中国农业科学

水稻类钙调磷酸酶亚基B蛋白质在逆境胁迫下的表达

贾霖, 刘雨萌, 范伟, 关明俐, 贾盟, 窦世娟, 魏健, 彭业博, 刘丽娟, 李莉云, 刘国振

中国农业科学. 2013, 46(1): 1-8. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2013.01.001

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【目的】了解水稻CBL蛋白质在逆境胁迫下的表达模式进而探讨水稻耐逆的分子机理。【方法】采用基于抗体的蛋白质组学策略，以超级杂交稻父本9311为材料，采用免疫印迹（western blotting，WB）技术调查了CBL家族主要成员在冷、热、旱、淹和盐胁迫等5种逆境中的表达特征。【结果】发现CBL1、CBL5和CBL6在冷胁迫中表达下调,CBL1和CBL2在热胁迫中表达下调，CBL1和CBL5在旱胁迫中表现下调，而CBL6、CBL8和CBL10在旱胁迫中表现上调，CBL1、CBL5、CBL6、CBL8和CBL10在淹涝胁迫中表达上调，而CBL2表现下调。【结论】鉴定了水稻在重要逆境胁迫下发生丰度变化的6个CBL蛋白质。

大麦BAC文库三维混合池的构建与HvGW2筛选

郭刚刚, 董国清, 周进, 达瓦顿珠, 袁兴淼, 张京

中国农业科学. 2013, 46(1): 9-17. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2013.01.002

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【目的】从大麦BAC文库中快速筛选包含目的基因HvGW2的阳性BAC克隆。【方法】构建BAC文库三维混合池，设计2对HvGW2特异性引物，进行BAC文库筛选，对含有目的基因HvGW2的阳性BAC克隆进行测序，获得编码大麦GW2蛋白的基因组DNA序列，并与禾本科中的GW2进行同源进化分析。【结果】构建了大麦BAC文库的三维混合池160个，文库空载率为0.18%；筛选到含HvGW2的阳性BAC克隆3个，其中，BAC克隆196M02包含完整编码该基因的序列；HvGW2包含8个外显子和7个内含子，具有与其它植物GW2相似的结构特征和保守的功能结构域；同源进化分析结果显示，大麦与小麦的GW2蛋白同源性最高；序列分析发现，HvGW2第6内含子上包含2个不同类型的反转录转座子插入，从而使大麦比其它作物的GW2长度增加11.5 kb以上。【结论】通过构建三维混合池快速筛选包含目的基因的单个阳性BAC克隆，建立了大麦目标基因克隆的辅助平台；HvGW2基因组中位于内含子区的反转录转座子插入导致基因长度增加，可能是影响该基因转录水平的关键变异。

基于导数光谱的小麦冠层叶片含水量反演

梁亮, 张连蓬, 林卉, 李春梅, 杨敏华

中国农业科学. 2013, 46(1): 18-29. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2013.01.003

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【目的】以高光谱技术实现小麦含水量信息的快速、无损与准确获取，为小麦灌溉的精确管理提供科学依据。【方法】利用水氮胁迫试验条件下小麦主要生长期的导数光谱构建了16种新指数，将其与NDII、WBI以及NDWI等常用指数进行比较分析，筛选小麦叶片含水量反演最佳光谱指数，并利用其建立反演模型进行小麦含水量的遥感填图。【结果】在各指数中，FD730-955对小麦冠层叶片含水量的估测结果最佳，其估测模型（对数形式）校正决定系数（C-R2）与检验决定系数（V-R2）分别达0.749与0.742，优于NDII等常用指数；FD730-955所建模型对32个未知样的预测结果与实测值相似度较高，其回归拟合模型R2达0.763，RMSE仅为0.024，取得了良好预测结果，且对叶片含水量以及LAI值较高与较低的样本均具备良好的预测能力，可有效避免样本取值范围以及冠层郁闭度等因素对含水量估测的影响；反演模型对OMIS影像的填图结果与地面实测值拟合模型R2达0.647，RMSE仅为0.027，具有较高的反演精度。【结论】导数光谱可实现小麦冠层叶片含水量信息的准确估测，其中FD730-955系反演的优选指数。

灌浆结实期水分胁迫对糯玉米粉理化特性的影响

陆大雷, 孙旭利, 王鑫, 闫发宝, 陆卫平

中国农业科学. 2013, 46(1): 30-36. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2013.01.004

