苜蓿主栽品种的100个基因型个体（中国每个品种8个基因型个体，美国每个品种4个基因型个体）进行全基因组扫描分析。利用基于混合模型的Structure软件分析紫花苜蓿的群体结构。设定群体数K的估计值范围为1-6，将MCMC（Markov chain monte carlo）开始时的不作数迭代(length of burn-in period）设为10 000次，将不作数迭代后的MCMC设为100 000次，每个K值重复数为10次。采用了两种方法来确定最优的群体数K的值，结果由Structure Harvester和Distruct软件来展示。对Structure群体结构结果进一步用主成分分析和聚类分析进行验证。根据群体结构结果，对全体材料及不同群体进行遗传多样性分析。【结果】40对覆盖紫花苜蓿全基因组的SSR分子标记共检测到446个等位基因，每个位点等位基因范围为3-27个，平均每个位点等位基因数为11.2个；基因多样性的变异范围为0.542-0.908，平均值为0.742；多态信息含量的变异范围为0.493-0.901，平均值为0.707。这些参数显示了中美紫花苜蓿所包含的遗传多样性信息含量较高。其中，mtic238、mtic188、bf111、afctt1、bf641851、maa660456、aw361等位点上表现较高的遗传多样性，表明这些位点可以较好地反映中美紫花苜蓿品种的遗传多样性，适用于中美紫花苜蓿品种的遗传多样性检测。就不同染色体而言，第二条和第八条染色体上分布的SSR标记揭示的遗传多样性较高，而第一条相对较低。基于混合模型的方法对紫花苜蓿全体基因型进行群体结构分析，两种不同方法均显示确定最优的群体数K值为2，中美两国16个紫花苜蓿品种共100个基因型个体基本按照来源分为两个亚群体，群体间有少量混杂的情况发生。主成分分析和聚类分析与群体结构的分析结果相一致。中国紫花苜蓿品种多样性略高于美国，但差异不显著。【结论】中美两国紫花苜蓿材料蕴含了比较丰富的遗传变异，显示了较高水平的基因多样性。中美群体间的遗传多样性水平存在一定的差异，中国紫花苜蓿种质多样性水平略高于美国。群体结构不严格按照来源国家的划分而区分，这一现象与紫花苜蓿异花授粉与广泛的基因交流有着密切的关系。

从蛋白质和转录水平鉴定类猪圆环病毒P1存在ORF2和ORF3

王凤芝1, 2, 温立斌1, 2, 姚火春1, 何孔旺2

中国农业科学. 2014, 47(14): 2863-2871. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.14.016

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【目的】确定类猪圆环病毒P1 存在开放阅读框ORF2 和ORF3；【方法】采用Trizol 法，提取类猪圆环病毒 P1分子克隆转染PK-15细胞的总RNA，纯化之后，分别用P1 ORF2 和 ORF3 特异性引物进行RT-PCR，应用AxyPrepTM DNA 凝胶回收试剂盒回收PCR 产物，转化Trans5α 感受态细胞，挑取单菌落，经PCR检测为阳性后测序。同时，利用rapid-amplification of cDNA ends (RACE) 技术分别扩增P1 病毒 ORF2 和 ORF3 的5′-与3′-末端。另外，根据P1 ORF2 和ORF3 的序列预测其B细胞抗原表位，采用标准的逐步固相合成法合成表位肽，与载体蛋白KLH偶联后，免疫新西兰大白兔制备抗 P1 ORF2 和ORF3 的多克隆抗体。采用常规间接ELISA法检测分离血清效价，包被抗原用合成肽，450 nm 波长下测定，血清抗体效价为S/N ≥2.1的血清最高稀释度。然后，用P1 双拷贝分子克隆转染PK-15细胞，通过免疫组化方法对该多抗与P1 的反应性进行检测，同时利用实时荧光定量PCR方法检测转染细胞中P1 的拷贝数。【结果】利用ORF2和ORF3特异性引物对P1 RNA 进行的RT-PCR，均能扩增出目的片段，回收测序大小分别为111 bp和128 bp，分别与P1 ORF2 和ORF3 进行同源性比较，序列同源性均为100%；RACE技术分析，得到P1 ORF2 的5′-和3′-RACE 末端分别为第11位（G) 和第168位（T)，P1 ORF3 的5′-和3′-RACE 末端分别为第285位（T) 和第 579位（A）。根据预测结果，合成肽的氨基酸序列分别为ORF2：CLSRLPQSERPPGRW和ORF3：CVYPKVRERRVLKMP；用ORF2 和ORF3 表位肽与载体蛋白KLH 的偶联物免疫新西兰大白兔制备的多克隆抗体效价均达到1﹕512 000以上，并且能够与P1 病毒发生特异性显色反应，应用蓝色DAB显色试剂盒染色结果为紫蓝色，多数在细胞浆，少数在细胞核，而对照组细胞无显色反应。定量PCR检测结果显示，P1可以在转染P1双拷贝分子克隆的PK-15细胞中复制，并且转染后104 h 增殖量达最大。【结论】通过转录分析和免疫组化试验分别从转录和蛋白质水平上证实了类猪圆环病毒P1 存在ORF2 和ORF3。

