中国农业科学

水稻P450基因Oscyp71Z2增强稻瘟病抗性的机制

李文奇1, 王芳权1, 王军1, 范方军1, 朱金燕1, 杨杰1, 邵敏2, 仲维功1

中国农业科学. 2014, 47(13): 2485-2493. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.13.001

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【目的】分析水稻细胞色素P450基因Oscyp71Z2在稻瘟病抗性中的作用，并解析其介导的水稻抗稻瘟病机制。【方法】根据高抗稻瘟病转hrf1水稻NJH12表达谱结果，筛选到一个表达量高达114.6倍的细胞色素P450基因Oscyp71Z2（NCBI登录号：Os07g0217600）。根据Oscyp71Z2全长编码区序列设计引物，以水稻模式粳稻品种日本晴的cDNA为模板，通过PCR扩增Oscyp71Z2全长编码区序列。将所得的cDNA序列经测序后，与双元表达载体pVec8连接，构建超量表达载体pVec8::Oscyp71Z2。采用冻融法将构建的超量表达载体pVec8::Oscyp71Z2质粒转入农杆菌菌株EHA105，并利用农杆菌转化法获得Oscyp71Z2超表达水稻。常规PCR技术检测T4代Oscyp71Z2超量表达水稻中选择标记基因潮霉素磷酸转移酶编码基因（hygromycin phosphotransferase gene，hph），并通过qRT-PCR检测超量表达水稻中目的基因Oscyp71Z2的表达量。进一步对阳性超量表达水稻（T4、T5和T6）进行稻瘟病表型鉴定，并检测植保素含量变化（T4）。【结果】RT-PCR和qRT-PCR结果显示，水稻细胞色素P450基因Oscyp71Z2在高抗稻瘟病的转hrf1水稻中有较高的表达，与表达谱数据一致。通过生物信息学分析Oscyp71Z2全长1 554 bp，含有2个细胞色素P450保守结构域，是CYP71Z2亚家族成员。将Oscyp71Z2成功连接到双元载体pVec8，利用农杆菌介导法获得Oscyp71Z2超量表达水稻。超量表达水稻株系在各生育期、株高等性状，与非转基因水稻日本晴基本一致。超量表达株系中Oscyp71Z2的表达量较野生型有显著升高。超量表达水稻的穗颈瘟抗性等级维持在1—2级，表现为抗病或者中抗，而野生型水稻的穗颈瘟等级为3—4级，表现为感病，Oscyp71Z2在水稻中超量表达显著增强了对穗颈瘟的抗性。Oscyp71Z2超量表达株系每克新鲜叶片中植保素MA和PB含量平均是328和124 ng，相对于野生型的85和42 ng•g-1新鲜叶片有显著升高。Oscyp71Z2超量表达株系中涉及到植保素MA和PB合成通路的4个关键基因的表达量较野生型有显著地升高。【结论】水稻细胞色素P450基因Oscyp71Z2通过调控植保素生物合成通路，赋予水稻稻瘟病抗性。

小麦蛋白激酶TaMAPK2互作蛋白的筛选与验证

于太飞1, 2, 徐兆师2, 李盼松2, 陈明2, 李连城2, 张俊华1, 马有志2

中国农业科学. 2014, 47(13): 2494-2503. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.13.002

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【目的】利用构建的干旱胁迫处理的小麦cDNA文库，通过酵母双杂系统筛选与小麦TaMAPK2互作的蛋白，并对其进行验证分析。【方法】以小麦cDNA为模板克隆得到TaMAPK2，构建pGBKT7-TaMAPK2诱饵载体，将诱饵载体pGBKT7-TaMAPK2质粒以及pGADT7和小麦cDNA文库共转化酵母AH109菌株感受态细胞，在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade营养缺陷型培养基上30℃培养3—5 d，挑选单克隆于YPDA培养基中培养，吸取1 μL各候选克隆的菌液点至于SD/Raf/Gal/x-gal平板上培养，筛选蓝色单克隆。将筛出的单克隆经测序、序列比对分析，初步获得与TaMAPK2互作的候选蛋白。采用双酶切的方法构建pGADT7-HSP90以及pSPYNE-TaMAPK2和pSPYCE-HSP90双分子荧光互补表达载体，将重组载体质粒pGADT7-HSP90和pGBKT7-TaMAPK2共转化AH109酵母感受态细胞，利用酵母双杂交的方法验证TaMAPK2与候选蛋白HSP90的相互作用；采用PEG-Ca2+介导法将双分子荧光互补表达载体pSPYNE-TaMAPK2和pSPYCE-HSP90共转化小麦原生质体细胞，激光共聚焦显微镜下观察相互作用产生的YFP荧光信号。根据HSP90的保守序列设计特异引物，在SYBR Green Ⅰ的检测模式基础上，构建HSP90的实时荧光定量PCR检测体系，检测HSP90在不同胁迫处理以及不同组织的小麦植株中的表达量。【结果】通过对候选蛋白的初步分析表明这些候选蛋白主要参与植物体的信号转导或免疫过程，表明TaMAPK2在植物的逆境信号转导、基因转录调控过程中发挥着重要作用。通过酵母双杂交显蓝系统和双分子荧光互补技术（BiFc）进一步确认HSP90与TaMAPK2的互作关系。HSP90定位在细胞核、细胞膜以及细胞质中，且在植物的根茎叶中均有表达，在根中的表达量最高。通过实时荧光定量PCR分析显示，HSP90基因受到高温、低温、高盐和ABA胁迫后表达量上调。【结论】HSP90作为分子伴侣，在降解这些受损或异常蛋白以及调控抗逆相关转录因子表达的过程中发挥着重要的作用。非生物胁迫会引起植物体内一些受损或异常蛋白聚合物的积累，HSP90能通过折叠已损坏的蛋白底物以及构象的维持来保持细胞的完整性。表明在植物逆境信号转导过程中，TaMAPK2功能的发挥可能需要HSP90蛋白的参与。

参与农杆菌侵染及T-DNA转运过程植物蛋白的研究进展和思考

赵佩, 王轲, 张伟, 杜丽璞, 叶兴国

中国农业科学. 2014, 47(13): 2504-2518. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.13.003

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农杆菌是一种革兰氏阴性土壤病原细菌，携带具有天然转基因功能的Ti质粒或Ri质粒，能将一部分遗传物质插入到寄主植物的染色体上，使其稳定遗传和表达，赋予植物新的性状。所以农杆菌作为最有效的转化媒介，已被广泛应用于多数双子叶植物和部分单子叶植物转基因研究。虽然农杆菌介导的转化技术具有操作简单、成本低廉，转基因沉默几率小，插入基因拷贝数少等优点，但农杆菌介导植物遗传转化是一个复杂的生物学过程，需要一系列农杆菌蛋白和植物蛋白相互作用，共同完成外源基因的转入和整合。植物相关蛋白在转化过程中起着重要作用。其中，阿拉伯半乳聚糖蛋白(AGP)、植物根钙粘附蛋白和类玻连蛋白等参与农杆菌附着于植物细胞表面的过程；鸟苷三磷酸腺苷酶（GTPase）和BTI蛋白协助T-DNA和Vir效应蛋白进入植物细胞；actin、GIP、VIP等蛋白参与T-DNA复合体在细胞质中的运输的过程；与Vir效应蛋白互作的VIP1、VIP2、KAPa、PP2C、Roc等蛋白协助T-DNA定位于植物细胞核；组蛋白、VIP1和VIP2等引导T-DNA在植物基因组上的整合。由于植物种类间存在巨大差异，上述一些植物蛋白基因的过表达虽能提高农杆菌转化某些植物的转化效率，但不能提高另一些植物的转化效率。在容易被农杆菌遗传转化的植物如拟南芥、水稻中的研究表明，VIP1、VIP2、AGP、H2A等蛋白与农杆菌转化关系密切，但这些蛋白在利用农杆菌转化较难的作物如小麦、玉米中的功能还不明确，因而需要在不同植物中继续筛选和鉴定与T-DNA转化相关重要蛋白的编码基因。目前，农杆菌介导的植物遗传转化有2个显著特点，一是农杆菌介导转化烟草、拟南芥、水稻等模式植物的技术日渐成熟，二是农杆菌介导转化小麦、玉米、大豆等重要作物的技术仍然没有本质突破，植物相关蛋白在T-DNA转运、整合等过程中的作用还需要深入研究和进一步明确。文章主要对参与农杆菌介导遗传转化植物整个过程中相关植物蛋白的研究进展进行了综述，以期为提高农杆菌转化顽拗型作物的转化效率提供参考。

