当期目录

2014年 第47卷 第6期 刊出日期：2014-03-15

  

作物遗传育种·种质资源·分子遗传学

棉花烟酰胺合成酶基因GbNocotin及其启动子的克隆和功能分析

杨郁文1, 周建武1, 高媛媛2, 陈天子1, 张保龙1, 倪万潮2

中国农业科学. 2014, 47(6):  1041-1050.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.06.001

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【目的】克隆棉花烟酰胺合成酶基因及其启动子，明确其表达特征，分析其在转基因育种中的应用前景。【方法】根据对一个棉花Maxxa BAC克隆（78L16）的测序结果，首先从海岛棉品种海7124中PCR扩增获得了棉花烟酰胺合成酶基因GbNocotin的启动子序列，并利用网上数据库PLACE对该序列进行调控元件的预测分析。其次构建该启动子与GUS 连接的重组载体pGbNocotin::GUS，并通过花浸染法转化拟南芥并获得转基因植株，分别在幼苗期和成熟期对转基因植株进行GUS染色分析。然后通过RT-PCR获得GbNocotin的开放阅读框（ORF）序列，并利用Mega5.0对GbNocotin进行进化树分析，最后利用实时荧光定量PCR（Real Time PCR）对该基因进行组织表达，诱导表达分析。【结果】GbNocotin的启动子区为1.8 kb，通过相似性比较预测发现该启动子含有1个专一性Fe缺乏诱导元件IRO2OS，还含有干旱、重金属、病原物等逆境响应元件以及植物激素响应元件等。对转化pGbNocotin::GUS拟南芥植株的GUS染色结果表明，在幼苗期GUS基因主要在根部以及下胚轴处表达，而在成熟期除了在根部表达外，还在果荚的基部、花序以及叶柄基部表达。GbNocotin的开放阅读框含有864个核苷酸，编码287个氨基酸，该蛋白等电点为6.76，分子量为 32.7 kD。虽然在第11—286位氨基酸处具有NAS保守结构域（PFAM accession number: PF03059），但是与其他植物来源的该类基因相似性较低，与相似度最高的拟南芥的ATNAS3也仅有43%的相似性。GbNocotin的表达具有器官差异性，在根和茎中的表达最强，其次是棉纤维和花，但是在叶片及胚珠中表达量很低。另外，该基因在缺铁条件下表达量显著上升，在缺铁处理一周后棉花幼根中的表达量较对照增加9倍。而CuSO4、PEG、脱落酸（ABA）以及赤霉素（GA）处理均抑制其表达，但是抑制程度不同。尽管4种条件处理24 h后都会使GbNocotin的表达量显著降低，但是CuSO4和ABA的抑制效果最为显著。而48 h后，PEG和GA处理基因的表达量得到恢复，但是CuSO4和ABA处理表达量仍然较低。【结论】GbNocotin的表达具有器官差异性，并受铁缺失诱导以及胁迫条件抑制。该基因与棉花Fe的吸收可能密切相关，有潜在的应用价值。

转G10aroA棉花株系的获得及分子生物学鉴定

王霞1, 2, 4, 马燕斌2, 吴霞2, 沈志成3, 林朝阳3, 李朋波2, 孙璇2, 王新胜2, 李燕娥2, 李贵全1

中国农业科学. 2014, 47(6):  1051-1057.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.06.002

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【目的】培育具有抗草甘膦除草剂的棉花材料具有极其重要的意义。利用农杆菌介导法在棉花中转入编码EPSPS酶的抗草甘膦除草剂基因G10aroA，通过体细胞愈伤诱导组织培养技术获得能够稳定遗传的转基因棉花株系材料。【方法】首先，利用不同草甘膦抗性筛选条件比较分析不同棉花受体材料的愈伤诱导效率；其次，以R15材料作为受体，利用含有G10aroA的农杆菌侵染下胚轴切段，在进行体细胞愈伤诱导的组织培养过程中通过草甘膦抗性筛选获得棉花再生植株，对获得的棉花再生植株进行纯合繁育。在此基础上，利用PCR扩增检测证实外源G10aroA在转基因植株中能够稳定遗传；利用RT-PCR分析其外源基因在转基因植株不同组织中的转录水平进行研究、并进一步利用Western-blot对转基因植株中外源蛋白的表达进行分析。【结果】在优化的草甘膦筛选条件下，以草甘膦浓度为2.5 mmol•L-1的抗性条件进行棉花愈伤诱导筛选并获得棉花再生植株；利用特异引物进行PCR检测结果表明，在检测的全部再生植株中，扩增得到1.8 kb预期大小目标条带的阳性株系32株，其中，收获的27个株系的外源目标基因能够在T0、T1转基因植株中稳定遗传；对G10aroA在转基因株系L12、L14的不同组织中的转录表达进行定量RT-PCR分析表明，外源G10aroA在转基因棉花植株的不同组织中表达具有差异，相对表达量高低依次为茎、苞叶、叶和花；另外，蛋白检测结果进一步表明，该外源基因能够在转基因株系L7、L12和L14中植株中正常表达为预期46 kD的EPSPS蛋白。【结论】通过农杆菌介导法转化外源抗草甘膦基因G10aroA，在草甘膦抗性条件下进行棉花体细胞诱导的组织培养，成功获得转外源G10aroA的棉花再生株系，并通过分子生物学方法研究证实外源G10aroA能够在T0、T1转基因株系中稳定遗传、转录以及表达。

林烟草KUP/HAK/KT钾转运体基因NsHAK11的亚细胞定位与表达

宋毓峰1, 2, 董连红1, 2, 靳义荣1, 2, 史素娟1, 3, 张良1, 2, 刘朝科4, 冯祥国4, 胡晓明4, 王倩1, 刘好宝1

中国农业科学. 2014, 47(6):  1058-1071.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.06.003

