当期目录

2014年 第47卷 第7期 刊出日期：2014-04-01

  

作物遗传育种·种质资源·分子遗传学

利用InDel标记鉴定浙优系列杂交稻籼粳属性和预测杂种优势

王林友, 张礼霞, 勾晓霞, 范宏环, 金庆生, 王建军

中国农业科学. 2014, 47(7):  1243-1255.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.07.001

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【目的】准确鉴定水稻材料的籼粳属性及利用遗传距离预测杂种优势，为开展水稻超高产育种和籼粳亚种间杂种优势利用提供基础。【方法】利用19对籼粳稻特异插入/缺失（Insertion/Deletion，InDel）引物，对12个浙优系列杂交稻及其双亲的籼粳属性进行了InDel分子标记鉴定，根据被检测水稻样品在多个InDel 位点上的籼型或粳型基因频率，参考卢宝荣的方法，将供试样品分别判定为“籼稻”、“偏籼”、“中间偏籼”、“中间偏粳”、“偏粳”和“粳稻”。采用Nei的方法求算13个亲本间（1个不育系和12个恢复系）的InDel遗传距离，用UPGMA法进行遗传相似性聚类，用SPSS 17.0统计分析软件对InDel条带赋值进行主成分分析, 依据第一和第二主成分的特征向量的平均分量值作平面散点图。统计杂种F1稻谷产量、每穗总粒数、每穴有效穗、结实率、千粒重及单穗重各产量性状的对照优势，以此分析InDel遗传距离与杂种优势的相关性。【结果】（1）参试材料籼粳属性的判别：不育系浙04A被鉴定为“粳稻”，8个恢复系被判定为“籼稻”或“偏籼”，由其所配组的8个杂交组合被判定在“中间偏籼”到“偏粳”之间，证实了这8个组合为典型的籼粳交组合；另外4份恢复系被判定为“偏粳”，所配组的4个杂交组合被判定为“粳稻”。（2）参试材料的聚类分析：当GS 为0.350时，35份试验材料被分为“粳稻”和“籼稻”2个主群，GS为0.638时，粳稻主群又被划分为“粳稻/偏粳”和“中间偏粳”2个亚群。其中，粳稻/偏粳亚群包括不育系浙04A、4个粳粳交恢复系及粳粳交杂种F1、3个粳稻对照种和粳稻秀水09；中间偏粳亚群包括8个籼粳交杂种F1。籼稻主群则包括8个籼粳交组合的恢复系、3个籼稻对照种和籼杂组合汕优63。（3）InDel遗传距离与杂种优势的相关性：在以粳粳交、籼粳交组合整体作为分析对象时，InDel遗传距离与稻谷产量、每穗总粒数、单穗重呈极显著正相关，与结实率呈显著负相关；仅以籼粳交组合为研究对象时，InDel遗传距离仅与单穗重和千粒重呈显著正相关。【结论】供试的12个浙优系列中的8个组合被证实为典型的粳不/籼恢型籼粳交组合，这些组合的双亲间具有较远的遗传距离；InDel遗传距离在不同类型品种间具有较好的杂种优势预测能力，可用于单穗重的优势预测，即随着InDel遗传距离的扩大，杂种优势主要体现在单穗重的增加上。

特异玉米种质四路糯的穗行数遗传解析

焦付超, 李永祥, 陈林, 刘志斋, 石云素, 宋燕春, 张登峰, 黎裕, 王天宇

中国农业科学. 2014, 47(7):  1256-1264.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.07.002

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【目的】玉米穗行数与产量密切相关，剖析其遗传基础对指导玉米育种实践具有重要意义。【方法】以只有4行籽粒的中国特异地方品种四路糯选系和多穗行数的自交系农531为亲本，采取单粒传法（single seed descend method, SSD）构建正反交F2:3分离群体。在北京昌平和河南新乡采用随机区组试验设计进行分离群体家系的穗行数表型鉴定。与此同时，根据玉米基因组数据库上公布的标记信息，在全基因组范围内筛选获得173个具有多态性的SSR标记，用于群体基因型鉴定及遗传图谱构建。采用完备区间作图法（ICIM）和复合区间作图法（CIM）进行玉米穗行数QTL定位和遗传效应分析，利用SAS软件GLM程序估计主效QTL对分离群体穗行数遗传变异的贡献率。【结果】表型鉴定结果表明，亲本四路糯选系与农531的穗行数平均值分别为4.0行与19.2行，F2:3家系穗行数变化范围为4.0—17.4行。利用完备区间作图法，分别对北京昌平、河南新乡的正交F2:3群体进行穗行数QTL定位，2个环境下共检测到12个穗行数QTL，分布于除第1、7染色体外的其他8条染色体上。等位变异来源分析表明，本研究定位的QTL减效等位变异全部来自少穗行数亲本四路糯选系。共有5个主效QTL在2个环境下均被检测到，其中，位于bin2.04区间内的主效位点qKRN2-1在单环境下最大可解释群体穗行数变异的18.48%，其余4个主效位点及其单环境下解释的最大表型变异分别为qKRN4-2（11.58%）、qKRN5-1(13.55%)、qKRN8-2（16.91%）和qKRN9-1(9.66%)。利用复合区间作图法，在联合环境条件下共检测到5个穗行数QTL，分布在第2、4、5、8、9染色体上，每个QTL解释的表型变异范围为6.13%—10.05%，除位于第5染色体的QTL以外，其余4个位点与完备区间作图法定位到的主效QTL区间一致。一般线性模型分析显示，在2个环境下，5个主效QTL可分别解释正交F2:3群体51.5%（北京昌平）和54.0%（河南新乡）的表型变异。还定位到2对穗行数上位性QTL位点，分布于第2,、4、9染色体上，但表型贡献率分别仅为2.90%和1.80%。【结论】穗行数减效等位变异全部来自四路糯选系，鉴定出5个玉米穗行数主效QTL，分别位于bin2.04、bin4.09、bin5.04、bin8.05和bin9.03。表明该四路糯选系可作为重要的穗行数遗传研究材料，而定位到的主效QTL可作为玉米穗行数候选基因图位克隆和玉米遗传基础研究的重要候选区段。

山西谷子资源叶酸含量分析及评价

邵丽华, 王莉, 白文文, 刘雅娟

中国农业科学. 2014, 47(7):  1265-1272.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.07.003

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【目的】通过对山西谷子资源叶酸含量的测定与评价，了解谷子叶酸含量的变异及其与地理分布的关系，为谷子种质营养含量和育种提供依据。【方法】分别在谷子的研究基地长治、汾阳和太原采集目前山西育种和种植中常用品种245个，记录谷子颜色后于60℃下烘干，采用常规方法研磨脱壳去糠，记录米粒颜色后研磨米粒，全部过100目筛子，测定其叶酸含量。叶酸用磷酸二氢钾溶液恒温水浴浸提，加苯胺处理过的活性炭吸附，用3%氨—70%乙醇洗脱，采用高锰酸钾氧化—间接荧光法测定。【结果】①山西省245份不同品种谷子叶酸含量平均为1.53 μg•g-1。谷子叶酸含量数值服从正态分布且为左偏态，说明谷子叶酸含量较多集中在平均值偏高水平。②不同地区谷子叶酸含量不同。同一品种在汾阳种植其叶酸含量显著低于太原和长治。日均温、日照时数和相对湿度对叶酸含量影响不显著，降雨量则显著影响叶酸含量。③谷粒颜色对叶酸含量影响不显著，小米颜色差异显著影响叶酸含量，从高到低依次为：褐色、绿色、黄色、鲜黄、浅黄和白色米粒品种。【结论】山西省谷子资源的叶酸含量存在较为丰富的遗传变异，变异范围0.37—2.37 μg•g-1，变异系数为26.2%。不同生态区谷子叶酸含量存在明显差异，春播晚熟区的叶酸含量显著高于春播中熟区。降雨量显著影响谷子叶酸含量。小米颜色差异对叶酸含量有显著影响。在鉴定评价基础上，以样品叶酸含量的平均数及其标准差（ ±s）为分类依据，筛选了一批高叶酸的谷子种质资源总计24份，占参试材料的9.8%。目前山西省农业生产常用谷子品种晋谷21，其叶酸含量约为2.0 μg•g-1，属于高叶酸含量品种。