全基因组关联分析鉴别白色杜洛克×二花脸F2资源家系中猪阴囊疝易感基因位点的鉴定

宿英1, 阮国荣2, 龙毅1, 杨斌1, 张志燕1, 邓玮芸1, 吴丽花1, 吕显山1, 艾华水1, 肖石军1, 任军1, 黄路生1, 丁能水1

中国农业科学. 2014, 47(14): 2872-2880. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.14.017

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【目的】通过基于单倍型的病例-对照全基因组关联分析(GWAS)鉴别白色杜洛克×二花脸F2资源家系中影响猪阴囊疝的易感位点及位置功能候选基因，并在远缘纯种猪阴囊疝三联体核心家系（Trio）群体中进行重复验证。【方法】利用Illumina porcine 60K SNP芯片对1 020头白色杜洛克×二花脸F2资源家系阴囊疝群体(包含19个阴囊疝患病个体)进行扫描获取基因型。通过Plink v1.07软件对基因型数据进行质量控制；剔除个体基因型检出率< 90%的个体，剔除SNP位点检出率< 90%、哈迪温伯格平衡卡方检验P≤10-3和最小等位基因频率< 0.05及性染色体上和无法定位的SNP位点。质控合格的SNP位点用PHASEBOOK构建出F2资源家系中每个个体的单倍型，并采用隐马尔可夫模型将其归类到数目预先定义的祖先单倍型中。使用基于广义线性混合模型的GLASCOW软件进行利用祖先单倍型的病例-对照全基因组关联分析。采用保守的Bonferroni校正方法得到基因组显著水平和染色体显著水平的阈值。对F2资源家系中达到染色体显著水平的易感SNP位点在包含237个患病个体的远缘纯种猪阴囊疝三联体核心家系(Trio)群体中进行同样的质控，并利用Haploview软件对质控合格的SNP位点分别展开基于单点和基于单倍型的传递不平衡分析(TDT)，进行重复验证。【结果】白色杜洛克×二花脸F2资源家系中全部个体的38 033个SNP标记通过质控。在GWAS分析中，共发现108个达染色体显著水平(P<2.63×10-5)的猪阴囊疝关联SNP位点，分别位于染色体2、8和17上，最强相关的SNP位点位于17号染色体上。在远缘三联体核心家系群中，724个个体的96个SNP位点通过质控。对质控合格的SNP位点进行基于单点的TDT分析，结果发现5个显著相关的SNP位点得到重复验证(P<0.05)，其中2号染色体上有1个SNP位点和17号染色体上有4个SNP位点，分别位于IQGAP2，CHMP4B，SERINC3，ZNF334 等4个基因内或其上下游。基于单倍型的TDT验证分析发现两个易感单倍型框，其中与基于单点TDT验证分析有重合的仅有SSC17上CHMP4B内及下游的两个易感位点。结合疝气发生机制及TDT分析结果，推测IQGAP2和CHMP4B可能是影响猪阴囊疝发生的两个重要的位置功能候选基因。【结论】本研究利用基于小样本的GWAS分析和较大样本群验证分析，在SSC2和SSC17上分别鉴别1个和4个阴囊疝易感位点，在SSC17上鉴别到两个易感单倍型。易感位点附近的2个基因IQGAP2和CHMP4B可能是影响猪阴囊疝发生的位置功能候选基因，值得进一步研究。