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【目的】应用生物信息学方法，分离和克隆烟草钾转运体KUP/HAK/KT家族新基因，对其进行亚细胞定位和表达分析，为开展烟草KUP/HAK/KT钾转运体的研究提供借鉴。【方法】通过生物信息学方法，搜索林烟草（Nicotiana sylvestris）和绒毛状烟草（N.tomentosiformis）基因组数据库，预测两种烟草中的钾转运体KUP/HAK/KT家族成员，构建系统进化树。根据所获结果，从林烟草中获得一个新的烟草KUP/HAK/KT家族基因。采用Wolf PSORT对蛋白的亚细胞定位进行预测，并利用农杆菌浸润法注射本生烟（N.benthamiana）叶片后激光共聚焦显微镜下观察，依据融合荧光蛋白在细胞内产生荧光的位置确定蛋白的亚细胞定位，用以验证预测结果；采用PLACE网站对基因的表达模式进行预测，并用荧光定量PCR分别研究其在盛花期林烟草不同器官的表达差异及低温、高温和低钾胁迫下苗期林烟草叶片中NsHAK11的表达变化，用以验证预测结果。【结果】预测出林烟草和绒毛状烟草KUP/HAK/KT钾转运体家族均含有19个成员，进化上分为4个Cluster（簇）。根据预测序列结果，从林烟草中克隆得到一个ClusterⅢ中的基因，其编码蛋白与拟南芥（Arabidopsis thaliana）中AtKUP11的相似性最高，因此，将其命名为NsHAK11，其编码蛋白与已获得的2个烟草NrHAK1和NtHAK1的相似性仅为48%和49%，所以NsHAK11是一个新的烟草KUP/HAK/KT基因。Wolf PSORT预测显示NsHAK11主要定位于细胞质膜中。亚细胞定位试验中NsHAK11与GFP和DsRed2两种报告蛋白融合的定位结果均表明NsHAK11定位于细胞质膜中，与预测结果相符。利用PLACE网站对NsHAK11启动子分析得到，NsHAK11可表达与定位于根、花和胚芽组织中，受到低温、高温、干旱和激素等因素的影响。实时荧光定量PCR分析结果与预测结果基本一致：NsHAK11在盛花期林烟草各组织器官中均有表达，但表达水平存在强弱差异，其在主根中的表达量最高，在侧根中的表达量次之，而在叶片中的表达量最低；NsHAK11在苗期林烟草叶片中受低温、高温和低钾胁迫时呈现不同类型的上调表达，其中，低温处理时NsHAK11的表达上调程度最大且响应时间最早，高温处理时其表达上调程度次之，但在前期会出现明显抑制，低钾处理时其表达量可上调表达，但并不显著。【结论】获得了一个烟草KUP/HAK/KT基因家族新成员NsHAK11，其编码蛋白为主要定位于细胞质膜中的钾转运体，该蛋白广泛存在于各组织器官中，参与叶片响应低温、高温和低钾胁迫的应对机制。

耕作栽培·生理生化·农业信息技术

磷素对水稻根表红棕色铁膜的影响及营养效应

傅友强, 杨旭健, 吴道铭, 沈宏

中国农业科学. 2014, 47(6):  1072-1085.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.06.004

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【目的】磷饥饿能明显诱导水稻根表红棕色铁膜的形成。然而，磷素是如何诱导水稻根表红棕色铁膜形成并不清楚。【方法】论文在水培条件下，对24个不同来源的传统水稻品种培养21 d后，分别进行缺磷和0.1 mmol•L-1 Fe2+处理，测定其根长、根表面积、根系干重、地上部干重及根表铁含量，从而筛选出根表铁膜含量较高的水稻品种“天优998”，并以此为材料，设置不同养分元素缺乏试验（缺氮、缺磷、缺钾及其交互等8个处理）、分根试验（两边根系同时进行正常磷处理；一边根系缺磷处理，另一边根系正常供磷处理；两边根系同时进行缺磷处理）和不同磷铁比试验（磷浓度为0.0125—0.4 mmol•L-1；铁浓度为0.1—3.2 mmol•L-1，按磷铁比为1﹕1；1﹕3；1﹕5；1﹕8处理设计了4个小试验），测定了水稻根表铁膜浓度、根表无机磷浓度、根内无机磷浓度、根系和地上部磷、铁含量，探讨了磷素对根表红棕色铁膜形成及其营养效应。【结果】不同水稻品种根表铁膜浓度存在明显差异，24个水稻品种幼苗根表铁膜浓度范围为3.67—9.78 mg•g-1，水稻根表铁膜含量与根长、根表面积、根系干重、地上部干重呈显著的正相关。不同养分元素缺乏试验表明，水稻根表铁膜由红棕色铁膜和非红棕色铁膜组成，仅缺磷处理都能诱导水稻根表红棕色铁膜的形成，而缺氮和缺钾处理却不能。分根试验处理表明，缺磷处理根系侧并不能诱导正常供磷处理侧根系根表形成红棕色铁膜，根表红棕色铁膜形成主要受根表外源无机磷的影响，与根内无机磷无关。不同磷铁比试验表明，根表红棕色铁膜形成与根表磷铁比有关，根表DCB-Fe浓度与根系溶液中铁浓度有关；只有当磷铁比≤1﹕3时，根表才会形成明显的红棕色铁膜，随着磷铁比的降低，根表红棕色铁膜颜色加深；随着根系溶液中铁浓度的增加，根表DCB-Fe浓度逐渐增加，最大值为36.50 mg•g-1。最后进一步对磷铁比处理形成的根表红棕色铁膜水稻根系和地上部磷、铁吸收量进行测定，研究结果发现，根表红棕色铁膜的加深有利于水稻根系和地上部磷、铁的吸收。【结论】内源磷信号并不能诱导根表红棕色铁膜的形成，仅外源磷缺乏才能诱导根表红棕色铁膜的形成，根表红棕色铁膜的形成与根系周围环境中磷铁比有关，而根表DCB-Fe的形成仅与溶液中铁浓度有关。形成的根表红棕色铁膜在根系周围充当营养库的功能，有利于植物对磷、铁的吸收利用。

烟草壮苗指数模型研究

白岩1, 2, 史万华1, 邢小军3, 王勇3, 靳义荣1, 2, 张良1, 2, 宋毓峰1, 2, 董连红1, 2, 刘好宝1

中国农业科学. 2014, 47(6):  1086-1098.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.06.005

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【目的】前人对作物壮苗的研究多集中在指标筛选上，而对于量化的壮苗指数模型的建立及验证研究涉及较少，特别是关于烟草壮苗指数模型的研究尚鲜见报道，烟草育苗实际生产中，亟需探讨与制定科学评价烟草壮苗的量化指标。本研究旨在探讨建立适合于中国烟草集约化育苗的壮苗指数模型，为烟草生产规范育苗和培育壮苗提供理论依据。【方法】依据传统的壮苗标准，遵循主导性、实际性和可操作性等原则，测定烟苗株高、茎围、地上部鲜重、地下部鲜重、根系活力、叶绿素、超氧化物歧化酶、可溶性蛋白等17项素质指标，采用模糊综合评判法计算烟苗素质综合评价指数，在此基础上将各单项烟苗素质指标与综合评价指数进行相关分析，筛选几种具有代表性的素质指标，组合两种不同类型的壮苗评价指标，即相对指标（2项单项素质指标比值）和复合指标（3项以上单项素质指标组合），并利用相关分析方法将烟苗素质综合评价指数与相对指标、复合指标等分别进行相关分析，筛选出具有代表性的壮苗评价指标，建立烟草壮苗指数模型，最后将壮苗指数模型与烟苗各项素质指标参照次数分布表的编制方法进行合理分组，绘制各素质指标与壮苗指标线性关系图，得出壮苗指数模型最佳取值范围。【结果】（1）烟苗素质综合评价指数为0.26—0.80，此范围可全面地概括烟苗的整体素质，能定量、客观地评价烟苗的质量，通过总分值频率曲线法，将烟苗素质分为四级，0.71—0.80为最优壮苗级别，0.62—0.70为壮苗级别，0.41—0.61为次壮苗级别，0.26—0.40为弱苗级别。（2）单项指标和相对指标信息有局限性，不能全面地描述烟苗的整体素质，而由多项素质指标组成的复合指标，稳定性好，代表性强，其中[(茎围/株高)×总鲜重×10]复合指标与综合评价指数呈极显著相关，可作为衡量烟苗素质的壮苗指数模型。（3）17项烟苗素质指标与壮苗评价指标[(茎围/株高)×总鲜重×10]的关系分析图表明，当[(茎围/株高)×总鲜重×10]为28.57—37.05时，烟苗健壮，根系发达，通过大田验证，[(茎围/株高)×总鲜重×10]为28.57—37.05内的烟株生长发育较快，田间生长势强，根系对土壤水分和营养物质的吸收较为活跃，光合作用力大，抗逆性强，烤后烟叶品质好、经济效益可观。【结论】壮苗指数模型[(茎围/株高)×总鲜重×10]能科学地衡量烟苗素质及其生长发育状况，全面地反映烟苗各项素质指标，简单实用、方便快捷。经大田验证，当数值为28.57—37.05时，各项烟苗素质指标达到最高值，烟苗移栽后还苗快且还苗率高，各生育时期烟株农艺性状和生理生化性状好，烟叶经济效益大、品质优。