耕作栽培·生理生化·农业信息技术

中国水稻种植机械化高产农艺研究现状及发展探讨

张洪程, 龚金龙

中国农业科学. 2014, 47(7):  1273-1289.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.07.004

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水稻种植机械化是中国作物机械化生产的难点。论文在回顾中国水稻机械化种植发展概况的基础上，重点总结与阐述水稻3种机械化种植方式下的高产规律与栽培农艺。（1）系统归纳了盘育毯苗机插水稻的生长发育特性，重点阐述了毯苗机插稻的高产形成规律，即以合理的茎蘖动态与LAI动态，提高群体中后期光合物质生产能力；以合理增加生育中期有效与高效生长量，提高抽穗后物质生产积累量与最终生物学产量；以足量穗数与较大穗型协调产出足够的群体总颖花量，并保持通常的结实率与粒重。同时介绍了相配套的高产栽培农艺：①培育标准化壮秧，提供构建高产群体起点的生物基础；②机械精确栽插，形成高质量群体起点；③前期及早促进，在有效分蘖临界叶龄期稍前群体茎蘖数够到高产适宜穗数值；④及早适度搁田，把群体高峰苗控制为适宜穗数值的1.4—1.5倍，为及早重施壮秆促花肥创造条件；⑤主攻中期优化生长，增加有效与高效生长量，以适量壮秆大穗构成高光效群体；⑥强化后期物质生产与积累，提高群体库容充实量。（2）系统介绍了钵苗机插水稻高产栽培具有的诸多优势：利于精确培育大秧龄带土钵壮秧；几乎无植伤地精确机插；可精确实现高产栽培设计的基本苗；利于培育适宜数量的壮秆大穗，改善群体通风透光条件，增强植株抗倒性；源库较协调，群体中后期光合生产能力强，利于稳定高产与创造超高产；同时可充分利用温光资源，利于多熟制周年高产。实施高产栽培的关键农艺为：①精确培育加大秧龄的壮秧；②精确定量机插；③适当重施分蘖肥与促花肥。（3）阐述了机直播稻生长发育特点与产量形成特征，介绍了合理确定机直播稻种植范围、选用相适生育期的抗倒大穗型品种、抢早机械精播、切实加强化学除草与肥水管理等增产增效的农艺措施。同时，进一步分析了中国水稻种植机械化存在的主要问题，紧贴国情，明确提出专业化培育标准化壮秧与机械精确移栽，并配套稳定高产高效农艺，应是中国多数稻区栽培机械化的基本方向，机械化直播可在稻季热量丰裕的部分地区应用。接着，指明了相应的研发重点与关键：①强调把毯苗机插高产栽培列为中国水稻主产区机械化主体方向加以重点研发，认为必须加强研发的重点是：增强毯苗秧龄弹性与秧苗素质；秸秆机械高质量还田整地与精确栽插秧苗；促进大田稳靠早发，培育适量壮秆大穗，增加群体总库容量。②降低机具成本，提高作业效率以及稳定超高产高效农艺的构建，则是水稻钵苗机插栽培研究的重点。③机直播稻高产栽培农艺发展应重点研究以高效的机械作业提高前茬秸秆还田质量与整地质量，提高机械精确播种质量与全苗早发的技术。文章最后还强调各水稻主产区，应据本区特点切实搞好当地主体机械化种植方式高产栽培全程机械化模式的技术集成与示范推广。

不同基因型棉花苗期耐盐性分析及其鉴定指标筛选

戴海芳, 武辉, 阿曼古丽?买买提阿力, 王立红, 麦麦提?阿皮孜, 张巨松

中国农业科学. 2014, 47(7):  1290-1300.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.07.005

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【目的】棉花（Gossypium hirsutum）虽是较耐盐碱的作物，但不同品种间耐盐性差异较大。本研究旨在探讨新疆各年代不同基因型棉花苗期耐盐特性，挖掘棉花本身耐盐遗传资源，筛选耐盐性快速鉴定指标并建立可靠的棉花耐盐性数学评价模型，为棉花耐盐新品种选育及大规模品种耐盐性评价奠定基础。【方法】以17个棉花品种为试验材料，按NaCl盐与草炭、蛭石复合基质重量比设置0（CK）、0.6%两个处理水平，棉种经消毒、催芽后播于复合基质，通过苗期盐土栽培持续胁迫的方式，可反映棉株在大田条件中的实际胁迫环境及真实抗逆机制。对各处理下各品种出苗率（ER）、幼苗鲜重（FW）、干重（DW）、植株含水量（PWC）、第一片真叶面积（LA）、叶片净光合速率（Pn）、叶绿素含量（Chl）和相对电导率（REC）等11个生理指标进行测定，以各单项指标的耐盐系数作为衡量耐盐性的依据，运用主成分分析、聚类分析和逐步回归等方法对其耐盐性进行综合评价及分类，并分析各耐盐类型棉花品种生理表现特征。【结果】通过主成分分析，本试验将盐胁迫处理下棉花幼苗叶片的11个单项指标转换成6个彼此独立的综合指标；通过隶属函数分析，得到不同棉花基因型幼苗耐盐性综合评价值（D值），并通过聚类分析，将17个棉花品种划分为4种耐盐类型，其中盐敏感型3个品种，弱耐盐及中度耐盐型各6个，高度耐盐型2个；进一步利用逐步回归方法建立了可靠的棉花幼苗耐盐性评价回归模型D=-1.192+ 0.402REC+0.119LA+0.274FW+0.086Pn+1.019Chl，方程决定系数R2= 0.9921，同时筛选出显著影响棉花幼苗耐盐能力的5个单项指标，即Pn、Chl、LA、FW和REC，对回归方程的估计精度进行评价，各品种估计精度均大于94.44%，表明所筛选鉴定指标对棉花耐盐性影响明显，该方程可用于棉花耐盐性评价。本研究对逐步回归与聚类结果进行相互验证，得到各耐盐类型棉花幼苗的生理表现特征。结果发现，与盐敏感品种相比，强耐盐棉花品种幼苗在盐胁迫下REC较低，Pn、Chl、LA和FW则能保持较高水平，且其幼苗真叶面积可达其它类别品种近2倍。【结论】强耐盐棉花品种幼苗叶片在盐碱环境中受到伤害较轻，能保持较高的真叶面积和光合能力，有利于提高植株耐盐能力和光合产物积累，降低土壤中离子毒害，增强植株耐盐性。在相同逆境中，通过测定REC、Pn、Chl、LA和FW等5个鉴定指标，可进行品种耐盐性强弱的快速鉴定和预测。

昆虫几丁质代谢与植物保护

昆虫几丁质代谢与植物保护

张建珍

中国农业科学. 2014, 47(7):  1301-1302.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.07.006

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昆虫糖基水解酶20家族β-N-乙酰己糖胺酶研究进展

屈明博, 刘田, 陈磊, 陈琦, 杨青

中国农业科学. 2014, 47(7):  1303-1312.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.07.007