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【目的】明确灌浆结实期水分胁迫对糯玉米粉理化特性的影响。【方法】以苏玉糯5号和渝糯7号为材料，利用负水头供水控水盆栽装置研究灌浆结实期水分胁迫（土壤相对含水量为90%、75%和60%，分别代表水分过量、正常和亏缺）对糯玉米粉理化特性的影响。【结果】糯玉米粉糊化特征值中，谷值黏度、终值黏度、回复值和糊化温度受水分胁迫影响较小，水分亏缺使峰值黏度和崩解值降低。差示扫描量热仪（DSC）研究表明，热焓值和终值温度受水分胁迫影响较小，起始温度和峰值温度在水分亏缺时较高，且水分过量或亏缺均导致样品回生值增加。苏玉糯5号籽粒淀粉平均粒径和直径＞17 μm淀粉粒比例在土壤水分正常时较低，而渝糯7号恰好相反。最大吸收波长在水分正常时最低，水分亏缺时最高。碘结合力和结晶度苏玉糯5号受土壤含水量影响较小，渝糯7号在土壤水分亏缺时碘结合力较高而结晶度较低。【结论】灌浆结实期土壤水分胁迫对糯玉米粉糊化和热力学特性有显著影响，水分亏缺时较低的结晶度和较高的碘结合力导致糯玉米粉峰值黏度和崩解值较低，起始温度、峰值温度和回生值较高。水分正常时，籽粒加工品质较优（高峰值黏度与崩解值，低回生值）。

烟草地上部植株三维重构与可视化

王芸芸, 温维亮, 郭新宇, 赵国辉, 陆声链, 肖伯祥

中国农业科学. 2013, 46(1): 37-44. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2013.01.005

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【目的】实现烟草的数字化与可视化。【方法】本文采用模板技术对烟草植株进行三维重构，首先通过三维数字化仪对烟草器官进行测量和形态特征提取，然后基于形态结构特征分别建立了烟草叶片、花朵、果实和茎节等器官的参数化几何模型，保存为模板文件，最后调用相应的模板文件，结合图形变换方法拼接成完整植株几何模型。【结果】利用本文方法可方便构造烟草各主要时期的三维模型。【结论】所建立的烟草植株几何模型具有较高的真实感，为其三维形态交互设计和可视化模拟提供了技术支撑。

NSvc4和CP蛋白与水稻条纹病毒的致病相关

袁正杰, 贾东升, 吴祖建, 魏太云, 谢联辉

中国农业科学. 2013, 46(1): 45-53. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2013.01.006

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【目的】以水稻条纹病毒（Rice stripe virus，RSV）编码的NSvc4蛋白和CP蛋白的致病功能鉴定为切入点，研究RSV的致病机理。【方法】通过农杆菌介导在本氏烟中对RSV编码的6个蛋白进行细胞定位。采用双分子荧光互补（Bimolecular fluorescence complementation，BiFC）技术鉴定NSvc4蛋白与其余5个蛋白间的互作关系，并用酵母双杂交体系（Yeast two-hybrid，YTH）对NSvc4与CP蛋白间的互作再次验证。利用马铃薯X病毒（Potato virus X，PVX）系统在本氏烟叶片研究NSvc4蛋白和CP蛋白的致病性，采用实时荧光定量PCR（Real-time PCR）技术验证致病性鉴定结果。【结果】RSV NSvc4蛋白能与CP蛋白互作，且蛋白复合体在本氏烟细胞中能够定位到叶绿体。致病性鉴定显示，PVX-RSV-NSvc4侵染的本氏烟表现为花叶症状；PVX-RSV-CP能够在侵染叶上诱导花叶症状，但是系统叶却恢复健康；PVX-RSV-NSvc4与PVX-RSV-CP共侵染的本氏烟和PVX-RSV-NSvc4CP侵染的本氏烟的侵染叶、系统叶均表现出了严重病症。Real-time PCR结果显示，PVX载体在各侵染本氏烟中的累积量均较低，而RSV CP和NSvc4基因的表达量与本氏烟的发病症状紧密相关。【结论】NSvc4和CP蛋白均有致病性。CP蛋白的致病力不能持久，但是与NSvc4蛋白互作后具有持久致病力，表明二者协同在RSV致病过程中发挥作用。

低温和高温对仓储绿豆象的防治效果

仲建锋, 万正煌, 李莉, 陈宏伟, 伍广洪

中国农业科学. 2013, 46(1): 54-59. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2013.01.007