一个矮秆多分蘖水稻突变体的植物激素动态特性分析

刘清1, 童建华1, 史齐1, 彭克勤1, 王若仲1, 蔺万煌1, MohammedHumayunKabir1, 沈革志2, 萧浪涛1

中国农业科学. 2014, 47(13): 2519-2528. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.13.004

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【目的】比较水稻矮秆多分蘖突变体与野生型材料间的植物激素含量差异，并分析不同生长调节剂处理对其株高、分蘖的影响，探析植物激素在突变体形态发育过程中的生理功能。【方法】以T-DNA插入引起的矮秆多分蘖突变体（CA648）及对照中花11（ZH11）为供试材料，采用高效液相色谱法（HPLC）分析三叶期、五叶期、分蘖盛期、拔节孕穗期的根、假茎(或茎)、叶中的赤霉素（GA1，GA4）、生长素（IAA）、玉米素（Z）和脱落酸（ABA）的含量，进行CA648与ZH11在不同生长发育时期的不同器官中的植物激素含量差异比较分析；利用液相色谱-串联质谱联用法（HPLC-MS/MS）测定拔节孕穗期根、基部、茎秆及叶片中的IAA、Z及玉米素核苷（ZR）的含量并进行根、茎、叶等不同器官中IAA与Z+ZR含量间的比值差异分析；在CA648与ZH11的不同生长发育时期喷施不同浓度的GA3、IAA、Z及多效唑处理后统计株高、分蘖的变化特性，并比较分析CA648与ZH11对不同生长调节剂处理的反应敏感性差异。【结果】不同生长发育时期的CA648与ZH11的不同器官中的植物激素存在不同变化趋势。GA1+4含量变化情况为在三叶期和五叶期的叶片中两者相差不大，而根和假茎中的含量则是CA648高于ZH11；从五叶期至拔节期，随着生育期延长，ZH11的假茎和根中GA1+4含量升高而叶片中含量降低，但CA648却表现出相反的变化趋势，假茎和根中的GA1+4含量降低但叶片中含量却升高。IAA含量变化情况为五叶期、分蘖盛期时CA648叶片中的IAA含量低于ZH11，而假茎中的IAA含量却高于ZH11；拔节期时，CA648的根、茎、叶中IAA含量均与ZH11对应器官中的IAA含量相差不大。Z、ZR含量变化情况为三叶期CA648的根与假茎中的Z含量都低于ZH11；在拔节期，分蘖部位的基部和茎中的Z+ZR含量为CA648高于ZH11，而叶片中的Z+ZR含量却是CA648略低于ZH11。ABA含量变化情况为在三叶期、五叶期时CA648的ABA含量高于ZH11，而拔节期却显著低于ZH11。IAA与Z+ZR的比值情况为在顶叶、茎秆中是CA648大于ZH11，而在基部和根中则是CA648中的比值小于ZH11。不同浓度GA3、IAA、Z和多效唑喷施处理表明CA648的株高易受生长调节剂的影响。与喷水对照相比，喷施GA3、IAA、Z均能增加CA648的株高，其敏感性依次为GA3处理＞IAA处理＞Z处理；喷施多效唑后CA648与ZH11的株高均明显降低；虽然CA648与ZH11的株高均受GA3、多效唑等生长调节剂的影响，但CA648更敏感，当喷施的GA3浓度≥288 µmol•L-1时，CA648的株高能够达到或超过ZH11的株高；与株高易受生长调节剂的影响不同，CA648的多分蘖特性几乎不受长调节剂处理的影响，无论是否喷施生长调节剂，CA648的分蘖数均远远多于ZH11。【结论】与对照相比，CA648体内的GA1、GA4、IAA、Z、ZR含量及其IAA与Z+ZR的比值有利于矮秆多分蘖性状的形成，即植物激素含量与比例能够反映CA648的生理特性；生长调节剂对CA648的分蘖与株高具有不同调控效果，喷施GA3、IAA、Z和多效唑能够显著改变株高，但其多分蘖特性不受株高改变的影响。

籼稻与粳稻花时对茉莉酸甲酯（MeJA）响应的敏感性差异

闫志强1, 徐海1, 马作斌1, 2, 高东昌1, 徐正进1

中国农业科学. 2014, 47(13): 2529-2540. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.13.005

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【目的】籼粳稻杂交可产生明显的杂种优势，是培育高产多抗品种的主要途径，但是籼稻花时早，粳稻花时晚，两者花时不遇的困难直接影响籼粳间杂种优势的充分利用。喷施茉莉酸甲酯（MeJA）可有效促进水稻花时提前，本文旨在研究MeJA对籼粳稻花时性状的调控效果及其敏感性差异，为亚种间杂交稻制种产量的提高和籼粳稻杂种优势的直接利用提供理论依据。【方法】以6个籼稻和6个粳稻品种为试材，2012年和2013年分别种植于沈阳农业大学水稻研究所试验田。试验按随机区组设计，3次重复。于调查花时性状的前一日17：00、当日6：00及8：00分别喷施0.04、0.4和4 mmol•L-1浓度的MeJA，调查始花时、盛花时、终花时。花时的判断标准以一天中稻穗上第一朵颖花开放的时间作为始花时，以一天中颖花开放最多且最集中的时间作为盛花时，以所有颖花都关闭的时间作为终花时，并计算始花至盛花的持续时间（简写为始－盛时间）、盛花至终花的持续时间（简写为盛－终时间）、始花至终花的持续时间（简写为始－终时间）。【结果】对于6个籼稻品种，喷施上述3种浓度的MeJA都能极显著地促进颖花提前开放，且不同浓度处理之间未见显著差异，与对照相比差异达极显著水平；对于6个粳稻品种，喷施高浓度（4 mmol•L-1）与中浓度（0.4 mmol•L-1）的MeJA可极显著促进花时提前，且高浓度与中浓度MeJA处理之间有极显著差异，喷施低浓度（0.04 mmol•L-1）的MeJA处理与对照相比差异不显著。籼粳稻的始－盛时间，盛－终时间在喷施不同浓度MeJA处理下与对照相比并未表现出明显的规律，但喷施不同浓度的MeJA都能极显著延长籼稻开花持续时间（始－终时间），而对粳稻的影响不明显。对于籼稻品种，不同时间喷施MeJA处理之间的花时性状没有显著差异；对于粳稻品种，前日17：00与当日6：00的处理与当日8：00处理间的始花时差异显著。进一步比较了MeJA对籼粳稻开花促进程度上的差异，喷施高浓度（4 mmol•L-1）的MeJA对籼粳稻开花的促进程度没有显著差异，而低浓度（0.04 mmol•L-1）和中浓度（0.4 mmol•L-1）的处理对籼稻开花的提前程度明显高于粳稻。【结论】MeJA确能显著促进籼粳稻的开花，籼稻对MeJA调控的敏感性强于粳稻。籼稻不仅能够响应高浓度的MeJA（4 mmol•L-1）也能响应低浓度的MeJA（0.04 mmol•L-1），而粳稻只能响应较高浓度的MeJA（4 mmol•L-1 , 0.4 mmol•L-1）。籼稻对MeJA调控响应所需的时间较短，而粳稻对MeJA调控响应所需的时间较长。促进粳稻品种开花的最优组合是前日17：00喷施4 mmol•L-1的MeJA，对籼稻品种，促进花时提前的最优组合因具体品种而异，以0.04 mmol•L-1的MeJA于早晨喷施最为经济有效。