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糖基水解酶20家族β-N-乙酰己糖胺酶是N-乙酰己糖胺代谢过程中一个重要的酶，其可将位于非还原端以β糖苷键连接的N-乙酰己糖胺从寡糖及糖复合物中水解下来。昆虫糖基水解酶20家族β-N-乙酰己糖胺酶参与昆虫多个生理过程，包括表皮几丁质水解、蛋白质N糖基化修饰、糖复合物水解及精卵识别，因此可能成为生态农药设计的潜在靶标，受到国内外学者的普遍关注。根据昆虫20家族β-N-乙酰己糖胺酶的进化关系和生理功能，可以将其分为4个亚家族，分别为Hex1、Hex2、Hex3和Hex4。Hex1主要在昆虫蜕皮时期的表皮中表达，RNA干扰该基因能够导致昆虫在发育过程中不能正常蜕皮而死亡。通过酶学性质研究发现，Hex1能够专一性水解以β 1-4糖苷键连接的几丁质寡糖底物，而不能水解以其他形式连接的底物，是专一性的参与几丁质水解的β-N-乙酰己糖胺酶。目前获得的唯一一个昆虫β-N-乙酰己糖胺酶的晶体结构来自于亚洲玉米螟的OfHex1，其参与底物结合的“+1”位点存在一个特殊的三明治结构，使得Hex1对几丁质寡糖具有高度的选择性和水解活性。Hex2在双翅目昆虫中并不存在，与人类的β-N-乙酰己糖胺酶具有高度的相似性，RNA干扰该基因的表达能够导致幼虫化蛹时异常，成虫翅、附肢、触角等异常。通过酶学性质研究表明，Hex2能够水解释放几丁质寡糖，糖复合物等底物中的β-N-乙酰己糖胺，具有广泛的底物谱。Hex2的功能可能与人类Hex酶的功能类似，参与糖复合物的水解。Hex3是目前研究较少的一类β-N-乙酰己糖胺酶，RNA干扰该基因的表达能够导致幼虫蜕皮过程异常。Hex3存在于昆虫蜕皮液中，与Hex1存在相互作用，可能形成二聚体。通过酶学性质研究表明，Hex3能够水解几丁质寡糖底物，但活性较弱，说明其可能参与几丁质的水解。此外，Hex3、Hex1和Hex4被发现存在于双翅目昆虫精子的表面，可能参与精卵识别过程。Hex4又被称为FDL，是因为该基因的缺失能够导致果蝇左右大脑发生融合（fused lobe）。它是另外一种具有严格底物选择性的β-N-乙酰己糖胺酶，能够专一性地水解糖复合物GnGn中α1-3分支上以β 1-2糖苷键连接的GlcNAc β 1-2Man，通过细胞定位研究表明Hex4主要存在于高尔基体当中。以上表明Hex4的主要功能是参与细胞内的糖基化修饰过程。尽管目前对于昆虫β-N-乙酰己糖胺酶的研究取得了很大的进展。对Hex1的功能、酶学性质和晶体结构研究得较为透彻，对于设计环境友好的杀虫剂具有较强的指导意义。但其他3种β-N-乙酰己糖胺酶在生理条件下如何发挥功能，以及4种β-N-乙酰己糖胺酶活性差异的结构基础并不是十分清楚。作者从进化关系、晶体结构、酶学性质和生理功能等方面对昆虫糖基水解酶20家族β-N-乙酰己糖胺酶的研究进展进行综述。

中华稻蝗几丁质酶基因10（OcCht10）的分子特性及功能

李大琪1, 王燕1, 张建琴1, 李涛1, 孙毅2, 张建珍1

中国农业科学. 2014, 47(7):  1313-1320.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.07.008

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【目的】获得中华稻蝗（Oxya chinensis）几丁质酶基因10（OcCht10）的cDNA序列，预测其功能域，并做聚类分析明确该基因的系统发育关系。绘制OcCht10在5龄若虫不同组织部位和发育时间的表达图谱，研究其在中华稻蝗蜕皮过程中的生物学功能，为害虫防治提供高效安全的候选基因。【方法】从中华稻蝗转录组数据库搜索OcCht10 cDNA片段，经过blast分析、比对、拼接后，翻译为氨基酸序列，预测其功能域，并与其他昆虫几丁质酶家族基因进行聚类分析，进一步确认该基因的系统发育关系并进行准确命名；选取中华稻蝗5龄第6天不同组织部位及5龄若虫不同天数表皮样本，总RNA提取后反转录为cDNA模板，采用Real-time quantitative PCR（qPCR）方法获得OcCht10在5龄稻蝗若虫不同组织部位和不同发育阶段的表达谱；设计OcCht10 dsRNA引物，用试剂盒体外合成dsOcCht10，采用注射法进行RNA干扰；取注射24 h稻蝗表皮样本，用qPCR方法检测OcCht10基因沉默效率；并仔细观察dsRNA注射后稻蝗表型，统计其死亡率。【结果】经对中华稻蝗转录组数据库的搜索，获得OcCht10 cDNA片段长度为9 318 bp，开放阅读框为8 613 bp，编码2 870个氨基酸；其3′非编码区为705 bp，推测OcCht10 5'端有500多碱基尚未获得；预测其氨基酸序列具有多个结构域，包含有5个几丁质酶催化域和6个几丁质结合域；与其他昆虫几丁质酶基因聚类分析结果显示OcCht10属于昆虫几丁质酶家族基因Ⅱ组，该组基因与昆虫蜕皮相关；5龄若虫组织特异性分析表明该基因主要在表皮、前肠和后肠等外胚层发育而成的组织器官中表达，提示OcCht10可能参与表皮几丁质代谢；发育时间表达图谱表明该基因在5龄第6—7天，即蜕皮前的表皮中高表达，表明OcCht10可能负责蜕皮时表皮几丁质降解；5龄若虫第2天注射该基因的dsRNA，24 h后取表皮检测其干扰效率，结果显示该基因被沉默70%；与注射dsGFP的对照组相比，注射dsOcCht10 5龄若虫表现为龄期延长，旧表皮无法开裂，蜕皮受阻，昆虫无法正常活动导致死亡，死亡率达到100%。【结论】获得OcCht10的部分cDNA序列，该基因在昆虫蜕皮前表皮中高表达；OcCht10参与中华稻蝗的蜕皮发育，注射dsOcCht10可有效沉默靶基因，并导致试虫无法完成正常蜕皮而死亡。

中华稻蝗几丁质脱乙酰基酶2基因的分子特性和生物学功能

于荣荣, 丁国伟, 郭亚平, 马恩波, 张建珍

中国农业科学. 2014, 47(7):  1321-1329.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.07.009