植物保护

增施矿质营养对烟草青枯病的控病效果及其作用机理

郑世燕, 丁伟, 杜根平, 杨亮, 刘晓姣, 张永强

中国农业科学. 2014, 47(6):  1099-1110.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.06.006

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【目的】研究增施Ca、Mo等矿质元素对烟草青枯病的控病效果及其对烟株体内防御酶系活性的影响，并探讨其作用机理；从控病效果、生理生化调控途径方面明确供试矿质元素中与控制烟草青枯病发生最相关的矿质营养。【方法】采用室内与田间验证相结合的方式，选择性地给烟草根外增施Ca、B、Mg、Mo 4种矿质营养，进行多重复小区试验；通过调查以叶面喷雾方式根外增施4种中微量元素后，烟草青枯病在室内和田间的发病情况，测定室内喷施4种元素后烟株体内防御酶系指标的变化、4种元素对青枯病菌（Ralstonia solanacearum）的直接抑菌作用以及处理后烟草田间各农艺性状指标的变化情况，统计分析比较不同元素对烟草青枯病的控病效果及对烟株体内防御酶的调控作用。【结果】室内试验结果表明，在保证烟株正常生长营养的基础上增施Ca、B、Mg、Mo 4种矿质元素对烟草青枯病均有一定的控病效果，Mo处理最好，其次为Ca处理，两者对烟草青枯病的发生均具有一定的推迟、延缓发病作用，病程进展曲线下面积（AUDPC）显著低于其余处理，分别比对照低300.00、244.44 (基于发病率) 和 380.56、352.78 (基于病情指数)。Mo、Ca处理对青枯病菌具有一定的直接抑制作用，处理24 h 后抑菌率最高，分别为35.93%、33.13%；对青枯病的室内最终控病效果分别为64.79%、57.67%；两处理均可显著提高感染青枯病烟株体内POD、CAT、SOD、PPO、PAL活性，分别比对照处理增加3.11、1.10、0.82、1.68、0.60倍和1.26、0.73、0.90、1.00、0.32倍；并可显著降低MDA的含量，分别降低0.50和0.26倍。田间试验结果表明，在烟草上增施Ca、B、Mg、Mo 4种矿质元素，对烟草青枯病均具有较好的控制作用，以Mo、Ca处理最好，两处理对青枯病的田间控病效果分别为49.46%—65.52%、46.80%—57.40% （2011 年）和45.28%—62.17%、42.91%—62.57% （2012 年）；此外，补充Mo、Ca矿质营养后烟草株高、最大叶宽、茎围、最大叶面积均显著高于对照处理，对田间烟草的健康生长具有明显的促进作用。【结论】烟株的营养状况与其抗病性密切相关，定期向烟株增施Mo、Ca营养可增强烟草对青枯病的防御能力并提高其抗青枯病的特性，对烟草青枯病具有明显的控病作用；这对植物病害-营养-控病模型的构建具有重要意义。

3种甜樱桃病毒PNRSV、PDV及LChV-2的多重RT-PCR检测方法的建立与应用

宗晓娟, 王文文, 魏海蓉, 王甲威, 陈新, 徐丽, 刘庆忠

中国农业科学. 2014, 47(6):  1111-1118.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.06.007

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【目的】建立可同时检测李属坏死环斑病毒（Prunus necrotic ringspot virus，PNRSV）、李矮缩病毒（Prune dwarf virus，PDV）、樱桃小果病毒2（Little cherry virus-2，LChV-2）的多重RT-PCR检测方法。【方法】以复合感染3种病毒的甜樱桃病株叶片为材料，采用CTAB法提取样本总RNA，选用随机六聚体引物对植物样本总RNA进行反转录，所得cDNA作为多重RT-PCR的扩增模板。根据GenBank中PNRSV、PDV、LChV-2基因组序列共设计6对特异引物，分别通过单一RT-PCR和多重RT-PCR筛选出可用于同时检测3种甜樱桃病毒的引物组合。对多重RT-PCR的退火温度及循环数进行优化，以筛选出各引物组合的最适扩增条件。分别以单一感染PNRSV、PDV、LChV-2、复合感染3种病毒、单一感染樱桃病毒A（Cherry virus A，CVA）及甜樱桃无毒苗为样本，对多重RT-PCR引物的特异性进行分析。选取复合感染3种病毒的甜樱桃总RNA的反转录产物为初始模板，按照梯度稀释法依次将模板稀释为2、22、23、24、25倍，在相同PCR反应体系及反应条件下分别对各引物组合的灵敏度进行分析。多重RT-PCR的扩增条带经凝胶回收试剂盒回收纯化后连接至pMD18-T vector，克隆测序，以验证多重RT-PCR检测的准确性。并应用该方法对山东泰安地区甜樱桃生产园中间隔栽培的中国樱桃进行检测。【结果】筛选到2个可以应用的引物组合，组合1“PNRSV-S1/A1、PDV-S2/A2、LChV2-S1/A1”可分别特异性地扩增733、467、337 bp的片段。组合2“PNRSV-S1/A1、PDV-S3/A3、LChV2-S1/A1”可分别扩增得到733、265、337 bp的片段。扩增产物大小与预期相符。多重RT-PCR反应条件优化结果显示，在退火温度52℃、35个循环条件下，2个引物组合的检测效果均较为理想。特异性分析结果显示，2个引物组合均能特异性检测其各自的靶病毒。灵敏度分析结果显示，2个引物组合在cDNA的23×稀释液中仍能特异性扩增，但扩增条带的强度稍有差异，其对植物总RNA的反转录产物的最低检测浓度为107.9 ng•μL-1。克隆测序及序列分析表明，2个引物组合对各自靶病毒的检测结果可靠。应用该方法对9个中国樱桃样本进行检测，结果显示，测试样品均至少感染了2种病毒，其中5个样品复合感染了3种病毒，2个样品同时感染PDV和LChV-2，2个样品同时感染PNRSV和LChV-2。【结论】应用建立的多重RT-PCR检测方法可稳定、准确、灵敏的同时检测单一或复合侵染的3种甜樱桃病毒。

果树病毒载体研究进展

周彦

中国农业科学. 2014, 47(6):  1119-1127.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.06.008