北方旱寒区冬油菜种植气候适宜性研究

周冬梅1, 张仁陟1, 2, 孙万仓2, 3, 张军1, 2, 王鹤龄4

中国农业科学. 2014, 47(13): 2541-2551. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.13.006

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【目的】分析北方旱寒区冬油菜种植分布和气候条件之间的关系，确定影响冬油菜种植分布的主要气候因子，在区域尺度上划分冬油菜种植气候适宜性区域，为改进冬油菜生产布局，合理调整农业生产结构和种植布局提供参考依据。【方法】利用多年不同油菜品种地理分期播种试验数据和长序列气候数据，筛选影响冬油菜种植分布的潜在气候因子，采用基于DEM的小网格推算法建立潜在气象因子空间数据库，并在此基础上利用MaxEnt模型分析北方旱寒区冬油菜种植分布与气候条件的关系，确定影响北方旱寒区冬油菜种植分布的主要气象因子，模拟北方旱寒区冬油菜的潜在空间分布概率，并划分北方旱寒区冬油菜种植气候适宜性区域。【结果】潜在气象因子对冬油菜种植分布的总贡献率达到0.89，按贡献率大小确定影响北方旱寒区冬油菜种植分布的主要气候因子包括：年平均温度、负积温、极端低温、最冷月最低温度、最冷月平均温度；冬油菜在北方旱寒区潜在分布概率为0—0.84，按其分布概率将北方旱寒区冬油菜种植区域划分为4个等级：不适宜种植区域、次适宜种植区域、适宜种植区域和最适宜种植区域；冬油菜种植北界，大抵以吉林南部、内蒙古南部、新疆南部为界限，与传统冬油菜种植北界相比较，向北推进了1 200 km，纬度由39°N提升到45°N。【结论】北方旱寒区超过50%的地区都可以种植冬油菜，冬油菜种植区北移是可行的，且具有很大的扩展潜力，冬油菜将成为北方旱寒区重要的油料作物。这将突破原有传统的冬油菜种植区划，改变冬油菜生产的布局结构。

稻曲病菌致病力丧失突变菌株B-1015的T-DNA标记基因的克隆

黄磊1, 2, 胡建坤2, 俞咪娜2, 于俊杰2, 王亚会2, 郑梦婷2, 郑睿2, 刘永锋1, 2

中国农业科学. 2014, 47(13): 2552-2562. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.13.007

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【目的】研究稻曲病菌（Ustilaginoidea virens）致病力丧失突变菌株B-1015，克隆和分析T-DNA插入位点的侧翼序列，为稻曲病菌的致病机制研究提供参考。【方法】分析稻曲病菌T-DNA插入突变体B-1015菌株的生长速率、产孢量、孢子萌发率以及致病力等生物学表型。用PCR检测T-DNA在B-1015基因组中插入的稳定性，用Southern杂交检测T-DNA插入的拷贝数，用hiTail-PCR扩增T-DNA侧翼序列，用RACE PCR克隆T-DNA标记基因，半定量RT-PCR分析所克隆基因的表达情况。【结果】与野生菌株P1相比，突变菌株B-1015的生长速率和产孢量都有较明显的降低，孢子萌发率无明显差异，致病力丧失。分子检测结果表明T-DNA在B-1015基因组中为稳定的单拷贝插入。hiTail-PCR得到的T-DNA两端侧翼序列在野生型菌株基因组上不相连，RACE PCR在两边的侧翼序列上分别克隆得到Uvt-1015R和Uvt-1015L。预测分析表明Uvt-1015R包含一个长度为948 bp的开放阅读框（open reading frame finder，ORF），可编码295个氨基酸，5′端非编码区（5′-untranslated regions，5′-UTR）长度为 341 bp，3′端非编码区（3′-untranslated regions，3′-UTR）长度为271 bp。Uvt-1015L包含一个长度为351 bp的ORF，可编码116个氨基酸，5′-UTR为31 bp，3′-UTR长度为174 bp。在已知功能的蛋白中检索，没有发现与Uvt-1015R和Uvt-1015L基因同源的蛋白。序列分析发现T-DNA插入在两个基因序列中间，RT-PCR结果显示，在突变菌株B-1015中，Uvt-1015R表达量下降，Uvt-1015L不表达。【结论】稻曲病菌突变菌株B-1015致病力等重要生物学表型发生改变，可能是由于T-DNA的插入导致了B-1015基因组重排和Uvt-1015R、Uvt-1015L基因结构的破坏。

水稻白叶枯病菌毒性表达的负调控因子PXO_02944的分子鉴定

李潇桐, 杨凤环, 梁士敏, 田芳, 陈华民, 何晨阳

中国农业科学. 2014, 47(13): 2563-2570. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.13.008

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【目的】水稻黄单胞水稻致病变种（Xanthomonas oryzae pv. oryzae, 简称Xoo）侵染引起水稻白叶枯病，在侵染过程中Xoo可产生胞外多糖(EPS)、胞外酶、黏附因子、T3SS以及其产生的效应因子等毒性因子。细菌第二信使环鸟苷二磷酸（c-di-GMP）的水平在Xoo毒性调控中发挥了重要的作用，而PXO_02944是包含REC、GGDEF和EAL结构域的蛋白，是c-di-GMP信号蛋白家族的成员，研究旨在阐明水稻白叶枯病菌的环鸟苷二磷酸信号蛋白家族成员PXO_02944的基因结构和功能。【方法】根据PXO_02944基因序列信息，以PXO99A基因组DNA为模板，设计引物扩增PXO_02944基因全长，将其GGDEF结构域和EAL结构域分别与已经报道的保守的GGDEF结构域或EAL结构域蛋白进行氨基酸序列比对分析；分别扩增PXO_02944左右臂片段，将其与目的载体pK18mobsacB载体连接，得到质粒pK2944，将pK2944与pMD-GmR载体回收获得的GmR基因片段进行连接，获得重组质粒pK2944-GmR，用于构建基因突变体。将PXO_02944全长基因克隆到载体pHM1上，获得重组质粒pHM1-2944并转化到ΔPXO_02944中，即获得互补菌株ΔPXO_02944::C。对野生型菌株、突变体和互补菌株进行表型测定，分析PXO_02944 基因缺失突变对Xoo致病性和EPS产生、生物膜形成、胞外酶活性和鞭毛运动性的影响，并通过qRT-PCR方法测定EPS合成基因和毒性相关基因的表达。【结果】用特异性引物进行PCR扩增，成功地从野生型菌株PXO99A中克隆了PXO_02944；生物信息学分析发现，PXO_02944蛋白具有磷酸化信号接收的REC输入结构域和GGDEF、EAL输出结构域，但GGDEF和EAL结构域保守序列发生了突变。与野生型菌株PXO99A相比，虽然PXO_02944突变体胞外纤维素酶和木聚糖酶活性、鞭毛运动性都无明显变化, 但其对水稻的致病性、EPS产生和生物膜形成能力显著增强，T3SS调控基因hrpG和EPS合成基因gumG的转录水平也明显升高。【结论】应答调控因子PXO_02944负调控了水稻白叶枯病菌致病性、EPS产生和生物膜形成这些毒性因子的表达。