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【目的】研究中华稻蝗（Oxya chinensis）几丁质脱乙酰基酶（chitin deacetylase，CDA）基因的分子特性和生物学功能，为新型农药靶标筛选提供科学依据。【方法】采用生物信息学方法在稻蝗转录组数据库中搜索获得几丁质脱乙酰基酶基因cDNA序列，对其进行保守区域分析，选取赤拟谷盗（Tribolium castaneum）、果蝇（Drosophila melanogaster）、冈比亚按蚊（Anopheles gambiae）、家蚕（Bombyx mori）和云杉卷叶蛾（Choristoneura fumiferana）等昆虫物种的同源序列与中华稻蝗几丁质脱乙酰基酶氨基酸序列进行聚类分析，进一步构建系统发育树；运用real-time PCR方法检测几丁质脱乙酰基酶基因在中华稻蝗5龄若虫不同组织部位和不同发育天数表皮中的表达特性；进一步采用RNA干扰（RNAi）技术研究该基因对中华稻蝗蜕皮发育的影响。【结果】在中华稻蝗转录组数据库中搜索获得2条几丁质脱乙酰基酶基因的cDNA全长序列，生物学软件分析其氨基酸，发现2条序列均具有信号肽，开放阅读框包含3个几丁质脱乙酰基酶保守区域：几丁质结合区（ChBD）、低密度脂蛋白受体区（LDLa）和几丁质脱乙酰基催化结合域（CDA）。聚类分析表明2条序列分别与所选用的5种昆虫CDA2聚为一支。剪切子聚类分析发现2条序列分别与5种昆虫CDA2a和CDA2b相聚为一支，综合序列分析和聚类结果，认为所获得的序列属于几丁质脱乙酰基酶2基因的2个不同剪切子，分别命名为OcCDA2a和OcCDA2b。定量PCR分析表明OcCDA2a和OcCDA2b均在中华稻蝗表皮、前肠和后肠中高表达；在5龄第1天的表皮中表达量较高，之后逐步下降，蜕皮前又略有上升；RNAi研究发现5龄第2天的若虫注射dsOcCDA2a或dsOcCDA2b 24 h后，与注射dsGFP的对照相比，目的基因表达量显著降低，沉默效率分别为96.72%和80.43%；进一步观察试虫的表型，与对照组相比，注射dsOcCDA2和dsOcCDA2a的大多数虫体出现龄期延长，脊线开裂，旧表皮不能顺利剥离而导致虫体扭曲，最终死亡。少数若虫在蜕皮前死亡，未出现异常表型，部分若虫虽蜕至成虫，但四肢无力，行动缓慢。死亡率分别达到87.5%和94.4%；注射dsOcCDA2b的试虫无可见表型，可正常蜕皮发育至成虫。【结论】中华稻蝗几丁质脱乙酰基酶2基因具有2个剪切子，分别为OcCDA2a和OcCDA2b。OcCDA2a参与虫体蜕皮，对其生长发育起着重要的作用，该基因的沉默导致中华稻蝗因蜕皮困难而死亡，而OcCDA2b对中华稻蝗的生长发育没有影响。

飞蝗几丁质合成酶2基因的表达特性、功能及调控

刘晓健, 崔淼, 李大琪, 张欢欢, 杨美玲, 张建珍

中国农业科学. 2014, 47(7):  1330-1340.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.07.010

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【目的】几丁质合成酶（chitin synthase，CHS）是昆虫几丁质合成过程中的关键酶之一，由于高等动物不存在该酶，而被认为是设计安全高效杀虫剂的潜在靶标。论文在已克隆得到飞蝗几丁质合成酶2基因cDNA序列（LmCHS2，GenBank登录号：GU067731）的基础上，进一步深入探讨该基因在不同发育时期的表达特性、功能及调控，为基于RNA干扰技术的飞蝗有效控制提供科学依据。【方法】根据已知LmCHS2 基因核苷酸序列，设计特异性表达引物，运用RT-qPCR技术研究该基因在卵、若虫及成虫期的表达特性；体外合成LmCHS2的dsRNA后，分别注射至成虫期第1天的雌虫和雄虫，收集第5天的中肠样本提取RNA，反转录成cDNA后，采用RT-qPCR方法检测LmCHS2沉默效果。解剖飞蝗整个肠道后，观察中肠的形态变化及围食膜的完整性，探讨该基因在成虫期的生物学功能；饥饿处理飞蝗不同时间后，再重新进食，观察试虫肠道的变化，进一步运用RT-qPCR技术检测LmCHS2的表达。【结果】LmCHS2在飞蝗卵发育的前期和中期几乎没有可检测到的表达，卵发育后期表达量急剧上升，在4龄、5龄若虫和成虫期稳定表达；分别对羽化后第1天的雌、雄成虫注射dsCHS2，与对照组相比，处理组试虫LmCHS2表达量均显著下降，且取食量明显减少，雌虫和雄虫死亡率分别达78%和85%；解剖消化道后发现，注射dsCHS2后飞蝗中肠几乎不含有食物，中肠和胃盲囊长度显著缩短；对中肠的组织学观察结果表明对照组飞蝗围食膜发育完整，而注射dsCHS2后围食膜被严重破坏甚至缺失；饥饿处理飞蝗48 h后，与对照组相比，饥饿组中肠几乎不含有食物，长度亦显著缩短。H&E染色结果表明，饥饿组围食膜被严重破坏，对照组围食膜结构完整，与RNAi的结果非常相似；重新进食后围食膜发育良好；饥饿处理24 h和48 h后LmCHS2的表达被显著抑制，重新进食0.5 h后，其表达量快速上调，表明进食影响LmCHS2的表达。【结论】LmCHS2参与中肠围食膜的形成，对飞蝗的生长发育至关重要，该基因的沉默影响中肠围食膜的完整性，使飞蝗对食物的消化吸收困难，最终因饥饿而死亡；此外，该基因的表达受飞蝗进食的调控。

亚洲玉米螟两种漆酶基因OfLac1和OfLac2 cDNA 的克隆及基因表达

陈鹏, 屈明博, 杨君, 杨青

中国农业科学. 2014, 47(7):  1341-1350.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.07.011

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【目的】克隆亚洲玉米螟（Ostrinia furnacalis）漆酶-1（OfLac1）和漆酶-2（OfLac2）基因；研究OfLac1和OfLac2在亚洲玉米螟不同发育阶段和不同组织中的表达特异性；分析蜕皮激素处理亚洲玉米螟后OfLac1和OfLac2基因表达量的变化；比较OfLac1和OfLac2表达模式的差别，推测其生理功能。【方法】根据已知的其他昆虫中Lac-1和Lac-2的保守氨基酸序列分别设计引物，以亚洲玉米螟白蛹时期提取的RNA反转录合成的cDNA为模板，通过PCR扩增OfLac1和OfLac2的保守区。然后根据所得的保守区片段分别设计基因特异性引物，采用RACE方法分别克隆OfLac1和OfLac2的3′和5′端序列，通过拼接获得OfLac1和OfLac2的基因全长。收集5龄第4天亚洲玉米螟的表皮、中肠、脂肪体、丝腺、气管、马氏管、精巢7种不同组织材料，通过半定量PCR分析OfLac1和OfLac2在不同组织中的基因表达模式。收集从卵到成虫29个不同生长发育时期的亚洲玉米螟作为材料，采用实时荧光定量PCR分析OfLac1和OfLac2在不同发育时期的基因表达水平。选取5龄第2天亚洲玉米螟幼虫进行蜕皮激素注射，分别在1、4、8、12和24 h后取样，利用实时荧光定量PCR研究OfLac1和OfLac2在蜕皮激素诱导下的基因表达水平。【结果】克隆获得亚洲玉米螟OfLac1和OfLac2的 cDNA序列。OfLac1全长3 065 bp，其中5′非编码区222 bp，3′非编码区440 bp，开放阅读框2 403 bp，共编码800个氨基酸，其编码的蛋白分子质量约为90.6 kD，理论等电点pI为5.34；OfLac2全长3 405 bp，其中5′非编码区162 bp，3′非编码区960 bp，开放阅读框2 283bp，共编码760个氨基酸，其编码的蛋白分子质量约为84.0 kD，理论等电点pI为6.43。通过SignalP分析发现，OfLac1在N端包含一个长为22个氨基酸的信号肽，OfLac2在N端包含一个长为23个氨基酸的信号肽，均为分泌蛋白质。基因表达模式分析表明，在发育过程中，OfLac1主要在成虫中表达，在其他发育时期表达量较低；OfLac2在每个幼虫龄期的末期表达水平上调，在幼虫化蛹过程中的预蛹期表达量最高；在不同组织中，OfLac1在马氏管和中肠中表达量最高，在气管和表皮中的表达量较低，在精巢、丝腺和脂肪体中几乎不表达；OfLac2在中肠和丝腺中表达量最高，在气管和表皮中的表达量较低，在精巢、马氏管和脂肪体中几乎检测不到表达。将蜕皮激素20E注射到亚洲玉米螟体内，OfLac1在注射24 h后表达量明显上调，OfLac2在注射12 h后表达量开始上调，在24 h后上调最明显。【结论】克隆得到亚洲玉米螟两种漆酶OfLac1和OfLac2的cDNA序列。两种漆酶基因的表达模式存在明显差别，但都受蜕皮激素的调控。OfLac2可能参与蜕皮过程表皮褐化。