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植物病毒载体作为重要的研究工具被广泛运用于蛋白表达、基因沉默等研究，当前普遍使用的是以烟草花叶病毒载体等为代表的草本植物病毒载体，但其大多不能侵染果树，且稳定性较差，容易丢失插入的外源基因，因此该类载体无法满足果树等多年生植物研究的需要。近年来新兴的果树病毒载体可解决这些难题，为此作者对果树病毒载体的研究进展和发展方向进行综述。当前国内外取得的研究成果主要包括：（1）通过掌握柑橘衰退病毒、柑橘叶斑病毒、李痘病毒、苹果潜隐球形病毒、葡萄病毒A和葡萄卷叶伴随病毒等果树病毒的传播途径、寄主范围、致病力分化、基因功能和表达策略等特性，采用体外转录或农杆菌介导的方式获得了上述果树病毒的全长侵染性克隆。在此基础上，通过在病毒外壳蛋白基因与其邻近的上游基因之间插入外源基因（包括荧光蛋白基因和β-葡萄糖醛酸酶基因等报告基因），并用该病毒外壳蛋白基因的启动子或其他异源启动子驱动外源基因表达的方式，将上述6种果树病毒的全长侵染性克隆改造成为病毒载体；（2）运用果树病毒载体明确了柑橘衰退病毒、柑橘叶斑病毒、李痘病毒、苹果潜隐球形病毒和葡萄卷叶伴随病毒在植株中的分布、移动规律，及其在细胞中的定位。探寻了柑橘衰退病毒在大翼来檬上产生茎陷点症状的原因，以及交叉保护防治柑橘衰退病的主要机理。果树病毒载体还被作为病毒诱导的基因沉默载体用于基因功能和防病研究；（3）通过选用本地已经存在，且无虫传能力的弱毒株，以及对控制病毒致病和媒介传播能力的基因进行敲除、突变可以解决果树病毒载体研发过程中所遇到的安全风险。由于有些果树病毒仅分布于植株的韧皮部，因此限制了其作为病毒载体在植株中表达外源基因的范围，但由这类果树病毒构建的病毒载体稳定性极高，并且通过添加分泌信号肽基因等方式可以扩大表达产物在植株中的分布和作用范围，因此其在果树病毒研究方面仍然具有很高的应用价值。此外，采用不同病毒来源的异源启动子代替同源重复区来驱动外源基因的表达，可以进一步提高果树病毒载体的稳定性。

土壤肥料·节水灌溉·农业生态环境

基于土壤条件的边缘绿洲典型灌区灌溉需水研究

苏永中1, 杨荣, 刘文杰, 杨晓, 王敏

中国农业科学. 2014, 47(6):  1128-1139.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.06.009

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【目的】土壤性状是影响作物灌溉水生产力（IWP）与灌溉需水的关键因子。以土壤性状与作物灌溉水生产力及灌溉需水的定量关系为依据、结合区域土壤性状的空间分布，估算绿洲典型灌区作物灌溉需水及空间分布，为灌区尺度的合理用水分配及节水潜力评估提供科学依据。【方法】选择黑河中游临泽边缘绿洲平川灌区，对118个农田土壤进行取样分析，确定土壤性状的空间分布；通过不同土壤质地和肥力水平的农田玉米灌溉试验，确定土壤性状与灌溉水生产力及灌溉需水量的关系、进而依据土壤条件估算灌区尺度的灌溉需水及空间分布。【结果】平川灌区农田0—20 cm耕层土壤砂粒含量为29.4%—91.9%，平均53.6%，土壤有机质含量范围为1.37—17.7 g•kg-1，平均10.9 g•kg-1；20—100 cm土层砂粒平均含量51.3%。土壤质地为壤沙土和沙土的面积占农田总面积的50%以上；有机质含量低于10.0 g•kg-1的面积占26%，土壤持水性能弱；土壤性状在空间分布上存在高度的变异性。玉米IWP平均为1.11 kg•m-3（沙土）—2.44 kg•m-3（壤土），与0—20 cm土层黏粉粒含量（CS1，%）、20—100 cm土层黏粉粒含量（CS2，%）、0—20 cm土层有机质含量（OM，g•kg-1）呈极显著正相关。依据土壤性状与灌溉水生产力的关系，得出平川灌区玉米灌溉水生产力平均为（2.36±0.77）kg•m-3，变动范围为0.75-3.92 kg•m-3，IWP小于2.0 kg•m-3的面积为970 hm2，占总面积的18.5%。灌区玉米生育期平均灌溉需水量为558 mm，总灌溉需水量为28.4×106 m3。【结论】土壤条件决定作物的灌溉需水与灌溉水生产力，在灌溉尺度农业水管理方面，应依据不同土壤性状的斑块单元进行地表水与地下水的合理分配与配置，并重视有利于土壤结构改善和肥力提升的施肥、耕作、灌溉等农业技术的应用。

基于文献计量的农业面源污染研究发展态势分析

高懋芳1, 邱建军1, 刘三超2, 刘宏斌1, 王立刚1, 逄焕成1

中国农业科学. 2014, 47(6):  1140-1150.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.06.010

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【目的】客观地分析国内外农业面源污染研究现状，明确当前的研究前沿与热点问题，为农业环境领域科研工作者与决策者提供参考。【方法】利用文献计量学方法，基于ISI Web of Science和CNKI数据库，根据发文量、发文期刊、被引频次等指标，分析近30年来农业面源污染研究的发展态势、前沿领域、研究机构以及国际合作状况等。【结果】共检索得到农业面源污染相关英文文献280篇，中文文献1 517篇。7个研究方向中，农业面源污染治理、现状调查与分析、以及对环境的影响最受关注，三峡库区、太湖流域、密云水库等典型流域污染控制是研究热点。沟渠氮、磷去除对面源污染治理有很重要的意义，目前仍缺乏深入研究，将是今后的一个重要突破口。过程模型模拟是主要的研究方法，野外观测与试验是对模型进行验证的重要手段。国际上研究农业面源污染影响力比较强的单位主要有美国的威斯康星大学、加州大学、爱荷华大学，英国的兰喀斯特大学等，国内实力较强的有中国科学院、北京师范大学、以及厦门大学。中国与美、英等国之间的合作比较多，有助于该领域研究紧跟国际前沿、瞄准热点问题、与世界高水平机构共同探讨解决问题的办法。美欧等发达国家和地区高影响力论文与期刊较多，中国在研究层次、团队实力、论文质量、主办期刊质量等方面有待于进一步提高，原创性成果与重要发现偏少，具有国际影响力的团队少，核心作者不突出。主要原因包括项目周期短，大规模系统性监测数据较少；国产模型普及率不高，各研究单位之间合作不够深入，模型与数据共享机制不完善；缺少中远期团队建设规划，研究群体不稳定等。为解决以上问题，需要从多方面努力。首先，制定农业面源污染观测长期规划，形成系统性成果；其次，鼓励原创性研究，紧跟当前研究前沿与热点，探讨未知的科学问题；第三，整合各行业资金来源，稳定资助力度，凝聚高效研究群体，广泛开展合作交流与数据共享；最后，优化对单位以及个人的评价指标体系，促进国内期刊快速成长。【结论】流域尺度面源污染治理与过程模型模拟是当前农业面源污染研究的前沿领域，农业面源污染物在沟渠与河流网络中的迁移转化机理将成为未来的研究重点，中国虽然发文量增长迅速，但高影响力论文偏少，优秀国际期刊不足。中国主办的期刊中，表现较好的有《Journal of Environmental Sciences-China》和《中国农业科学》。