β-氨基丁酸诱导马铃薯对晚疫病的抗性组织化学及信号传导途径分析

王静, 王海霞, 田振东

中国农业科学. 2014, 47(13): 2571-2579. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.13.009

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【目的】β-氨基丁酸（BABA）田间或离体叶片喷洒能够有效诱导马铃薯防卫反应，增强对晚疫病的抗性。研究从组织化学层面进一步探究BABA诱导马铃薯晚疫病抗性过程中诱发的防卫反应及相关信号途径，为深入研究BABA诱导马铃薯产生晚疫病抗性的可能机制奠定基础。【方法】用4 mmol?L-1 BABA或蒸馏水（对照，Mock）喷洒马铃薯植株叶片，3 d后取离体叶片接种晚疫病菌（Phytophthora infestans），接种后不同时间用打孔器取接种点叶盘用于织化学染色和过敏反应（HR）观察。采用二氨基联苯胺（DAB）组织化学染色方法检测接种点周围活性氧（H2O2）累积情况；叶盘用苯胺蓝（aniline blue）染色，然后在荧光显微镜下观察接种点周围胼胝质积累和表皮细胞HR发生情况；利用干涉了StCOI1（阻断了茉莉酸JA信号传导途径）和超量表达细菌水杨酸羟化酶基因NahG（阻断了水杨酸SA信号传导途径）的转基因马铃薯株系为材料，通过研究BABA能否在这些特殊马铃薯材料上有效诱导晚疫病抗性，进而推断BABA诱导马铃薯晚疫病抗性可能参与的信号途径。【结果】用清水作为空白接种时，Mock和BABA预处理叶片各时间点均未观察到H2O2积累，而病原菌接种处理24 h后，Mock和BABA预处理叶片接种点周围都出现H2O2积累，随着病原诱导时间的延长，H2O2积累增强。但是，BABA预处理叶盘中接种点周围H2O2累积比对照提前12 h，且累积量显著强于对照。苯胺蓝染显示Mock和BABA预处理叶片在接种清水时检测不到胼胝质的沉积，而接种晚疫病菌24 h后，Mock和BABA预处理叶片上均观察到胼胝质的沉积，BABA预处理叶片在侵染点及其附近胼胝质积累量要显著高于对照。荧光显微观察结果显示，BABA预处理和Mock叶片晚疫病接种点周围表皮细胞均有HR发生，BABA预处理叶片早在接种24 h后，接种点周围就已出现HR反应；接种48 h时，BABA预处理85%叶盘的接种点周围表皮细胞出现HR，而Mock叶片只有30%叶盘上观察到HR，BABA预处理叶片HR发生频率比Mock叶片高出55%。BABA不能在超量表达NahG的马铃薯叶片上有效诱发抗性，但能够在干涉了StCOI1的马铃薯叶片上正常诱导产生抗性。【结论】BABA能够从H2O2和胼胝质累积以及HR发生多个层面有效诱发马铃薯基础防御反应，BABA预处理能够在病原菌侵染点周围显著提高胼胝质和H2O2积累水平，诱发接种点发生较高频率的HR，从而提高马铃薯对晚疫病的抗性；BABA诱导马铃薯对晚疫病的抗性依赖水杨酸信号传导途径，但不依赖茉莉酸信号传导途径。

长期施肥下淮北砂姜黑土区小麦产量稳定性研究

陈欢1, 曹承富1, 孔令聪1, 张存岭2, 李玮1, 乔玉强1, 杜世州1, 赵竹1

中国农业科学. 2014, 47(13): 2580-2590. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.13.010

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【目的】分析长期施肥条件下小麦产量的变化规律，试图探明淮北小麦产量稳定性对不同施肥模式的响应机制，为淮北砂姜黑土合理施肥管理、改善农田生态系统质量提供依据。【方法】以安徽杨柳长期定位试验为研究平台，通过研究小麦的平均产量、产量年际波动及土壤养分状况对5种施肥模式（不施肥、单施化肥、单施有机肥、有机肥与化肥配施（等氮）、有机肥与化肥配施（高氮））的响应，比较不同施肥条件下淮北砂姜黑土区小麦产量稳定性的优劣，并以此评判施肥的合理性。【结果】淮北砂姜黑土区长期不施肥的小麦产量总体呈下降趋势，年下降量为5.81 kg•hm-2；而长期施肥的小麦产量随时间呈锯齿状波动并总体上升的趋势，其中有机肥与化肥配施（高氮）处理（HMNPK）的产量趋势线最高，但其增产优势逐年减弱，有机肥与化肥配施（等氮）处理（MNPK）以9.75 kg•hm-2的年增长量缩短与其的差距；单施化肥处理（NPK）的小麦产量趋势线在试验前期高于单施有机肥（M），但在22年后有被M处理赶超的趋势。从32年小麦平均产量来看，与不施肥相比，有机肥与化肥配施（高氮与等氮）的增产幅度最大，平均产量分别达5 544.3和5 200.6 kg•hm-2；NPK次之，比当年不施肥处理产量提高了614.6%，M增产幅度最低，但与NPK差异并不明显。砂姜黑土地力贡献率在试验前10年持续降低，降至10%左右趋于稳定，而肥料对小麦产量的贡献率则是在前10年持续增加至80%—90%便维持动态平衡。长期不施肥易导致小麦产量变异系数（CV）偏高、可持续性产量指数（SYI）偏低，产量稳定性最低；施肥处理中HMNPK和MNPK处理的CV最低、SYI最高，产量稳定性最高，而M处理的产量稳定性和可持续性不及NPK。与长期不施肥相比，施肥可明显提高淮北砂姜黑土全氮、有机质、有效磷和速效钾的含量，其中有机肥的施入显著提高了土壤全氮和有机质含量，而有效磷含量与化肥的投入相关，处理M土壤速效钾含量较高，但与其他施肥处理差异不显著；通过相关性分析可知全氮、有机质、有效磷含量与小麦产量呈极显著正相关关系（P＜0.01）。【结论】施肥可有效提高淮北小麦产量，且产量随时间呈锯齿状波动；有机肥与化肥配施（高氮和等氮）的增产效果最佳，但高氮与等氮水平间的产量差随种植年限的增长而逐渐缩短；在试验开始前一阶段单施化肥的增产效果优于单施有机肥处理，但在22年后有被赶超的趋势。与长期不施肥相比，有机肥与化肥配施的施肥模式更有利于促进小麦产量稳定性和生产可持续性的提高，其次为单施化肥，单施有机肥最低。施肥可有效提高砂姜黑土养分含量，其中有机肥对有机质、全氮及速效钾含量的提高作用较强，而化肥则对有效磷含量提高作用较强，且小麦产量与全氮、有机质和有效磷均呈极显著正相关关系。因此，安徽淮北砂姜黑土区有机肥与化肥配施为最佳施肥模式，土壤养分供应较均衡，小麦产量幅度最大且稳定性最佳，农田生态系统质量最优。