甜菜夜蛾UAP的克隆、时空表达及RNAi研究

陈洁, 陈宏鑫, 姚琼, 张文庆

中国农业科学. 2014, 47(7):  1351-1361.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.07.012

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【目的】在昆虫中，几丁质的合成对于其生长发育至关重要，虽然几丁质合成通路在真菌中的研究比较深入，但是在昆虫中，目前大多数的研究都集中在海藻糖酶和几丁质合成酶方面，而对于通路上其他基因的研究却非常少。论文旨在阐明昆虫几丁质合成通路中的UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶（UAP）对甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）几丁质合成酶基因和害虫存活的影响。【方法】以甜菜夜蛾5龄第1天幼虫的cDNA为模板，通过简并引物扩增出甜菜夜蛾UAP基因（SeUAP）的中间片段，然后利用特异性引物和RACE技术扩增出3′和5′ race序列，拼接得到cDNA全长。随后提取甜菜夜蛾各组织和各龄期的总RNA，并通过RT-PCR方法分析SeUAP在各个组织和龄期的表达情况。最后通过向甜菜夜蛾5龄第1天的幼虫注射dsUAP观察其生长状况，检测RNAi的效率以及对几丁质合成通路下游基因的影响。【结果】获得全长为2 098 bp的SeUAP cDNA，编码一个491个氨基酸残基的蛋白，与双翅目昆虫致倦库蚊、埃及伊蚊、黑腹果蝇和冈比亚按蚊的UAP亲缘关系较近。该基因在表皮和卵巢中大量表达，在气管和中肠中的表达次之，在马氏管中表达微弱，在脂肪体中则基本检测不到其转录本的存在。该基因在甜菜夜蛾生长发育的各个阶段均有表达，在卵的整个阶段、L22（幼虫2龄第2天）、L31、L42、L51、P0、P5、P7以及A3这些天中的表达量较高，其余天数表达量较低，其表达的高峰主要出现在几丁质需求量较高的时期。RNAi结果表明，通过向甜菜夜蛾5龄第1天的幼虫注射5 µg dsRNA，导致部分甜菜夜蛾出现蛹期畸形及死亡，并出现两种畸形现象：（1）虫体腹部蛹壳已基本形成并已硬化，但头部蛹壳形成有障碍，化蛹时无法突破旧表皮；（2）虫体头部蛹壳形成正常，也能正常突破旧表皮，但蜕皮过程仅到此为止，无法正常进行下去。定量PCR结果显示SeUAP的沉默对几丁质合成酶A基因（SeCHSA）下调不明显，而对几丁质合成酶B（SeCHSB）的表达有明显下调作用。【结论】UAP可以影响几丁质合成通路的下游基因并对甜菜夜蛾幼虫-蛹的生长发育起一定作用。

土壤肥料·节水灌溉·农业生态环境

不同水氮供应对小南瓜根系生长、产量和水氮利用效率的影响

刘世全，曹红霞，张建青，胡笑涛

中国农业科学. 2014, 47(7):  1362-1371.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.07.013

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【目的】针对西北半干旱区温室蔬菜灌水施氮不合理等问题，通过不同灌水施氮水平处理，探讨作物根系生长与分布、产量和水氮高效利用与水氮供应的关系，揭示根系生长分布对灌水施氮模式的响应机制，为提高蔬菜作物产量和水氮利用效率提供科学依据。【方法】采用不同施氮灌水处理的田间试验，以“金童”小南瓜为供试作物，设置3个总灌水量水平：常规灌水（高水W3、1 500 m3•hm-2）、常规灌水减27%（中水W2、1 100 m3•hm-2）、常规灌水减54%（低水W1、700 m3•hm-2）和3个施氮量水平：常规施氮（高氮N3，350 kg•hm-2）、常规施氮减28.5%（中氮N2，250 kg•hm-2）、常规施氮减57%（低氮N1，150 kg•hm-2），试验采用完全随机区组设计，共9个处理，研究膜下滴灌不同水氮供应对温室小南瓜根系生长分布、产量和水氮利用效率的影响。【结果】小南瓜90%根系主要集中在0—40 cm土层，且随土层深度的增加，根系密度呈指数下降；当灌水量相同时，低水（W1）和中水（W2）处理根系长度、产量、水分利用效率（WUE）均随施氮量的增加先增加后减少，而高水（W3）处理根系长度随施氮量的增加而增加，不同施氮量处理小南瓜产量差异不显著；与高氮（N3）处理相比，低氮（N1）和中氮（N2）处理小南瓜根系长度、产量随灌水量增加而增加，当灌水量超过1 100 m3•hm-2时，小南瓜根系长度和产量均有所下降；随着灌水量增多，水分利用效率亦显著下降，低水中氮（W1N2）处理水分利用效率最高，为35.59 kg•m-3；灌水量较高（W2和W3）时，氮素利用率（NUE）均随施氮量增加而显著降低，灌水量较低（W1）时，低氮和中氮处理氮素利用率显著高于高氮处理；灌水和施氮对小南瓜总根长作用表现为：氮素作用＞水分作用＞水氮交互作用；细根（直径小于2 mm根系）根长随灌水量和施氮量增加呈抛物线型变化；小南瓜产量与细根根长和根表面积之间均有显著的线性关系。【结论】灌水和施氮过高或过低均可以导致小南瓜产量、水氮利用效率以及根系各项特征参数显著降低，中水中氮（W2N2）处理小南瓜产量和根系各项特征参数均达到最大值;不同水氮处理主要通过对细根根长的影响进而影响小南瓜的产量。综合考虑产量、水氮利用效率以及根系生长分布，灌水量为1 100 m3•hm-2、施氮量为250 kg•hm-2为小南瓜较优的灌水施氮组合。

日照和蒸散发量对微藻生长的影响

冯婷, Shu GENG, 吴华南, 石萍

中国农业科学. 2014, 47(7):  1372-1378.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.07.014