园艺

苹果MADS-box转录因子的生物信息学及其在不同组织中的表达

董庆龙, 冀志蕊, 迟福梅, 田义, 安秀红, 徐成楠, 周宗山

中国农业科学. 2014, 47(6):  1151-1161.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.06.011

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【目的】分析已知苹果（Malus×domestica）MADS-box基因基本信息，研究其在不同组织中表达情况。【方法】利用NCBI数据库查询并获得苹果MADS-box基因，采用CLC Combined Workbench version 6、WebLogo 3、MEGA4.1、MapInspect和MEME等软件对其蛋白序列进行生物信息学分析。采用RT-PCR技术研究MdMADS基因在不同组织中的表达情况。【结果】共得到26个苹果MADS-box基因。MADS-box结构域分析显示，氨基酸10（I）、16-19（RQVT）、22-23（KR）、29-31（KKA）、33（E）、37-39（LCD）、42（V）和48（S）是保守不变的。保守元件分析表明，苹果MADS-box基因包含4个保守元件：元件1、3为MADS盒；元件2、4为K盒。所有苹果MADS-box蛋白都包含有MADS盒（除MdMADS9）和K盒。进化树分析结果显示，苹果MADS基因共分为5个亚组。MdMADS1、3、4、6、7、8、11、18属于SEP亚组；MdMADS2、5、12属于AP1亚组；MdMADS10、14、15、19、22和MdAGL属于AG亚组；MdMADS16、17、21、MdSOC1、MdSOC1a和MdSOC1c属于SOC1亚组；MdMADS13、23和MdPI属于AP3亚组；MdMADS20属于SVP亚组。染色体定位分析显示，MdMADS在8号染色体上分布最多，共有4个；其次是染色体2、14和17，均分布3个；染色体1、5、6、7、11和16均分布1个；染色体3、4、12和15则没有分布。RT-PCR结果分析显示，SEP和AGL亚组表达模式较为一致，主要在花和果实中表达；AP1亚组除在花和果实中表达外，在其它组织器官中也有表达。【结论】苹果MADS-box基因结构高度保守，多数成员参与调控花和果实发育过程。

南丰蜜橘化渣性评价及不同结果习性果实的品质比较

魏清江1, 汪妙秋1, 曾知富2, 杨成泉1, 彭抒昂1, 刘永忠1

中国农业科学. 2014, 47(6):  1162-1170.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.06.012

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【目的】建立南丰蜜橘化渣性品质的量化指标，比较不同结果习性果实的品质差异，为制定改善南丰蜜橘化渣性品质的栽培措施提供依据。【方法】以南丰蜜橘为材料，用感官品尝的方法区分果实的化渣性，并测定化渣性不同果实的囊衣厚度和囊瓣剪切力、硬度、咀嚼度等化渣性品质指标，分析果实化渣性和这些指标的相关性。进一步测定不同结果习性果实的化渣性品质与常规品质（维生素C、可溶性固形物和可滴定酸）的差异。【结果】囊瓣剪切力和囊衣厚度能够客观反映果实的化渣程度，利用这两个指标可对果实化渣性进行量化；根据品尝试验、囊衣厚度和囊瓣剪切力的结果范围，可将南丰蜜橘果实的化渣性分为3个等级：“化渣”果实的囊瓣剪切力为1.15—1.64 kg，囊衣中间处厚度为0.09—0.12 cm；“较化渣”果实的囊瓣剪切力为1.64—2.63 kg，囊衣中间处厚度为0.12—0.14 cm；“不化渣”果实的囊瓣剪切力为2.63—5.70 kg，囊衣中间处厚度为0.14—0.17 cm；比较不同结果习性果实的品质表明：大果的化渣性优于中果和小果，而中果的常规品质优于小果和大果；短枝果实的化渣性优于长枝果实的，但两者的常规品质没有差异；高负载枝果实化渣性显著优于低负载枝果实，但不同负载量枝条上果实的常规品质没有差异；外膛果的常规品质和化渣性均优于内膛果实；树冠中层果实的化渣性较好，且上层和中层果实的常规品质优于下层果实。【结论】化渣性是南丰蜜橘重要的品质指标，可用囊瓣剪切力及囊衣厚度进行量化评价；不同结果习性的果实品质有差异，化渣性品质与常规品质没有相关性，但化渣性品质好的果实，其常规品质也较好。

高温胁迫下外源一氧化氮对生姜叶片多胺代谢及PSII的调控作用

李秀, 巩彪, 王允, 徐坤

中国农业科学. 2014, 47(6):  1171-1179.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.06.013

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【目的】生姜具喜温怕热的特性，生产中极易遭受高温伤害。文章旨在通过研究高温胁迫条件下外源NO与多胺代谢的关系，以及对PSII的调控作用，探讨外源NO缓解生姜高温胁迫的生理机制。【方法】以砂培‘莱芜大姜’为试材，置光周期12 h/12 h、昼夜温度28℃/18℃和38℃/28℃的光照培养箱内，分别用0.1 mmol•L-1硝普钠（SNP，NO供体）和铁氰化钠（SF，SNP释放NO后的产物）处理植株根系，分别于处理后0、5、10、15和20 d测定功能叶片的相对含水量、叶绿素含量、电解质渗透率、叶绿素荧光参数及多胺代谢途径相关指标。【结果】高温胁迫导致生姜叶片电解质渗透率增加，相对含水量及叶绿素含量降低；随着高温胁迫时间的延长，叶片最大光化学效率（Fv/Fm）、实际光化学效率（ФPSII）、天线转化效率（Fv′/Fm′）、光化学猝灭系数（qP）和P持续降低，非光化学猝灭（NPQ）、β/α-1和D显著升高；主要表现为PSII反应中心的光化学活性降低，即能量代谢途径由光化学反应转为非光化学反应。高温胁迫下游离态、结合态多胺含量先升后降，束缚态多胺持续上升，腐胺/多胺（Put/PAs）比值显著升高。外源添加NO可恢复叶片相对含水量和叶绿素含量，降低电解质渗透率，促使叶绿素荧光参数趋于正常水平，提高高温胁迫下多胺代谢水平，恢复Put/PAs比值。【结论】38℃/28℃的高温胁迫导致生姜叶片受损，PSII功能紊乱，多胺代谢异常；外源添加0.1 mmol•L-1 SNP可降低高温胁迫下生姜叶片损伤程度，维护PSII的正常生理功能，维持多胺的正常代谢，进而提高生姜植株的耐热性。

贮藏·保鲜·加工

西式蒸煮火腿切片货架期褪色与游离氨基酸和生物胺的关系

孙卫青1, 周光宏2, 徐幸莲2

中国农业科学. 2014, 47(6):  1180-1189.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.06.014