水稻卷叶突变体rl15(t)的生理学分析及基因定位

张礼霞, 刘合芹, 于新, 王林友, 范宏环, 金庆生, 王建军

中国农业科学. 2014, 47(14): 2881-2888. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.14.018

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【目的】对环境诱导卷叶突变体开展生理学特性分析，并对候选的突变基因开展初步定位，为下一步的基因克隆与功能分析提供研究基础。【方法】用60Coγ射线诱变粳稻品种日本晴（Nipponbare）种子，发现了一份叶片在晴朗天的正午时分高度内卷的突变体，命名为rl15(t)（rolled leaf 15）。通过田间种植鉴定，对该突变体进行表型观察及主要农艺性状调查。采用不同温度和相对湿度处理rl15(t)和野生型，以揭示影响突变体叶片卷曲的环境因素。试验设置3个处理温度（24℃、29℃、34℃）和2个相对湿度（RH=60%或95%），在人工气候箱处理抽穗期的rl15(t)和野生型，以处理1.5 h后的剑叶测定叶片卷曲度（RLI）。自清晨6:00时至下午18:00时，每隔2 h用便携式气体交换系统Li-6400测定rl15(t)和野生型剑叶的净光合速率（Pn）、蒸腾速率（Tr）和气孔导度（Gs）等指标，同时用WP4露点水势仪测定剑叶的叶片水势，分析并比较突变体和野生型的上述生理表现的异同。将rl15(t)与野生型日本晴杂交，观察F1植株和F2群体的叶片表型，对F2表型分离进行χ2测验，分析突变体的遗传行为。以rl15(t)×珍汕97B的F2群体为材料，利用BSA法对候选基因进行定位。【结果】与野生型亲本日本晴相比，rl15(t)突变体植株变矮、分蘖减少、穗长变短、籽粒变小、生育期延迟；rl15(t)突变体叶片短窄且在阴雨天气或晴天的清晨和黄昏时表现为正常的平展或轻微内卷，但在晴朗天的正午时分表现高度内卷。温度和湿度梯度处理试验表明，rl15(t)突变体叶片卷曲行为受环境诱导，湿度是诱导突变体叶片卷曲的主要因素，高温可促进该表型的表现。rl15(t)突变体剑叶的净光合速率、蒸腾速率和气孔导度等光合参数以及叶片水势在清晨和黄昏同野生型亲本较接近，但在正午时分均显著低于野生型；而rl15(t)突变体剑叶的水分利用效率（WUE）在清晨、正午时分和黄昏与野生型接近，但在其他时段显著高于野生型。rl15(t)与野生型亲本日本晴的F1表现叶片正常的平展，F2群体中平展叶与卷叶表型株符合3﹕1分离比，表明rl15(t)突变体的卷叶突变性状受1对隐性核基因控制。RL15(t)初步定位于水稻第10染色体长臂端SSR标记RM25302和RM25343之间，与两标记的遗传距离分别为0.8和2.0 cM。【结论】突变体rl15(t)的卷叶表型是受环境诱导的，候选基因定位于SSR标记RM25302和RM25343之间，该区段内未见同类表型基因的报道，推测RL15(t)可能是一个新的卷叶调控基因。

玉米受伤诱导基因Wip1的启动子克隆及表达分析

练云1, 2, 刘允军1, 王国英1

中国农业科学. 2014, 47(14): 2889-2896. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.14.019