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【目的】微藻是可以进行光合作用的水生生物，不仅可用作为生产生物柴油的原料，同时也可用于生产高蛋白食物和动物饲料等。微藻生长不与陆生植物竞争土地资源，其整体应用对可持续农业发展的潜力巨大。高产量微藻养殖对微藻整体产业发展至关重要，以室外硅藻养殖为实例，探讨生长阶段光照和需水量等要素与产量的关系，为大规模养殖管理提供指导。【方法】利用深圳兆凯生物能源研究中心室外硅藻养殖平台，研究硅藻养殖的适宜设备和生长条件，收集开放式光反应器硅藻养殖系统生长阶段的每日产量数据；同时从深圳市气象局和深圳大学城北大气象观测站收集相应的温度、光照、湿度等气象资料。通过光合作用模型量化硅藻生长的光照需求，同时利用SIMMETEO模型结合温度、光照、湿度等气象要素模拟硅藻生长过程的日蒸散发量。最终通过统计分析建立光照、水分需求量和硅藻产量的关系模型，研究其对硅藻生长的影响。【结果】在年均温度较高的地区，相较于太阳辐射等气象因素，温度对硅藻日产量的影响相对较小，其线性拟合优度R²=0.464。太阳辐射对硅藻日产量影响显著，其线性拟合优度R2=0.656。同时，太阳辐射与蒸散发量有显著相关性，其sigmoidal曲线拟合优度达0.962。当每日太阳辐射值为9.67—12.67 MJ•m-2时，其对硅藻的蒸散发量影响最大；当每日太阳辐射值超过12.67 MJ•m-2时，硅藻的日蒸散发量不再随太阳辐射增大而增加，维持在4.63 mm左右，表明该生长系统的水分需求已达饱和。蒸散发量实际代表硅藻生长阶段的水需求量，硅藻日产量与日蒸散发量的线性拟合优度R2=0.637，表明蒸散发量对硅藻生长也有显著影响，硅藻生长需要适当的水分供给，当水分供给受限，不能满足生长需求，产量增长则受到限制；同时，硅藻生物量的增加也会导致水需求量的不断增大，以满足生理生化过程。【结论】太阳辐射和蒸散发对微藻生长有显著影响，是提高微藻产量时必须考虑的重要因素。硅藻需水量相比光照需求，更易量化和控制，研究硅藻的蒸散发量可以明确硅藻实际生长过程中的水分需求，为有效地进行水分供给提供依据，可应用为微藻养殖供水管理方面的有效工具。

园艺

‘亚历山大’葡萄果实单萜生物合成相关基因转录及萜类物质积累规律

孙磊1, 朱保庆2, 孙晓荣1, 许晓青3, 王晓玥1, 张国军1, 闫爱玲1, 徐海英1

中国农业科学. 2014, 47(7):  1379-1386.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.07.015

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【目的】检测‘亚历山大’葡萄果实中萜类物质的种类和含量，分析果实发育过程中单萜类物质的积累与相关基因表达的关系，为揭示玫瑰香型葡萄香气物质的积累规律和香味育种奠定基础。【方法】从果实转色后至成熟期，每周取样一次，每次随机取样80—100粒，去籽去梗后榨汁，离心取上清液用于香气物质测定，使用顶空固相微萃取方法萃取样品中的挥发性成分，对采集到的质谱图用NIST 05谱库检索，并根据已有标样的色谱保留时间和保留指数，确定香气成分的化学组成，利用已有的化合物制备标准曲线进行定量。根据DXS的ORF序列设计引物，以充分成熟的样品RNA反转录获得的cDNA为模板，通过多次独立PCR扩增获得‘亚历山大’DXS的ORF片段，根据测序结果分析单核苷酸多态性位点。根据萜类生物合成途径中的8个关键酶基因序列设计引物，使用Ubiquitin，EF1-α和GAPDH 3个看家基因做为内参，进行实时定量PCR，检测这些基因的转录丰度。【结果】从转色后至成熟期，在检测到的所有单萜中里那醇和香叶醇的含量远高于其它单萜，多种萜类浓度逐渐上升，其中里那醇、月桂烯、柠檬烯上升6—8倍，香叶醇、萜品醇、香叶醛和萜品油烯上升2—3倍，玫瑰醚和橙花醛含量变化较小，果实中里那醇、香叶醇、氧化玫瑰和月桂烯的含量高于嗅闻阈值。在单萜生物合成早期途径中，DXS1的表达从转色开始缓慢上升，在花后15周迅速上调，上升约5倍。DXS3则从12周开始迅速上升。DXR表现出波动变化规律。HDR的表达量在前期合成酶基因中是最高的，能达到DXS1、DXS3、DXR的10—20倍；在合成途径中期的2个基因FPPS和GPPS，从转色后至成熟期表达量持续上调，FPPS的表达量上升了4倍，GPPS的表达量上升了2倍；在合成途径的后期，Liner-syn和Terp-syn在花后的11—15周都出现表达量升高，所有基因在花后17周出现明显的表达下降。单萜总量从花后12—16周迅速积累，这与同期DXS3、DXR、HDR、GPPS、FPPS的表达上调的趋势相一致。通过相关性分析结果显示萜类总量与DXS3的相关系数为0.831。‘亚历山大’DXS1的cDNA的开放阅读框全长2 151 bp，编码716个氨基酸，通过多次独立克隆后对测序结果进行比对，在该序列中发现了16个单核苷酸多态性位点，导致4个位置编码的氨基酸发生变化。【结论】单萜合成途径中多个关键酶基因后期表达上调，导致成熟过程中单萜化合物含量上升2—8倍，DXS3与单萜总量的积累具有显著的相关性。

枇杷质膜水孔蛋白基因EjPIP1的克隆及AM真菌对其表达的影响

张燕1, 2, 李娟3, 姚青1, 陈杰忠1, 胡又厘1

中国农业科学. 2014, 47(7):  1387-1396.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.07.016

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【目的】克隆‘早钟6号’枇杷（Eriobotrya japonica ‘Zaozhong 6’）的一个质膜水孔蛋白（plasma membrane intrinsic protein，PIP）基因，分析其序列特征，研究接种丛枝菌根（Arbuscular mycorrhizal，AM）真菌对枇杷水分利用效率（water use efficiency，WUE）及对质膜水孔蛋白基因表达模式的影响。【方法】以‘早钟6号’枇杷实生苗为材料，通过盆栽试验，设置2个处理（AM和NM），5个重复，利用光合测定系统对叶片水平上水分利用效率进行测定；采用RT-PCR和RACE技术克隆该基因的cDNA全长，结合生物信息学软件对其序列特征进行分析，利用实时荧光定量PCR（Real time-PCR）分析接种AM真菌后该基因在枇杷叶片和根中的表达模式。【结果】在有效的光合同化时间（7：00—17：00）内，接种AM真菌显著的提高了枇杷的水分利用效率。克隆得到枇杷质膜水孔蛋白基因EjPIP1（GenBank登录号：JX041627），cDNA全长为1 142 bp，编码区含861 bp，共编码286个氨基酸。氨基酸序列分析表明，EjPIP1具有水孔蛋白家族高度保守的2个NPA（Asn-Pro-Ala，天冬氨酸-脯氨酸-丙氨酸）基序。同源性分析显示，枇杷EjPIP1氨基酸序列与已报道的苹果（Malus domestica）、桃（Prunus persica）和智利草莓（Fragaria chiloensis）等高等植物的氨基酸序列同源性很高，分别为97%、92%和90%。Real time-PCR分析结果证实，EjPIP1在枇杷叶片和根中均有表达，并且叶片中的相对表达量略高于根中。正常供水条件下，接种AM真菌后，该基因在根中表达上调，在叶片中表达下调。【结论】接种AM真菌提高了‘早钟6号’枇杷叶片水平上水分利用效率。从枇杷叶片中克隆得到了一个质膜水孔蛋白类的基因EjPIP1，实时荧光定量PCR分析表明该基因在枇杷叶片和根中表达受AM真菌的影响，该基因的表达模式有利于提高AM植株的水分利用效率。

贮藏·保鲜·加工

不同干燥方法对紫薯干燥效率及品质的影响

李文峰, 肖旭霖

中国农业科学. 2014, 47(7):  1397-1408.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.07.017