基于分形理论和地质统计学的表层土壤颗粒大小分布变化特征

张世文1, 2, 张立平2, 袁君3, 沈重阳2, 陈孝杨1, 叶回春2, 黄元仿2

中国农业科学. 2014, 47(13): 2591-2601. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.13.011

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【目的】探究多角度、多尺度全面揭示土壤颗粒大小分布特征的方法体系，探索更加简单而又可综合定量分析评价土壤质量及其演变过程的手段。【方法】以计算的土壤颗粒体积分形维数（Dv）作为分析对象，建立集分形理论、传统统计学、分离土壤颗粒Dv的双对数图和地质统计学等理论和方法为一体的表层土壤颗粒大小分布变化特征分析方法体系，并基于此从点和区域2个尺度系统全面地研究表层土壤颗粒大小分布变化特征。【结果】粒径＜10 μm的土壤颗粒累积体积百分含量与Dv呈显著正相关，相关系数为0.46，而＞50 μm以内的土壤颗粒累积体积百分含量与Dv呈显著负相关，相关系数为0.63，土壤颗粒Dv值越小，土壤颗粒越粗；最大和最小Dv的双对数拟合图主要变化靠近拟合的直线，R2值均在0.9以上，拟合结果理想，分离的Dv能够包含整个土壤颗粒大小分布变化的程度。不同土壤有机质含量组之间土壤颗粒Dv存在一定差异性，土壤颗粒Dv能够客观地表征农田土壤质量的变化；随着高程增加，Dv表现相对比较复杂；褐土土壤颗粒Dv均值最大，潮土均值最小；粮田、园地和草地之间的土壤颗粒Dv差异性不明显。基于土壤颗粒Dv与环境因素关系分析的回归克里格法预测结果较为准确，区域和样点土壤颗粒Dv空间分布格局一致，较客观地反映了区域表层土壤颗粒大小分布变化特征。【结论】建立的方法体系能够从多角度、多尺度全面地反映土壤颗粒大小分布特征，分析结果符合实际，土壤颗粒Dv可以作为定量化分析评价和表征土壤质量及其演变过程的手段。

苹果LysM基因家族的生物信息学及表达分析

周喆, 张彩霞, 张利义, 王强, 李武兴, 田义, 丛佩华

中国农业科学. 2014, 47(13): 2602-2612. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.13.012

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【目的】在苹果全基因组中鉴定LysM，通过基因聚类分析、染色体定位、结构分析以及组织表达分析，为苹果LysM的功能研究和利用奠定基础。【方法】利用已公布的苹果基因组数据库GDR和FEM-IASMA，鉴定苹果LysM基因家族成员，并对其进行编号。MdLysM蛋白氨基酸序列的基本信息通过ExPASy Proteomics Server进行预测，亚细胞定位的预测利用WoLF PSORT进行。采用MEGA5软件构建了进化树。应用Plaza程序绘制基因结构，染色体定位信息取自GMDO，鉴定出的39个基因的染色体定位作图使用MapInspector完成；另外，通过实时荧光定量RT-PCR对各基因的组织表达特性进行分析，差异显著性分析通过SPSS完成。【结果】系统地鉴定了39个苹果LysM家族成员。这39个MdLysM蛋白包含241至1 119个不等的氨基酸残基，等电点分布在4.70—9.60范围内。亚细胞定位结果表明，苹果LysM蛋白在细胞核、细胞质、叶绿体、液泡、胞外基质中均有分布。根据聚类分析可将这些基因分为A、B和C 3组，且A组又可进一步被分为Ⅰ、Ⅱ 和 Ⅲ 3个亚族，说明它们的功能可能已经发生了分化。MdLysM蛋白结构域的预测结果及基因结构分析结果均与进化树聚类结果吻合。染色体定位表明，MdLysM分布在苹果17条染色体中的13条上，且此家族的基因在13条染色体上的分布为非均匀的，其中以4号染色体上分布最多，达到了9个，而1、5、7和8号染色体上则未见分布。在苹果LysM家族中鉴定出了10对和1组旁系同源基因，MdLysM基因间存在串联重复和片段重复，它们是苹果LysM家族扩张的主要动力。对39个基因在根、茎、叶、花、果5个组织器官中的实时荧光定量RT-PCR结果显示，5个器官中均能检测到MdLysM的表达，这些基因的组织表达模式具有多样性，表明它们在不同组织中可能扮演不同的角色。【结论】苹果LysM基因家族拥有39个成员，进化上可分为3组，基因结构的复杂程度与进化树聚类存在联系。39个基因分布于13条染色体上，存在重复事件。这些信息为今后苹果LysM基因家族的功能研究奠定了基础。

成花素基因PdFT的克隆及其对牡丹成花的影响

朱富勇, 刘传娇, 薛璟祺, 王顺利, 张萍, 任秀霞, 张秀新

中国农业科学. 2014, 47(13): 2613-2624. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.13.013

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【目的】克隆紫牡丹FT同源基因，分析其表达模式以及对紫牡丹成花的调控作用。【方法】以紫牡丹为试验材料，通过RT-PCR的方法克隆紫牡丹FT同源基因PdFT。通过实时荧光定量PCR分析PdFT在紫牡丹不同组织、紫牡丹开花物候期各过程及不同处理的表达情况，并探讨PdFT与花芽发育状态的关系。同时，将克隆到的紫牡丹PdFT克隆到表达载体pET-28a上，构建融合表达载体pET-28a-PdFT，转化到大肠杆菌BL21（DE3）并诱导表达。【结果】克隆得到包括完整开放阅读框（ORF）的PdFT cDNA序列，ORF长度为522 bp，编码173个氨基酸，GenBank登录号为KF113360。氨基酸序列比对表明：PdFT蛋白具有一个典型的PEBP结构域，属于PEBP家族；并且与GenBank中已克隆的FT同源基因具有高度的同源性。实时荧光定量PCR分析结果表明，PdFT在紫牡丹根、茎、叶、芽中均有表达，芽中表达量最高，叶中表达量最低。紫牡丹开花物候期各过程PdFT的表达分析表明，在花芽膨大期表达量最高，随着花蕾的发育，PdFT的表达量逐渐降低。PdFT在不同光照温度条件下的表达分析表明，短日照和低温处理均抑制PdFT基因的表达。不同状态花蕾中PdFT的表达分析结果表明，败育花蕾PdFT的表达量低于正常花蕾。同时，GA3及去叶处理均能提高PdFT的表达量。所构建的原核表达载体，经IPTG诱导和SDS-PAGE电泳检测结果表明，表达蛋白与预期蛋白大小一致。【结论】紫牡丹PdFT与已克隆的FT同源基因高度同源，属于FT亚家族，在紫牡丹顶芽中表达量最高，可能调控牡丹开花，PdFT的克隆及表达分析为研究紫牡丹成花的分子机理奠定了基础。

水果果实中主要有机酸提取条件的优化

庞荣丽, 方金豹, 郭琳琳, 谢汉忠

中国农业科学. 2014, 47(13): 2625-2633. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.13.014