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【目的】限制蒸煮腌肉发展的其中一个主要问题就是冷藏期间褪色导致商品价值的降低以及货架期的缩短，本研究以西式蒸煮火腿切片为对象，研究其货架期褪色与游离氨基酸和生物胺的关系，揭示肉品中含氮化合物对血红素色素及产品表观色泽稳定性的影响，为腌制、蒸煮类肉制品的色泽稳定提供理论指导。【方法】对西式蒸煮火腿切片的色泽参数以及多种游离氨基酸和生物胺同时进行跟踪监测，利用多元统计分析的因子分析方法阐释产品贮藏期间游离氨基酸和生物胺与色泽变化之间的关系，公共因子的提取采用主成分分析法，因子旋转方法采用方差最大正交旋转。【结果】试验中检测到8种生物胺和16种游离氨基酸，生物胺在冷藏期间变化不显著，苏氨酸(Thr)、缬氨酸(Val)、蛋氨酸(Met)、赖氨酸(Lys)和精氨酸(Arg)在冷藏期间变化显著。因子分析中看出，主因子1（F1）主要表达了色泽参数信息，特别是反映红色的红度a*、色饱和度C及红色素亚硝基血色原（NH），以及直接影响表观色泽的含氮化合物信息，对样本方差的贡献率达到了45.72%；主因子2（F2）主要表达了色调H以及通过影响色调进而影响表观红度的含氮化合物信息，这些含氮物主要是酸性和碱性游离氨基酸，对样本方差的贡献率为21.52%。酪胺(TYR)和精胺(SPM)在F1中的载荷均高达0.98，且与产品的色泽参数均呈显著负相关，这两种生物胺显著影响产品血红素色素及表观色泽的稳定性。色胺(TRY)在F1中的载荷较高（0.78），且与表观红色度a*及红色素NH呈显著正相关，色胺的存在可以稳定产品的色素NH，改善产品的表观红色；苏氨酸、酪氨酸(Tyr)、缬氨酸、组氨酸(His)、蛋氨酸和亮氨酸(Leu) 直接影响产品的表观色泽，与产品的表观红色度a*显著相关，其中Thr和His与红色度呈显著正相关，Val，Tyr、Met和Leu与红色度呈显著负相关；甘氨酸(Gly)与红色度也呈显著负相关，但在F1中的载荷较低，对产品的表观色泽影响相对较弱。脯氨酸(Pro)在F1中的载荷较高（0.78），且与色泽参数均显著相关，直接影响表观色泽，只是Pro与黄度b*和亮度L*的相关系数远高于红度，对黄度和亮度比对红度的影响更大；苯丙氨酸(Phe)、赖氨酸和精氨酸在F2中的载荷极高，分别为0.90、0.94和0.97，又与亮度和色调H显著相关，对表观色泽的影响显著，主要通过影响亮度和黄度间接影响表观红色度。谷氨酸(Glu)在F1中的载荷相对较高(0.61)，但与红度相关不显著，与黄度和亮度显著相关。【结论】产品基质环境中游离氨基酸和生物胺的存在形式及含量显著影响表观色泽的变化，这种效应可能与这些含氮化合物对基质环境酸碱度的改变以及与卟啉铁的结合或竞争有关。

畜牧·兽医·资源昆虫

苏尼特羊全基因组选择信号检测

王光凯1, 曾滔1, 2, 王慧华1, 张淑珍1, 张莉1, 魏彩虹1, 赵福平1, 杜立新1

中国农业科学. 2014, 47(6):  1190-1199.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.06.015

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【目的】选择信号是物种在进化过程中，经历长期的自然和人工选择在基因组上所留下的印迹。选择信号检测不仅能反映选择对品种培育的作用，还可以作为重要经济性状QTL定位的一个有效方法。苏尼特羊是中国内蒙古地区一个优良的地方绵羊品种，适应于恶劣的戈壁自然环境条件。对苏尼特羊全基因组选择信号检测，不仅能够寻找受正向选择（positive selection）相关的候选基因，揭示重要经济性状的遗传机制，还能为苏尼特羊品种培育过程中受正向选择的性状所经历过长期的人工选育提供遗传学证据。【方法】基于Illumina Ovine SNP50K芯片利用基于单倍型信息的单倍型积分值（integrated haplotype score, iHS）方法对苏尼特羊进行全基因组选择信号检测。首先对SNP芯片数据进行经过质控和单倍型推断后，共剩余42 616个SNP标记用于连锁不平衡（linkage disequilibrium, LD）分析和单倍型推断。然后按照祖先等位基因信息进一步筛选后得到30 537个SNP标记估计用于选择信号检测iHS值，并再以500kb长度作为为一个窗口进行划分一个选择区段，计算窗口内iHS均值，然后进行显著性检验。对具有显著|iHS|值的选择区段基因组区域进行基因注释，并对所检测的候选基因进行GO富集分析。【结果】构建了苏尼特羊的连锁不平衡衰减图谱，发现LD值随着两标记间距离的增大而减小，但也发现某些远距离标记之间存在较高水平的连锁不平衡。通过iHS方法在全基因组范围内共检测到204个具有选择信号的基因组区段，这些区段内与845个候选基因紧密相关。其中有与绵羊角的缺失相关的RXFP2基因，调控一系列控制绵羊毛色基因的ASIP，参与机体神经系统发育的HTR4和SOX10，与胚胎时期神经嵴发育密切相关的SOX10，可以激活骨调控中转录因子12进而调节骨骼发育的E2F2，对骨骼与肌肉的发育和形成相关的PLA2G6，促进核糖体蛋白合成的RPL7基因，与绵羊肺气肿相关性的POL，以及调节机体的先天性免疫功能和适应性免疫应答反应的MATR3。此外，还包括与神经系统发育和疾病相关的ZWINT、PPP1R1B、GPR98、LUC7L3、CAPZA1和MYT1L等。通过生物信息学分析发现与生物学过程相关的有24个GO条目、分子功能相关的有4个GO条目，和细胞组分相关的有3个GO条目。这些GO条目主要与蛋白质合成、大分子物质代谢降解过程和蛋白质的靶向运输、分子活性和核糖体组分以及在核糖体亚基相关。【结论】构建了第一张中国绵羊品种的连锁不平衡图谱和全基因组选择信号图谱。在全基因组范围内检测到与选择相关的重要经济性状的候选基因，其中部分候选基因在绵羊驯化过程中具有非常重要的意义，为进一步了解绵羊的人工选择过程提供了重要的参考依据，也为中国绵羊品种的培育提供了理论基础。

骨骼肌肌纤维形成机制的研究进展

李伯江, 李平华, 吴望军, 李齐发, 黄瑞华, 刘红林

中国农业科学. 2014, 47(6):  1200-1207.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.06.016