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【目的】确定绿豆象最耐受低温或高温的发育阶段，得到不同温度下完全防控该虫所需时间，为防治仓储绿豆象提供理论基础。【方法】在-5和40℃下，分别对绿豆象卵、幼虫、蛹和成虫进行处理，确定最耐受低温或者高温的虫态。在此基础上，对低温（-5、-10、-20℃）以及高温（40、45、50℃）下最耐受虫态做进一步的生物测定，从而得到完全防控绿豆象的时间。【结果】绿豆象幼虫和蛹耐寒能力较强，卵、幼虫、蛹和成虫在-5℃的LT50分别是12.57、24.93、30.54和15.76 h。绿豆象蛹耐热能力较强，卵、幼虫、蛹和成虫在40℃时的LT50分别是4.29、17.76、22.33和14.50 h。绿豆象的蛹在低温-5、-10和-20℃下的LT50 分别是30.54、6.50和0.96 h，LT99分别是189.70、33.81和2.90 h。在高温40、45和50℃下的LT50 分别是22.33、3.64和0.85 h，LT99分别是169.43、17.77和3.71 h。【结论】绿豆象各虫态耐低温和耐高温的能力均为蛹较强，据此得到处于不同温度下完全控制绿豆象危害所需时间。因此，利用低温或高温防控仓储绿豆象是可行的。

光敏蛋白脂质体的制备与生物活性

殷素侠, 廖美德, 徐汉虹

中国农业科学. 2013, 46(1): 60-68. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2013.01.008

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【目的】获得KillerRed蛋白（KRP）脂质体的制备配方，测定其物理化学性质及生物活性，为优化该蛋白的使用性能提供依据。【方法】用逆相蒸发法制备KRP脂质体，用荧光分光光度法测定脂质体包封率，以包封率为指标通过正交试验优化配方，并考察脂质体的形态、粒径、Zeta电位和泄漏率以及生物活性。【结果】按优化配方制得的脂质体颗粒呈球形，平均粒径为520.9 nm、Zeta电位为-83.78 mV、包封率为77.05%；不同时段脂质体对白纹伊蚊4龄幼虫毒力回归方程分别为y=3.0499x+0.0368（r=0.9771）、y=2.6003x+1.1592（r=0.9600）和y=2.7702x+1.2624（r=0.9765），LC50值分别为42.40、30.00和22.35 μg•mL-1；脂质体透过家蚕和斜纹夜蛾表皮的效果均优于KRP，48 h后通过家蚕和斜纹夜蛾表皮的累积渗透量达24.67和20.83 μg•mm-2，分别是同时间段KRP的3.10和2.35倍。【结论】以该配方制得的KRP脂质体生物活性明显高于KRP，经皮渗透效果也优于KRP。

不同施肥模式对设施菜地细菌群落结构及丰度的影响

曾希柏, 王亚男, 王玉忠, 林志灵, 李莲芳, 白玲玉, 苏世鸣, 沈灵凤

中国农业科学. 2013, 46(1): 69-79. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2013.01.009

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【目的】研究设施菜地不同施肥处理下细菌群落结构和丰度的变化。【方法】利用16S rRNA基因的末端限制性片段多态性分析（T-RFLP）技术与实时荧光定量（Real-time）PCR 相结合的方法，研究了不施肥（CK）、1/2量氮磷钾化肥+1/2量有机肥（1/2 MNPK）、氮磷钾化肥+有机肥（MNPK）、有机肥（M）、氮磷钾化肥（NPK）5种不同施肥处理对土壤中细菌群落结构和丰度的影响。【结果】147个阳性质粒测序结果显示设施菜地土壤中细菌主要包括厚壁菌门、变形菌门、绿弯菌门、酸杆菌门、拟杆菌门、放线菌门、疣微菌门、蓝藻门、硝化螺旋菌门及浮霉菌门10个门。其中变形细菌（26.53%）、拟杆菌（14.97%）和放线细菌（10.88%）是优势菌，共52.38%。Shannon-Wiener、Simpson’s diversity、Margalef指数均是在1/2 MNPK 处理下0—20 cm表层土壤中达到最高，分别为3.14、0.945、4.31，Evenness指数则以NPK处理0—20 cm土层最高，为0.941。不同施肥处理细菌的主要类群种类及丰度明显不同。RDA分析显示pH（P=0.002）和有机质含量（P=0.006）是造成群落结构差异的主要原因。定量PCR结果显示1/2 MNPK 处理下0—20 cm和20—40 cm土层中细菌的16S rRNA基因丰度最高达5.26×109和4.96×109拷贝数/g，比CK处理增加90.8%和197.5%。【结论】施用有机肥处理的土壤中细菌的优势种群明显不同于单施化肥和不施肥，适量化肥和有机肥配合施用（1/2 MNPK）可以显著增加土壤中细菌的丰度。