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【目的】建立一种能同时测定水果果实中主要有机酸（柠檬酸、酒石酸、苹果酸、琥珀酸）含量的有效提取方法。【方法】以柑橘、葡萄等为试材，以乙醇的水溶液为提取剂，采用超声提取的方法，对提取剂提取效果（乙醇溶液浓度配比、纯水提取效果及主要有机酸的稳定性、不同浓度乙醇溶液提取效果、10%乙醇溶液提取效果及主要有机酸的稳定性等）、提取条件（提取方式、超声提取时间等）进行优化试验研究。用优化的提取方法对方法技术参数（检出限、精密度、重复性、准确度等）进行测试，并将测定结果与已有国标法测定结果进行比较分析。【结果】水果果实中有机酸提取的适宜方法为乙醇溶液超声提取法：样品用10%乙醇溶液在超声波提取器中提取30 min，提取后加入硫酸溶液，使提取液中含有和流动相一致的硫酸质量浓度，然后用10%乙醇溶液定容，混匀后离心过滤。取部分滤液用0.22 μm水性滤膜针头过滤器过滤，供离子色谱分析用。在此条件下，主要有机酸提取完全，且提取液在室温条件下稳定性好，至少在15 d内各主要有机酸不会转变为乳酸和乙酸。优化后的提取方法精密度高（RSD为0.28%—1.20%），重复性好（变异系数为0.236%—3.02%（n=5）），准确度高（回收率为88.9%—101.2%），有机酸组分测定效果优于已有国标测定结果。【结论】该方法快速、简便，准确度高、重现性好，适合水果果实中主要有机酸含量的测定。

预乳化液超声处理对低脂法兰克福香肠品质的影响

赵颖颖, 邹玉峰, 王鹏, 陈林, 李可, 徐幸莲

中国农业科学. 2014, 47(13): 2634-2642. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.13.015

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【目的】采用超声法制备酪蛋白酸钠-大豆油预乳化液，将其作为猪背脂替代品加工低脂法兰克福香肠。【方法】研究不同超声预乳化液替代比例(25%、50%、75%和100%)下，法兰克福香肠的化学组成、色泽（亮度、红度、黄度）、质构特性（硬度、咀嚼性、弹性、内聚性、回复性）、保水保油性（蒸煮损失、加压损失）、水分子分布状态和微观结构。【结果】随着超声预乳化液替代比例的增加，水分含量增加，脂肪含量和能量减少（P＜0.05），各组之间的灰分含量差异不显著（P＞0.05），蛋白质含量变化不大；L*值显著增大，a*值显著减小（P＜0.05）；弹性、内聚性和回复性随着替代比例的增加而增大，替代比例达到50%以上时，弹性值与对照组差异不显著（P＞0.05），替代比例达到25%以上时，内聚性显著高于对照组（P＜0.05），替代比例高于50%时，回复性显著高于对照组（P＜0.05），硬度和咀嚼性随着替代比例的增加而减小，但均高于对照组，质构特性提高；蒸煮损失和加压损失增加，但均低于对照组（P＜0.05），保水保油性改善。随着替代比例的增加，T23从57.22 ms增至64.57 ms，pT23减小而pT24增加，但与对照组比，各处理组的可移动水含量高，自由水含量低。扫描电镜结果表明，100%超声替代组香肠中的乳化球体积小，填充均匀。【结论】超声处理可以减小预乳化液滴的体积并提高蛋白质分子对水油的吸附和保持能力，从而有效改善低脂香肠的食用品质。

碱性盐胁迫对超干贮藏苜蓿种子幼苗生长及抗性的影响

霍平慧, 李剑峰, 师尚礼, 张淑卿

中国农业科学. 2014, 47(13): 2643-2651. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.13.016

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【目的】研究经硅胶脱水处理并密封贮藏1年后，不同含水量陇东紫花苜蓿（Medicago sativa L. cv. Longdong）种子在碱性盐胁迫下的出苗、幼苗生长情况及抗性。【方法】采用硅胶干燥法对种子进行不同时间的脱水处理（0、12、24、48、72、96、120、144、216 h），将种子置于透气网袋并埋入硅胶，种子与硅胶的比例1﹕10（w/w），每天定期更换经120℃高温烘干至恒重的硅胶，分别得到不同含水量的种子（9.03%、7.09%、6.93%、6.36%、5.72%、5.46%、5.18%、4.97%、4.59%）。铝箔密封并于室温下通风干燥处贮藏1年后，以NaHCO3和 Na2CO3按9﹕1摩尔比混合，模拟典型胁迫环境，设置15 mmol•L-1碱性盐胁迫，并结合Hoagland营养液进行室内盆栽沙培试验。【结果】超干处理对碱性盐胁迫条件下苜蓿种子的萌发、植株的高度生长、根系的长度生长及根瘤形成无明显促进作用。30 d时，含水量大于5.46%的5个处理组植株的出苗数与对照比差异不显著，而随着含水量的继续降低，含水量小于5.18%的4个盆栽处理组出苗数显著低于对照；60 d时，各超干处理幼苗间株高无显著差异，除4.59%含水量处理植株的根瘤数显著低于对照，仅为对照的21.41%外，其他各处理根瘤数与对照比差异不显著，根系长度除7.09%和4.97%含水量处理显著高出对照外，其余各处理与对照比差异不显著。适度含水量处理下，植株的生物量、根体积和叶片数有不同程度提高。各超干处理的地上与地下部鲜重指标变化趋势基本一致，即6.93%、6.36%、5.72%和4.97%的超干处理植株鲜重显著高于对照，地上部鲜重为对照的125.08%—147.84%，地下部鲜重为对照的128.36%—271.11%；除6.93%含水量超干处理植株的地上与地下部干重指标显著高于对照，分别为对照的169.75%和370.16%外，其他各处理的地下部干重与对照比差异不显著；除4.59%含水量超干处理幼苗的地上部干重显著低于对照，其余各处理与对照比差异不显著。60 d时，6.93%和6.36%含水量处理植株的根体积显著高于对照，分别为对照的175.68%和189.21%, 6.93%、6.36%和4.97%含水量处理的植株叶片数显著高于对照，其他各处理与对照比差异不显著。盆栽60 d将植株洗出时，6.93%、6.36%、5.72%、5.46%、5.18%、4.97%等6个含水量处理植株根系活力提高137.45%—199.62%，5.72%、5.46%、5.18%、4.97%等4个含水量处理植株可溶性糖含量提高176.76%—294.20%，所有超干处理种子所得植株的叶绿素含量均高于对照，为对照的137.82%—211.76%，而所有超干处理植株的MDA含量均低于对照，仅为对照的4.66%—51.69%。【结论】对陇东紫花苜蓿种子进行适度超干处理和贮藏有利于其植株生物量、根体积的增加以及叶片的生长和叶绿素的形成，可以促进植株根系活力的提高以及胁迫下植株抗性的增强，表明适度超干处理作为种子预处理方式，可以促进苜蓿种子在碱性盐胁迫条件下的萌发及幼苗的生长。

一株中等毒力牛种布鲁氏菌的鉴定和毒力测定

丁家波1, 王芳1, 杨宏军2, 王楠1, 朱良全1, 顾进华1, 张广川1, 王海光1, 赵鹏3, 程君生1, 毛开荣1, 冯宇3

中国农业科学. 2014, 47(13): 2652-2658. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.13.017