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骨骼肌是动物躯体最重要的组成部分，占到产肉动物躯体的40%，肌纤维作为骨骼肌组织的主要成分，其类型的差异是影响产肉动物肌肉品质的重要因素之一。因此，骨骼肌的生长发育与产肉动物肉的产量有着密切的联系，而其生理生化特性的差异也将会直接影响到产肉动物屠宰之后肉品的质量。一般而言，动物骨骼肌肌纤维数目在胚胎发育期间基本上就已固定，出生之后，由于肌纤维的肥大，动物躯体肌肉块才表现出增大增粗。另外，动物肌肉块在生长发育过程中，其肌纤维组成类型并不是完全固定的，它们会随着骨骼肌对代谢与功能需求的改变而发生转变。骨骼肌的生长发育，以及骨骼肌肌纤维类型的发生与发展是一个非常复杂的生物学过程，受到许多信号通路与因子的调控。随着分子生物学技术的飞速发展，各种先进技术相继被应用于生物学现象的研究中，利用这些分子生物学技术很好的阐明了许多复杂生物学现象形成的分子机制。目前，骨骼肌生长发育的分子遗传调控机制取得了长足的进展，许多与骨骼肌形成发育相关的关键因子已被鉴定出来。然而，在早期研究中，人们对于骨骼肌肌纤维的研究主要集中在类型的鉴定，以及不同肌纤维类型生理生化特性的分析，对于骨骼肌肌纤维形成的具体分子遗传调控机制的研究相对较少。近年来，随着研究的不断深入，骨骼肌肌纤维形成的分子遗传调控机制也取得了突破性的进展。因此，有必要进一步对骨骼肌肌纤维类型的特性，骨骼肌肌纤维类型形成的分子机制，以及肌纤维类型与肌肉品质的关系进行全面的综述。本文首先对肌纤维的类型、特性进行了综述；进一步分别对慢型肌纤维与快型肌纤维形成的分子调控机制的研究进展进行了回顾；最后对肌纤维类型与肉品质的关系进行了讨论。总之，本综述的撰写将有助于对骨骼肌肌纤维类型形成的遗传机制的进一步了解，为将来进一步的深入研究肌纤维形成的分子机制提供参考；同时也将有助于揭示肌肉品质形成的分子遗传调控机制，为利用分子生物学技术培育高品质新品种或新品系产肉动物提供分子理论依据。

研究简报

裸燕麦SSR标记连锁群图谱的构建及β-葡聚糖含量QTL的定位

吴斌, 张茜, 宋高原, 陈新, 张宗文

中国农业科学. 2014, 47(6):  1208-1215.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.06.017

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【目的】构建裸燕麦分子遗传图谱，发掘燕麦β-葡聚糖基因紧密连锁的分子标记，为高β-葡聚糖含量燕麦种质资源的利用及裸燕麦分子标记辅助育种提供理论和实践依据。【方法】以高β-葡聚糖地方品种夏莜麦为父本，育成品种赤38莜麦为母本构建的包含215个F2:3家系为图谱构建群体，利用SSR分子标记进行遗传分析，构建分子遗传图谱。通过美国谷类化学会（AACC）发表的标准葡聚糖含量测定方法（AACC Method 32-23）测定各家系的β-葡聚糖含量，利用复合区间作图法进行燕麦β-葡聚糖含量性状进行遗传定位与分析。【结果】利用筛选出的231对SSR引物在F2 后代群体上进行检测，共得到261个多态性标记位点，利用JoinMap 4.0软件对上述获得多态性分子标记进行遗传连锁分析，在LOD≥5.0情况下，构建遗传图谱，得到包含26个连锁群、182个标记位点的遗传图谱，覆盖基因组1 869.7 cM，标记间平均距离为10.6 cM，每个连锁群上的标记数在2—14个之间，连锁群长度在10.6—235.1 cM。对亲本及后代群体β-葡聚糖含量的测定结果表明，β-葡聚糖含量在后代群体中表现出明显的分离，且呈现为连续变异，变异系数为18.72%，说明β-葡聚糖含量性状是受多基因控制的数量性状，群体符合QTL定位的要求。利用QTL分析软件WinQTLCart 2.5对SSR数据进行分析，采用复合区间作图法（composite interval mapping，CIM）对全基因组进行QTL扫描，以LOD值5作为阈值对β-葡聚糖含量可能存在的QTL进行定位和效应估计，检测到4个与β-葡聚糖含量相关的QTL位点，其中qBG-1位于连锁群LG20上，与最近的标记AM591的距离10.0 cM。加性效应值为0.21，可以解释的表型变异为10.9%；qBG-2和qBG-3位于连锁群LG23上，其中qBG-2与最近的标记AM1823的距离4.6 cM，qBG-3与最近的标记AM641的距离1.9 cM，加性效应值分别为-0.23和-0.22，可以解释的表型变异分别为3.2%和2.7%；qBG -4位于连锁群LG25上，与最近的标记AM302的距离6.8 cM，加性效应为0.84，可以解释的表型变异为27.6%，其中存在的2个主效QTL qBG-1和qBG -4,都来自于高β-葡聚糖含量的父本夏莜麦。【结论】构建了大粒裸燕麦SSR分子标记连锁群图谱，并定位了4个控制β-葡聚糖含量的QTL位点。

美洲南瓜（Cucurbita pepo）种皮苯丙氨酸解氨酶基因克隆与表达分析

刘佳1, 2, 3, 徐秉良1, 2, 3, 薛应钰1, 2, 3, 张树武1, 2, 3, 陈荣贤4

中国农业科学. 2014, 47(6):  1216-1226.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.06.018

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【目的】克隆有壳美洲南瓜种皮PAL基因（CP-PAL），研究PAL基因在有壳和裸仁美洲南瓜种皮发育过程中的表达特性，为揭示美洲南瓜种皮发育机理及木质素积累在南瓜种皮发育中的作用等方面提供理论依据。【方法】利用RT-PCR，结合RACE技术克隆CP-PAL的全长序列并进行生物信息学分析；利用实时荧光定量PCR技术，采用2-△△Ct方法对种皮发育过程中PAL基因的表达进行分析。【结果】CP-PAL序列全长为1 720 bp，含有一个1 359 bp的ORF，114 bp 5′端非翻译区、236 bp 3′端非翻译区及11 bp polyA结构，可编码452个氨基酸，分子量为48.86 kD，等电点为6.55，原子总数为6 885个，分子式为C2158H3449N607O657S14。通过BLASTX比对表明CP-PAL核苷酸序列及其氨基酸序列与黄瓜PAL核苷酸及其氨基酸序列的相似性最高。CP-PAL包含PAL-HAL、PLN02457及phe_am_lyase 3个结构域及酶活性中心序列（GTITASGDLVPLSYIA），属于Lyase_I_Like超家族。CP-PAL不具有导肽及信号肽，为非跨膜蛋白，可能定位于细胞质及内质网上，属可溶性蛋白。CP-PAL蛋白含有4个酪蛋白激酶Ⅱ识别位点、6个蛋白激酶C识别位点、12个豆蔻酰化位点及2个糖基化位点。此外，分析可知CP-PAL有18个丝氨酸磷酸化位点、6个苏氨酸磷酸化位点及5个酪氨酸磷酸化位点。无规则卷曲是CP-PAL蛋白二级结构中最大量的结构元件，α-螺旋和延伸链分散于整个蛋白质中，且N-末端以无规则卷曲形式存在，C-末端以延伸链形式存在。CP-PAL氨基酸序列同挑选的其他14种植物的PAL氨基酸序列进行多重序列比较，发现功能区域的氨基酸序列较为保守，N-端的差异最大。系统进化树分析表明CP-PAL和黄瓜PAL蛋白的亲缘关系最近。CP-PAL蛋白三级结构以α-螺旋为主要结构元件，β-转角和无规则卷曲较少。实时荧光定量PCR分析表明PAL基因在有壳和裸仁美洲南瓜种皮发育中呈现反向对应的变化趋势：有壳美洲南瓜种皮PAL基因在自交授粉20 d后表达量增加，而裸仁美洲南瓜种皮PAL基因在20 d后表达量下降。整个种皮发育过程中，PAL基因在裸仁美洲南瓜中的表达量低于其在有壳美洲南瓜中的表达量。【结论】从有壳美洲南瓜种皮中克隆得到与木质素合成相关的PAL基因，该基因可能通过参与调控种皮木质素的合成从而影响美洲南瓜裸粒品种的种皮发育。