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【Objective】 Protease inhibitor is an important defense protein in plant for resistance to infection or feeding by pathogen and animals. Maize Wip1(wound-induced protein) is the member of Bowman-Birk inhibitor(BBI) gene family. To provide new information for the application of resistance gene to insect in plant, this experiment was designated to understand the activity of Wip1 promoter, assay spatial and temporal expression of Wip1 gene and its response to phytohormones and abiotic stresses.【Method】A clone containing the upstream region of Wip1 was isolated and sequenced from maize leaf cDNA. The promoter sequences of Wip1 gene was inserted into binary expression vector p1300 to produce recombinant plasmids p1300-Wip1-GUS, which was transferred into Agrobacterium LBA4404 by freeze thawing method. Functional analysis of the promoter was conducted through heterologous expression in maize callus by agro-infiltration method. Total RNA was isolated from maize tissues using hot phenol method. Purified RNA was subjected to formaldehyde-containing-agarose gel, blotted onto a nylon membrane, and Northern blotting was performed with [α-32P] dCTP-labeled probe to characterized tissue-speci?c location, phytohormones and abiotic stresses analysis of Wip1. 【Result】 Promoter region was 1 737 bp and coding sequence was 512 bp. The result showed that GUS activity driven by the Wip1 promoter was detected in maize callus tissues after infection by Agrobacterium haboring recombinant plasmids p1300-Wip1-GUS. The expression of Wip1 was assayed at various developmental stages. Northern blotting showed that Wip1 gene abundantly expressed in injured coleoptile, root, stem, leaf, ear, tassel, silk and husk, while expressed little in uninjured coleoptile and not expressed in other uninjured detection tissues. The results also showed that Wip1 was not affected by submergence, cold, dehydration, PEG, ABA, NaCl and IAA treatments. The dynamic expression of Wip1 gene under injure stress from 0 h to 24 h with 8 time points, was analyzed in maize leaf tissue. Wip1 gene was detected after stressing for 2 h, the expression level increased rapidly, and with a continually increasing trend from 4 h to 24 h. 【Conclusion】 Wip1 gene is induced by injure-specific stress. Wip1 promoter is an effective injure-specific promoter to express the desired genes in plants.

荔枝果肉酚类物质大孔树脂分离纯化工艺优化

苏东晓1, 2, 张瑞芬1, 张名位1, 黄菲1, 2, 魏振承1, 张雁1, 遆慧慧1, 邓媛元1, 唐小俊1

中国农业科学. 2014, 47(14): 2897-2906. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.14.020

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【目的】荔枝是热带亚热带地区重要水果，其果肉中含有丰富的酚类物质。其果肉粗提物具有良好的抗氧化、抗辐射和护肝活性。筛选对荔枝果肉酚类物质具有良好吸附、解吸性能的树脂，并优化分离工艺参数，为建立荔枝果肉多酚分离纯化工艺和鉴定荔枝果肉多酚结构提供理论依据。【方法】比较11种不同极性大孔树脂（HPD-200A、HPD-400A、HPD-100、HPD-500、HPD-600、HPD-722、HPD-826、D4020、NKA-II、NKA-9和AB-8）对新鲜荔枝果肉预冷80%丙酮/水酚类提取物中总酚、总黄酮的静态吸附和解吸性能，筛选分离荔枝果肉总酚和总黄酮均最佳的大孔树脂，考察其静态吸附动力学曲线，优化不同样液浓度（3.2、1.6、0.8和0.4 mg•mL-1）和不同上样流速（4.5、3.0和1.5 BV/h）动态吸附以及不同体积分数洗脱液乙醇浓度（95%、80%和60%）解吸工艺参数；通过与14种酚类物质标准品（儿茶素、没食子酸、绿原酸、香草酸、丁香酸、咖啡酸、表儿茶素、阿魏酸、四甲基邻苯二酚、香豆素、芦丁、槲皮素、白藜芦醇和槲皮素-3-O-芸香糖-7-O-鼠李糖）HPLC保留时间相比较的方法对所得组分酚类物质种类及其含量进行分析。【结果】HPD-826大孔树脂静态吸附和解吸荔枝果肉总酚和总黄酮的效果均较其它树脂好，其静态吸附4 h即可达到吸附饱和，吸附和解吸工艺参数为：荔枝果肉酚类提取物上样浓度0.8 mg•mL-1，上样速度3.0 BV/h，95%乙醇溶液作为洗脱剂，洗脱流速3.0 BV/h。经HPLC分析和鉴定，HPD-826分离纯化荔枝果肉酚类不会造成单体酚组成变化和明显损失（单体酚含量下降15%左右）；荔枝果肉酚类物质主要由3,4二羟基苯甲酸、儿茶素、香草酸、咖啡酸、丁香酸、表儿茶素、槲皮素-3-O-芸香糖-7-O-鼠李糖苷、阿魏酸和芦丁等9种单体组成，其中含量较高的依次是槲皮素-3-O-芸香糖-7-O-鼠李糖苷、芦丁和表儿茶素，三者合计占总量的94.37%。【结论】HPD-826型大孔树脂对荔枝果肉总酚和总黄酮有较好的分离纯化效果。

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