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【目的】对初步鉴定的牛种布鲁氏菌分离株（B. abortus 343）进行全面的生物学特性检定，为深入研究布鲁氏菌病提供参考菌株。【方法】将B. abortus 343划线培养及梯度稀释，使其形成单个菌落，观察菌落形态。挑取单个菌落进行革兰氏染色和柯氏染色，观察其染色特点；分别接种1.5×106 CFU到含硫瑾（1﹕25 000）或含碱性复红（1﹕25 000）的TSA平板上，观察其生长状态；将接种有B. abortus 343的TSA平板分别置于普通培养箱和CO2培养箱37℃培养72 h，观察其对CO2的依赖性；通过醋酸铅试纸条测定B. abortus 343代谢过程中是否释放H2S。通过平板凝集试验测定布鲁氏菌单相特异性血清（牛种布鲁氏菌单因子血清A、羊种布鲁氏菌单因子血清M 和布鲁氏菌粗糙型血清R ）与B. abortus 343抗原的反应性；利用布鲁氏菌AMOS-PCR种属分型等方法对B. abortus 343进行了PCR种属特性鉴定；将B. abortus 343免疫小鼠，分别测定其抗血清与光滑型和粗糙型抗原的反应性；通过小鼠和豚鼠感染试验，全面评价该分离株的毒力；分别以1×105 CFU感染6周龄Balb/c小鼠，测定B. abortus 343在小鼠体内存活时间；以1×109 CFU感染Hartley豚鼠，2周后测定试验豚鼠每克脾脏含菌量；分别以10 000、1 000、100、25 CFU/只4种不同剂量感染豚鼠，初步测定分离株对豚鼠的最小感染量（MID），在此基础上，进一步以40、60和90 CFU/只测定MID。【结果】分离株B. abortus 343 为光滑型牛种布鲁氏菌，菌落逆光观察微带蓝绿色乳光；革兰氏染色为阴性，柯氏染色为红色，H2S试验阳性。该菌能在含硫瑾和碱性复红的培养基上生长，不依赖于CO2。B. abortus 343抗原能与A因子血清呈明显凝集反应，免疫小鼠后能产生特异性抗体。以1×105 CFU感染6周龄Balb/c小鼠，可在小鼠体内存活29周；以1×109 CFU感染350—400 g雌性豚鼠，14 d后豚鼠每克脾脏含菌量2.4×105—1.2×106；以1×105 CFU感染豚鼠1个月后，所有试验豚鼠均能产生特异性光滑型抗体，试管凝集效价为320—1 280；B. abortus 343对豚鼠的最小感染量约为40 CFU。【结论】鉴定了一株中等毒力牛种布鲁氏菌（B. abortus 343），为深入研究布鲁氏菌病提供了参考菌株，丰富了布鲁氏菌菌种资源。

家蚕sirtuin家族基因的鉴定及系统发生与表达芯片分析

陈聪, 宋江波, 孟刚, 童晓玲, 代方银, 鲁成

中国农业科学. 2014, 47(13): 2659-2670. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.13.018

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【目的】鉴于sirtuin家族基因重要而多样性的功能，从家蚕全基因组中鉴定sirtuin家族基因，并进行基因结构、蛋白结构及其理化性质、基因进化、组织表达芯片分析及在不同组织中的定量表达情况分析，为研究家蚕sirtuin家族基因的功能和推动家蚕模式生物系统化的研究奠定基础。【方法】基于家蚕基因组数据库，通过生物信息学手段，利用比较基因组学方法，鉴定家蚕sirtuin家族成员；开放阅读框（ORF）的预测用ORFfinder进行；使用SIM4进行ORF的内含子和外显子的预测；用GSDS和ExPaSy在线工具分别进行基因结构图和蛋白序列理化性质的预测；用CLUSTAL_X软件进行多序列联配及对其二级结构进行分析，并用ESpript进行二级结构作图；使用SMART在线软件进行蛋白功能域预测；MEGA5.0软件用于系统发生树分析；利用已有的家蚕幼虫5龄第3天的芯片数据进行组织表达分析；利用荧光定量PCR技术检测家蚕sirtuin家族基因在5龄第3天幼虫不同组织中的表达情况。【结果】系统分析鉴定了家蚕中存在的5个sirtuin家族基因（Bmsirt2、Bmsirt4、Bmsirt5、Bmsirt6、Bmsirt7），共分为4类（I、II、III、IV）。5个基因分布在家蚕5条染色体上，均为单拷贝基因。基因结构分析显示5个基因均为多外显子基因。同源比对和系统进化分析发现家蚕的sirtuin家族基因与类群中其他昆虫的同源基因形成明显的直系同源关系且高度同源，同样不含有sirt3。蛋白结构预测发现家蚕的sirt6与其他物种的sirt6蛋白一样含有两个sir2结构域聚在一起。组织表达芯片分析发现，sirtuin家族基因在多个组织中具有转录活性。荧光定量PCR检测结果显示家蚕的Bmsirt4在脂肪体、丝腺中低表达；Bmsirt5在精巢、中肠中高量表达，在脂肪体、血液、丝腺中低量表达，与芯片数据基本一致。【结论】通过全基因组分析，家蚕共有5个sirtuin家族成员，进化上分为4类，且与其他昆虫高度同源，芯片数据和实时荧光定量 PCR 结果基本一致，分析表明组织表达模式具有多样性。

小麦粒重基因TaCwi-A1功能标记CWI22、CWI21的验证及应用

相吉山1, 2, 穆培源1, 2, 桑伟1, 2, 聂迎彬1, 徐红军1, 庄丽2, 3, 崔凤娟1, 2, 韩新年1, 邹波1

中国农业科学. 2014, 47(13): 2671-2679. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.13.019

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【目的】验证已开发的TaCwi-A1功能标记CWI22、CWI21检测小麦千粒重的可靠性，为分子标记辅助选择提供参考信息。同时用该标记检测新疆小麦品种资源，探讨TaCwi-A1等位变异类型及分布频率。【方法】首先以110份新疆冬小麦品种资源为材料，用CWI22、CWI21检测TaCwi-A1基因型，并利用SKCS测定千粒重，比较TaCwi-A1a、TaCwi-A1b基因型品种间千粒重的差异。再以1 241份新疆小麦品种资源为材料，对TaCwi-A1基因型进行分子标记检测。【结果】在110份新疆冬小麦品种资源中，有46份材料能够用CWI22扩增出402 bp的目的片段，说明含有TaCwi-A1a；有64份材料能够用CWI21扩增出404 bp的目的片段，说明含有TaCwi-A1b；并且TaCwi-A1a基因型品种（系）的千粒重（43.5 g）显著高于TaCwi-A1b（40.9 g）（P<0.05）。1 241份新疆小麦品种资源中，TaCwi-A1a的分布频率为62.6%，TaCwi-A1b为37.4%。其中，冬小麦中TaCwi-A1a的分布频率为63.0%，TaCwi-A1b为37.0%；春小麦中TaCwi-A1a的分布频率为61.7%，TaCwi-A1b为38.3%，并且TaCwi-A1a在不同类型冬、春小麦品种资源中的分布频率大小顺序均为国外品种（系）>国内品种（系）>自育品系>审定品种>地方品种；新疆小麦审定品种中，冬小麦TaCwi-A1a的分布频率为40.0%，TaCwi-A1b为60.0%，春小麦TaCwi-A1a的分布频率为68.6%，TaCwi-A1b为31.4%。在1990年以前、1991—2000年、2001年以后3个阶段的审定品种中，TaCwi-A1a和TaCwi-A1b的分布频率分别为11.1%和88.9%、50.0%和50.0%、69.2%和30.8%。【结论】TaCwi-A1的分子标记CWI22、CWI21能够较好地区分小麦千粒重的大小，可用于粒重的分子标记辅助选择。在新疆小麦品种资源中，TaCwi-A1a有较高的分布频率。其中，冬小麦品种资源中的分布频率略高于春小麦品种资源，引进品种（系）高于自育品种（系），自育品种（系）高于地方品种。在地方品种和自育品种（系）中，TaCwi-A1a在春小麦中的分布频率明显高于冬小麦，说明新疆冬、春小麦育种对粒重的选择存在一定的差异；但总体都有较强的选择压力，使TaCwi-A1a在审定品种中的分布频率逐渐提高。