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【目的】为了提高紫薯干燥效率及干制品质，研究不同干燥方法对紫薯水分散失、色泽、花青素、酚类化合物及抗氧化能力的影响。【方法】采用穿流式热风干燥、鼓风干燥、气体射流冲击干燥及低氧气体射流冲击干燥4种干燥方式处理紫薯。首先探讨了穿流式热风干燥、鼓风干燥和气体射流冲击干燥3种干燥方式分别在干燥风温70℃，物料切片厚度1.93 mm以及微波预处理3 min的条件下对紫薯干燥曲线、干燥速率曲线及有效水分扩散系数的影响。其次探讨了穿流式热风干燥、鼓风干燥、气体射流冲击干燥和低氧气体射流冲击干燥4种干燥方式在干燥风温70℃，物料切片厚度1.93 mm以及微波预预处理3 min的条件下对紫薯干燥后的色泽、总花青素含量、总酚含量及酚类化合物对DPPH•清除率的影响。最后探讨了不同低氧气体射流冲击干燥风温、风速、喷嘴高度和切片厚度4个因素对紫薯干燥后的色泽、总花青素含量、总酚含量及酚类化合物清除DPPH•的影响。【结果】紫薯与大多数食品原材料在干燥过程中的水分散失规律相似。紫薯的气体射流冲击干燥、鼓风干燥和穿流干燥均属于降速干燥，物料在整个干燥过程中未有明显的恒速干燥阶段。气体射流冲击干燥最高干燥速率比鼓风干燥高84.04%，比穿流干燥高61.60%。紫薯在气体射流冲击干燥过程的前40 min内水分含量快速降低，在之后的干燥过程中水分含量却以非常缓慢的速率下降。鼓风干燥、穿流干燥和气体射流冲击干燥的有效水分扩散系数分别为9.62×10-9、10.23×10-9和15.02×10-9 m2•s-1。本研究所选鲜紫薯的总花青素含量为90.85 mg•100g-1，总酚含量为262.14 mg•100g-1，紫薯酚类化合物对DPPH•的清除率为40.84%。低氧气体射流冲击干燥比普通气体射流冲击干燥、鼓风干燥和穿流式热风干燥具有更好的干后色泽和更高总花青素含量、总酚含量及DPPH•清除率。经低氧气体射流冲击干燥后的紫薯色差值为20.35，总花青素含量为34.79 mg•100g-1，总酚含量为139.26 mg•100g-1以及酚类化合物对DPPH•的清除率为28.49%。在探讨不同低氧气体射流冲击干燥条件对紫薯品质的影响试验中，紫薯的总花青素含量、总酚含量及DPPH•清除率随着干燥风温的增加以及随着干燥风速、喷嘴高度、切片厚度的降低而降低。而色差值却随着低氧气体射流冲击干燥的风温增加及风速、喷嘴高度、切片厚度的降低而增加。且干燥后紫薯的总花青素最高保存率为59.58%，最高总酚保存率为82.35%，最高抗氧化活性保存率为82.05%。【结论】紫薯的气体射流冲击干燥与鼓风干燥和热风干燥相比具有更高的干燥效率和干后品质，且采用低氧气体射流冲击干燥可在普通气体射流冲击干燥的基础上进一步提高紫薯的干后品质。

畜牧·兽医·资源昆虫

三河牛目标性状边际效益研究

马秋萌1, 2, 秦春华1, 3, 吴宏军4, 刘爱荣5, 王雅春1, 史远刚2, 张胜利1

中国农业科学. 2014, 47(7):  1409-1416.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.07.018

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【目的】三河牛是1983年验收的中国自主培育的乳肉兼用牛品种，因起源于内蒙古呼伦贝尔市三河地区而得名，具有耐粗饲、宜牧、抗寒、适应性强的特点。研究旨在估计三河牛目标性状的边际效益，为制定三河牛育种规划提供基础。【方法】依据内蒙古谢尔塔拉种牛场三河牛中心产区2011年的生产和育种数据，参照奶牛和肉牛营养需要获得三河牛的生产性能、市场经济、营养学方面的参数，根据三河牛生产和育种体系，确定三河牛育种目标性状，以效益方程法建立三河牛的生物经济利润模型，计算三河牛乳用性状、肉用性状、功能性状的边际效益，并对影响经济效益的各个因素进行了敏感性分析。【结果】（1）确定了三河牛10个育种目标性状，包括3个乳用性状（产奶量，乳蛋白率和乳脂率），3个肉用性状（初生重，育肥期日增重和屠宰率）和4个功能性状（首次产犊日龄，产犊间隔，体细胞数和母牛使用年限）：（2）牛群规模固定时，三河牛的总效益为4 808.26元。对收益进行分类，产奶和淘汰母牛的收益分别占总收益的67.08%和7.8%，育肥牛的收益占总收益的20.58%。成本方面，可变成本占总成本的96.89%，其中饲养费用是影响可变成本的主要因素，青年母牛、泌乳母牛和育肥公牛的饲养成本分别占总成本的45.69%、20.46%和13.15%；（3）以乳成分和质量（乳脂率、乳蛋白率、体细胞数）定价时，三河牛10个目标性状的边际效益为：产奶量（kg）2.26元、乳脂率（%）40.48元、乳蛋白率（%）61.39元、体细胞数-231.52元、初生重（kg）6.19元、育肥期日增重（g•d-1）1.39元、屠宰率（%）76.70元、使用寿命（天）0.25元、首次产犊日龄（天）-1.62元、产犊间隔（天）-2.71元；（4）乳用性状、肉用性状、功能性状的相对经济权重比例为62﹕14﹕22，近似于3﹕1﹕1的比例。（5）牛奶价格提高10%，产奶量和产犊间隔的边际效益分别增加0.29元和0.17元；牛肉价格提高10%，初生重、育肥期日增重、屠宰率、产犊间隔的边际效益分别增加0.81元、0.15元、7.86元，使用年限的边际效益降低0.03元；饲料价格提高10%，产奶量、乳脂率、乳蛋白率、初生重、首次产犊日龄、育肥期日增重的边际效益分别降低0.05元、0.58元、0.34元、0.21元、0.16元、0.01元，产犊间隔和生产寿命的边际效益分别增加0.88元、0.06元。【结论】市场价格的变动对三河牛乳用性状和肉用性状的边际效益影响较大。研究构建的生物经济利润模型可为在中国实施兼用牛选育提供参考，为制定三河牛育种体系的育种目标提供依据。

徐淮山羊多能性转录因子mRNA制备及在成纤维细胞中的表达

邱峰龙, 张亚妮, 倪蓉, 李伟, 陈庭锋, 韦光辉, 李碧春

中国农业科学. 2014, 47(7):  1417-1426.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.07.019

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【目的】克隆徐淮山羊多能性转录因子Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc的CDS片段，构建pMD19-T-oct4、pMD19-T-sox2、pMD19-T-klf4和pMD19-T-c-myc重组质粒，随后构建含T7启动子的pcDNA3-oct4、pcDNA3-sox2、pcDNA3-klf4和pcDNA3-c-myc重组质粒，通过体外转录，获得该4种多能性转录因子的mRNA，并使其在徐淮山羊成纤维细胞中稳定表达。【方法】应用RT-PCR方法分别从徐淮山羊睾丸组织、皮肤组织、小肠组织中扩增多能性转录因子Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc基因编码全序列，将该4种基因分别克隆到pMD19-T载体，构建pMD19-T-oct4、pMD19-T-sox2、pMD19-T-klf4和pMD19-T-c-myc重组质粒。然后将pcDNA3.0载体和pMD19-T重组载体双酶切后用T4连接酶连接，构建含有T7启动子的真核表达载体pcDNA3-oct4、pcDNA3-sox2、pcDNA3-klf4和pcDNA3-c-myc重组质粒。各重组质粒分别用限制性内切酶XhoI、XbaI单酶切，酶切后质粒模版按照体外转录试剂盒说明体外转录获得各多能性转录因子的mRNA，并对获得的mRNA进行检测，确定其稳定性和浓度。按照脂质体（体积）﹕mRNA（质量）为1﹕1的比例用脂质体2000转染。转染24 h后，利用Western blot技术、间接免疫荧光实验检测徐淮山羊多能性转录因子Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc基因的mRNA在成纤维细胞中的表达。【结果】①克隆得到的徐淮山羊Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc基因编码序列全长分别为1 083、962、1 434和1 320 bp，并经TA克隆测序验证，其CDS 序列与绵羊、人、牛和猪等的序列相似性在89%以上；②体外转录获得的4种多能性转录因子的mRNA经脂质体转染徐淮山羊成纤维细胞，在成纤维细胞中均定位于细胞核；③4种多能性转录因子的mRNA在徐淮山羊成纤维细胞中表达的蛋白与预期大小一致，分别为38、34、50和48 kd。【结论】成功克隆了徐淮山羊Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc基因，该4种多能性转录因子的mRNA能够在徐淮山羊成纤维细胞中稳定表达，为进一步研究Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc基因的功能和山羊体细胞的重编程奠定基础。