水稻-油菜轮作条件下磷肥效应研究

卜容燕1, 任涛1, 鲁剑巍1, 李小坤1, 丛日环1, 李云春1, 汪洋1, 鲁君明2

中国农业科学. 2014, 47(6):  1227-1234.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.06.019

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【目的】采用田间裂区试验研究不同磷肥用量对水稻-油菜轮作体系中作物产量、磷素吸收量以及磷肥当季利用率和残留利用率的影响，评估水稻季不同磷肥用量对油菜的后效大小，探讨周年轮作内磷肥的分配，为水稻-油菜周年轮作体系下油菜季磷肥管理提供科学依据。【方法】采用水稻-油菜周年轮作田间试验，前季水稻包含4个不同的磷肥水平，分别为P0（0 kg P2O5•hm-2）、P30（30 kg P2O5•hm-2）、P60（60 kg P2O5•hm-2）和P90（90 kg P2O5•hm-2），后季油菜在水稻季试验基础上采用裂区试验，每个小区裂区为施磷（60 kg P2O5•hm-2）和不施磷（0 kg P2O5•hm-2）2个副区，研究不同施磷条件下水稻-油菜轮作体系中作物产量、磷素吸收量、磷肥当季利用率和残留利用率，以及水稻季不同磷肥用量对后季油菜产量和磷素吸收量的影响，并引入“后效磷量”的概念评估水稻季磷肥后效。【结果】水稻季施磷60 kg P2O5•hm-2时水稻产量最高，磷肥当季利用率最大，分别为9 694 kg•hm-2和19.2%，施磷不足或者过量均会降低油菜的产量和磷肥当季利用率。与油菜季不施磷处理相比，油菜当季施磷60 kg P2O5•hm-2显著增加油菜干物质量765—1 195 kg•hm-2，其中油菜籽增产427—503 kg•hm-2；油菜产量和磷素吸收量也受到水稻季磷肥用量的影响，水稻季施用磷肥后季油菜干物质量显著增加212—816 kg•hm-2，其中油菜籽粒增产136—409 kg•hm-2，磷素吸收量增加0.4—4.9 kg•hm-2。水稻季残留在土壤中磷肥可以供后季油菜吸收利用，增加油菜当季磷肥的农学效率和磷肥贡献率，具有明显的后效。水稻季磷肥当季利用率16.3%—19.2%，残留利用率为5.4%—7.3%，累积利用率为21.8%—25.6%，磷肥的后效与磷肥用量显著正相关，水稻季磷肥后效相当于油菜当季施磷2—9 kg P2O5•hm-2的增产效果。水稻季磷肥后效也受到油菜季磷肥用量的影响，油菜季施磷处理水稻磷肥对油菜磷素吸收增加作用低于油菜季不施磷处理。【结论】在水稻-油菜轮作体系中，合理的施用磷肥能明显提高两季作物的产量、养分吸收量和肥料利用率，水稻季施用的磷肥残留在土壤中可以被后季作物吸收利用，显著地增加油菜的产量和磷素吸收量，对后季油菜具有明显的后效，其后效的大小与施磷量显著正相关。因此在水旱轮作体系中，在兼顾“重旱轻水”的磷肥管理策略下，油菜季应该充分考虑前茬作物水稻季磷肥后效的基础上进行优化磷肥管理。

牛巴贝斯虫DXS基因的克隆和真核表达

王婧, 李冰, 刘翠翠, 夏吉鹏, 张继瑜

中国农业科学. 2014, 47(6):  1235-1242.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.06.020

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【目的】顶质体是存在于包括疟原虫和巴贝斯虫在内的顶复门寄生虫的一种细胞器，在病原体中，它主要承载类异戊二烯前体和脂肪酸合成途径，异戊二烯五碳结构是有机体合成多种化合物的结构基础，对有机体生命活动至关重要，例如，在哺乳动物中成为胆固醇和类固醇激素的基本结构，在植物中参与合成类胡萝卜素。且存在于顶质体的类异戊二烯前体合成途径对于病原体的生命活动至关重要且不存在于人类和哺乳动物机体，这使其成为近年来人们研究抗原虫药物的焦点。有学者发现利用特异性阻断类异戊二烯代谢途径的药物可治疗疟疾。1-脱氧-5-磷酸 D-木酮糖合成酶（DXS）为该途径中的第一个限速酶。因此，针对牛巴贝斯虫的1-脱氧-5-磷酸 D-木酮糖合成酶dxs基因进行克隆和序列分析，并对其进行真核表达和活性检测，以期获得具有活性的1-脱氧-5-磷酸 D-木酮糖合成酶，为进行针对该酶的特异性抑制剂的筛选奠定基础。【方法】首先采用反转录PCR技术从牛巴贝斯虫陕县株总RNA中扩增出DXS基因的全长cDNA，并对其进行克隆测序，对测序结果进行序列分析，将阳性克隆亚克隆至带荧光标签的真核表达载体，利用脂质体转染法将重组真核表达质粒转染至Hela细胞，利用倒置荧光显微镜观察转染细胞的表达情况，消化收集转染细胞，通过超声破碎后采用Western blot技术对DXS蛋白的表达情况进行检测，结合G418压力筛选以及有限稀释的方法对转染阳性细胞进行筛选，获得阳性单克隆细胞。在体外建立DXS酶反应体系，并利用液相质谱联用技术对表达产物的体外活性进行检测。【结果】扩增得到的DXS基因全长共2 061 bp，共编码686个氨基酸，与GenBank上T2Bo株相应基因相似性达到98.0%。利用生物信息学方法对该蛋白质的二级结构进行分析发现，该酶具有3个结构域，分别是焦磷酸硫胺素结合区域；焦磷酸硫胺素嘧啶环结合区域；转酮醇酶C端区域，该酶属于常见的TPP依赖蛋白酶家族。通过倒置荧光显微镜观察，转染重组质粒后的Hela细胞呈现绿色荧光，Western blotting结果显示融合绿色荧光蛋白的DXS酶大小约为102 kD，表明构建的真核表达重组质粒在Hela细胞中进行了正确的表达。通过结合G418加压和有限稀释法筛选得到稳定转染重组质粒PEGFG-DXS的阳性单克隆细胞。利用质谱技术检测到在细胞粗提物与反应混合物反应后的产物中有分子量与DOXP相同的产物存在，在阳离子模式下m/z=237，表明表达产物具有催化活性。【结论】成功的表达了具有活性的牛巴贝斯虫DXS酶，并对融合蛋白的活性进行了定性分析，为今后开展针对DXS酶的特异性化合物体外高通量筛选研究提供了材料。对研究针对DXS为靶标的抗原虫药物具有重要意义，为深入研究该酶的酶学性质和特异性抑制剂筛选奠定了基础。