大豆蛋白质和油分含量QTL定位及互作分析

侯萌1, 齐照明1, 韩雪2, 辛大伟1, 蒋洪蔚2, 刘春燕2, 吴琼1, 隋丽丽4, 胡国华2, 3, 陈庆山1, 3

中国农业科学. 2014, 47(13): 2680-2689. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.13.020

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【目的】定位大豆蛋白质和油分含量QTL及互作分析，为大豆品质性状QTL精细定位和分子辅助育种提供基础。【方法】以Charleston和东农594为亲本，构建了含147个株系的重组自交系，以F2:19—F2:20代重组自交系为试验材料，利用Windows QTL Cartographer V. 2.5软件的复合区间作图法和多重区间作图法，对该群体的蛋白质和油分含量进行QTL定位分析，并利用QTL Network 2.1软件分析QTL间的上位性效应及环境互作效应。【结果】采用CIM和MIM 2种算法在2011和2012年哈尔滨、红兴隆、佳木斯和牡丹江每年3个地点共6个种植环境下共定位了9个蛋白质和11个油分含量QTL。蛋白质含量QTL分布在6个连锁群，分别在A1、C2、D1a、G、H和O连锁群上，对表型效应的贡献率为5.3%—18.6%，在H连锁群上的qPro-H-1贡献率最大，为18.6%，在D1a连锁群上的qPro-D1a-2贡献率最小，为5.3%，在单种植环境下有5个蛋白质含量QTL被2种算法同时检测到，分别是qPro-O-1、qPro-A1-1、qPro-D1a-1、qPro-D1a-2和qPro-C2-2。油分含量QTL分布在8个连锁群，分别在A1、A2、B1、C2、D1a、E、L和M连锁群上，对表型效应的贡献率为7.1%—24.4%，在B1连锁群上的qOil-B1-2贡献率最大，为24.4%，在C2连锁上的qOil-C2-3贡献率最小，为7.1%，在单种植环境下有2个油分含量的QTL被2种算法同时检测到，分别为qOil-C2-1和qOil-M-1。另外，有2个油分含量QTL在2个以上种植环境重复检测到，为2011年哈尔滨和2011年红兴隆2个种植环境下同时检测出的qOil-A1-1，2011红兴隆、2011牡丹江和2012哈尔滨3个地点同时被检测出的qOil-B1-2。在互作效应分析中，共检测出3对蛋白质上位效应QTL和4对油分上位效应QTL，在蛋白质上位性分析中，上位效应值在0.2068—0.3124，贡献率在0.0227%—0.0265%，分布在A1、C2、D1和E连锁群上，其中，qPro-A1-3与qPro-C2-1效应值为负，其余2对效应值为正，连锁群A1，D1a均有2个QTL发生互作。在油分上位性分析中，上位效应值在0.0926—0.1682，贡献率在0.0294%—0.0754%，分布在A1、C2、I、J、N和O连锁群上，其中，qOil-C2-4与qOil-N-1效应值为负，其余3对效应值为正,在N连锁群的qOil-N-1同时与2个QTL发生互作，分别是C2连锁群上的qOil-C2-1和qOil-C2-4。在与环境互作中，qPro-D1a-3与qPro-E-1在2012年佳木斯地点没检测出，其余6对都检测出与环境的互作效应，贡献率分别为0.0001%—0.0378%，互作效应都较小，明显小于自身的加性效应。【结论】定位到9个蛋白质相关QTL和11个油分相关QTL，并发现3对蛋白质含量上位性效应QTL和4对油分含量上位性QTL。

牦牛CYGB基因CDS区克隆与生物信息学分析

孙雪婧1, 3, 杜晓华1, 3, 杨孝朴1, 罗玉柱3, 刘霞2, 3

中国农业科学. 2014, 47(13): 2690-2698. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.13.021

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【目的】丰富牦牛CYGB基因研究的基础数据，对牦牛CYGB基因的CDS区进行克隆和生物信息学分析。【方法】提取牦牛大脑海马区组织的总RNA并运用RT-PCR技术反转录为cDNA，并根据GenBank中普通牛CYGB基因cDNA序列（GenBank登录号：DV874786.1），使用Primer3.0在线软件设计特异性引物，运用PCR扩增技术、TA克隆技术和核酸测序技术获得CYGB基因的完整CDS区序列及部分5′端和3′端UTR区，并使用ProtParam、PredictProtein、SWISS-MODEL等在线分析软件与Lasergene7.1软件包分析CYGB的一级结构、二级结构、三级结构与理化性质，并进行同源性分析及构建系统进化树；利用PyMol软件修饰并输出三维结构；使用在线亚细胞定位工具PSORT II Prediction预测蛋白质的亚细胞定位；使用Protfun软件对蛋白质的功能进行预测分析。【结果】克隆获得牦牛CYGB基因650 bp，包括CDS区573 bp(GenBank登录号：KF669898)，碱基组成为A 20.59%、T 16.40%、G 33.33%、C 29.67%，编码190个氨基酸残基组成的蛋白质。与普通牛比对，牦牛CYGB基因在CDS区存在4个碱基突变，同源性为99.3%，这个突变未导致氨基酸序列的改变，4个突变均属同义突变。牦牛CYGB基因编码蛋白的分子式为C964H1513N263O278S7，分子量约为21.5 kD，理论等电点（pI）为6.32，消光系数为24075，不稳定系数为48.43，疏水指数为83.63，平均亲水性为-0.301，属不稳定可溶性酸性蛋白质，在哺乳动物网织红细胞内的半衰期为30 h。二级结构以α-螺旋和无规卷曲为主，其中α-螺旋占64.21%，无规卷曲占35.79%，属全α类蛋白质。三级结构是一个呈“three-over-three”三明治夹心型的α-螺旋折叠结构。亚细胞定位CYGB分布在细胞质(65.2%)、细胞核(17.4%)、线粒体(13.0%)、分泌系统的囊泡(4.3%)中，主要在细胞质，推测可能在能量代谢和辅因子的生物合成过程中发挥信号转导和转录因子调控的作用。牦牛CYGB氨基酸序列与普通牛、绵羊、家犬、小鼠、褐家鼠、原鸡、猴、黑猩猩、人的CYGB氨基酸序列的同源性分别为100%、98.9%、97.8%、95.3%、93.7%、78.8%、98.4%、95.8%和96.8%，物种之间同源性较高，系统进化情况与其亲缘关系远近一致，说明CYGB基因编码区在进化过程中比较保守。【结论】通过RT-PCR与TA克隆技术及核酸测序技术获得了牦牛CYGB基因全长573 bp的CDS区，并对其核苷酸序列和编码蛋白氨基酸序列及其蛋白结构和功能进行了分析，得知牦牛的CYGB是一个由190个氨基酸残基构成的可溶酸性蛋白质，在能量代谢和辅因子生物合成过程中发挥重要作用。CYGB基因编码区在长期生物进化过程中具有较强的保守性。该基因的成功克隆及分析为揭示牦牛CYGB基因的遗传特性提供了理论依据。

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