植物甾醇对肉仔鸡的生物安全性评价

王黎文2, 江勇1, 解竞静1, 吕林1, 张丽阳1, 索海青1, 罗绪刚1

中国农业科学. 2014, 47(7):  1427-1437.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.07.020

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【目的】研究饲粮添加不同植物甾醇水平对1—21和22—42日龄AA肉仔鸡生长性能、血液生理指标、血浆生化指标及对42日龄肉仔鸡器官发育和组织病理学变化的影响，从而评价植物甾醇对肉仔鸡饲用的生物安全性。【方法】试验采用单因子完全随机设计。选用240只1日龄AA肉仔鸡（公母各半），按平均体重随机分为4个处理组，每个处理组60只鸡（公母各半），分为6个重复笼饲养，每个重复笼10只鸡，公母各5只。分别饲喂含植物甾醇300 mg•kg-1 的基础饲粮和在基础饲粮中分别添加植物甾醇为80、400和800 mg•kg-1的试验饲粮。试验期为42 d，分为两个阶段：1—21日龄和22—42日龄。用SAS9.0软件中一般线性模型对试验数据进行方差分析。【结果】饲粮添加植物甾醇对肉仔鸡前期（1—21日龄）日增重、采食量、耗料增重比和死亡率及对肉仔鸡后期（22—42日龄）日增重、耗料增重比和死亡率无显著影响（P＞0.05），但对肉仔鸡后期的采食量有显著影响（P＜0.05），400 mg•kg-1处理组肉仔鸡后期的采食量明显低于对照组和80 mg•kg-1添加组（P＜0.05）；饲粮中添加植物甾醇对21日龄肉仔鸡多数血浆生化指标和42日龄肉仔鸡生化指标无显著影响（P＞0.05），但对21日龄血浆总蛋白、白蛋白、谷丙转氨酶活性和肌酐浓度有显著影响（P＜0.05），添加800 mg•kg-1植物甾醇显著提高21日龄肉仔鸡血浆总蛋白、白蛋白浓度和谷丙转氨酶活性（P＜0.05）；添加400 mg•kg-1植物甾醇降低21日龄肉仔鸡血浆肌酐浓度（P＜0.05）；饲粮中添加植物甾醇除对42日龄肉仔鸡胰脏相对重量有显著影响外（P＜0.05），对其他器官相对重量无显著影响（P＞0.05），80和400 mg•kg-1添加组42日龄鸡胰脏相对重量明显高于对照组（P＜0.05）；饲粮中添加植物甾醇对21日龄和42日龄肉仔鸡血红蛋白浓度和红细胞压积无显著影响（P＞0.05）。另外，42日龄肉仔鸡的重要器官均未观测到组织病理学变化。【结论】饲粮添加80—800 mg•kg-1的植物甾醇水平对肉仔鸡多数生长性能指标、血液主要生理指标、血浆系列生化指标和脏器发育均无不良影响，鸡只均未出现毒性反应；因此，在玉米-豆粕型基础饲粮中的本底植物甾醇含量约为300 mg•kg-1的条件下，肉仔鸡饲粮中植物甾醇的最高添加量定为80 mg•kg-1，即饲粮中总植物甾醇含量为400 mg•kg-1对肉仔鸡饲用是安全的。

伊维菌素和三氯苯达唑在羊体内的药动学相互作用

高妍妍1, 巴雅尔2, 哈斯苏荣1

中国农业科学. 2014, 47(7):  1438-1444.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.07.021

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【目的】研究联合应用伊维菌素和三氯苯达唑在蠕虫感染绵羊体内的药代动力学特征及相互影响，【方法】借助经典麦克麦斯特法定量检查羊群消化道蠕虫感染基础上选取每克粪便虫卵数大于1500个，且感染强度相近的泌乳期鄂尔多斯细毛羊15只，平均体重为（39.3±3.2）kg，年龄为4周岁。将15只受试羊禁食8 h后随机分成3组，按照预定试验设计给予不同药物：第1组皮下注射伊维菌素（0.2 mg•kg-1），第2组灌服三氯苯达唑混悬液（12 mg•kg-1），第3组皮下注射伊维菌素（0.2 mg•kg-1）的同时灌服三氯苯达唑混悬液（12 mg•kg-1）。分别于给药后第0.75、2、4、8、16、24、36、48、72、120、192和336 h，由颈静脉采集5 mL血样，离心分离血浆，冷冻保存待测。建立检测血浆伊维菌素（IVM）、三氯苯达唑（TCBZ）及其主要活性代谢产物三氯苯达唑亚砜（TCBZSO）浓度的高效液相色谱（HPLC）荧光检测法和紫外检测法，并对每个样品进行甲醇沉淀蛋白，经ODS C18固相萃取柱进行纯化处理后，分别测定各组血浆样品中的IVM、TCBZ及其主要代谢产物TCBZSO的浓度。色谱条件：反相C18柱，InertsilODS-SP(5 µm，4.6×150 mm，I.D.)；流动相为V(甲醇+乙腈)﹕V(水)=95﹕5；激发波长364 nm，发射波长470 nm；流速为1.0 mL•min-1；柱温为室温；进样量为20 µL。最后将测定血药浓度数据用Phoenix WinNonlin药动学软件按非房室模型方法处理，计算出各试验组每只羊的相关药动学参数，并进行统计学分析。 【结果】血浆样品色谱图中IVM和内标物AVM色谱峰分离良好，保留时间分别为8.73 min和6.16 min，且不受血浆其他干扰峰的影响；TCBZ和TCBZSO以及内标物甲苯咪唑的保留时间分别为10.04、5.53和3.42 min，且在试验分析条件下具有良好的分离度，血浆内源性物质对目标峰没有干扰。对HPLC检测方法的绝对回收率、精密度和准确度等的考证结果均达到色谱测定要求。因此，本试验所建立的方法切实可行，能满足测定血浆样品各目标物的检测要求。联合应用IVM和TCBZ后，IVM的血浆峰浓度(Cmax)和药时曲线下面积（AUC）极显著下降，表观分布容积（Vd）、消除半衰期（T1/2ke）和体清除率（CLb）反而极显著增加；联合用药后TCBZSO的Vd、MRT和Tmax显著高于单独用药组，T1/2ke则极显著高于单独用药组。【结论】为蠕虫感染绵羊联合应用伊维菌素和三氯苯达唑后，在药代动力学方面相互产生了负面影响，未达到联合用药的真正目的。由此可见，在临床实践中联合用药时应考虑它们的药动学相互作用问题，应避免只根据体外药效学协同作用进行盲目配伍和联合用药，从而保证充分发挥各药物的原有药效和协同作用的目的。