植物油包膜控释尿素在香蕉各生育时期土壤中的释放特性

宋媛媛, 曹明, 樊小林

中国农业科学. 2013, 46(1): 80-88. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2013.01.010

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【目的】探讨香蕉4个不同生育时期施用的植物油包膜控释尿素（PCU）在土壤中的养分释放特征曲线和静水培养中特征曲线的差异，为应用静水溶出率法简单而准确地预测香蕉生长期PCU在土壤中的供肥速度和数量提供依据。【方法】采用田间土壤培养法测定PCU的养分累积释放率及肥效期，以静水培养为对照，研究香蕉4个生育时期内控释尿素的养分释放特性。【结果】除攻蕾期外，大田苗期、旺盛生长期、幼果期土壤中PCU的养分释放曲线不同于静水的，均由静水的“S”型变为“抛物线”型，且前42 d供肥量大，而攻蕾期的供肥量较小，后期则相反；同一PCU的初期溶出率、微分溶出率、28 d累积释放率于各生育时期土壤中的测定值均大于静水的测定结果。其中，初期溶出率大小依次为旺盛生长期＞幼果期≥大田苗期＞攻蕾期；微分溶出率表现为大田苗期＞幼果期＞攻蕾期=旺盛生长期；28 d累积释放率则为幼果期＞大田苗期=旺盛生长期＞攻蕾期；与静水法测定结果相比，大田苗期和旺盛生长期土壤中PCU的肥效期分别延长了18 d和35 d，而攻蕾期和幼果期的分别缩短了10 d和30 d。【结论】同种控释尿素，施用于香蕉不同的生育时期，相同时间内的供肥速度、供肥量不等。较静水培养法测定结果，分别在大田苗期、旺盛生长期、幼果期施用的PCU前期的供肥量大，而后期的供肥量较小；在攻蕾期施用的PCU前期供肥量小，后期的供肥量较大。

华北生态群普通杏遗传多样性与群体结构分析

章秋平, 刘冬成, 刘威生, 刘硕, 张爱民, 刘宁, 张玉萍

中国农业科学. 2013, 46(1): 89-98. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2013.01.011

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【目的】研究华北生态群普通杏在不同地理来源间的遗传多样性、特异性和群体结构差异。【方法】应用21对SSR引物对67份华北生态群普通杏的遗传多样性和群体结构进行分析。【结果】21个SSR位点在67份华北生态群的普通杏材料中共检测出301个等位变异，每个位点的等位变异范围为8—24个,平均为14.33个。每个位点Shannon’s多样性指数（I）变异范围为0.65—2.67，平均为1.934。通过不同地理来源间比较，发现来自西北黄土高原区域的杏种质多样性丰富，拥有较多的等位变异。不同地理群间存在较多的互补等位变异；各地理群体拥有各自特有等位变异。基于混合模型的Structure2.2群体结构分析显示，将华北生态群普通杏划分为7个组群，且不同地理来源的材料均被划分到3个或以上的聚类群体。当K=4时，除仁用杏外华北生态群普通杏可以划分为西南亚群、华北平原亚群和东部丘陵亚群（包括山东丘陵地和辽南丘陵地的普通杏）3个亚群，与传统生态亚群划分相似。【结论】华北生态群普通杏种质具有丰富的遗传多样性，其中来自于西北地区的普通杏多样性最为丰富，有较多的变异类型。仁用杏种质遗传基础狭窄，但具有较多的特有等位变异和独特的血缘关系。华北生态群普通杏可以划分为3个亚群，但地理来源相同的种质不一定属于同一类群。

自然生草对黄河三角洲梨园土壤养分、酶活性及果实品质的影响

吴玉森, 张艳敏, 冀晓昊, 张芮, 刘大亮, 张宗营, 李文燕, 陈学森

中国农业科学. 2013, 46(1): 99-108. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2013.01.012

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【目的】探讨多年自然生草对黄河三角洲梨园土壤水溶性总盐、有机质、矿质元素及酶活性等土壤生化性状及果实品质的影响，为中国盐碱地改良及果园生草技术的推广应用提供理论依据和基本资料。【方法】以山东东营黄河三角洲自然生草2年、4年和7年的黄金梨[Pyrus pyrifolia (Burm.f.).cv. Nakai]园土壤及果实为试材，以清耕为对照，分别测定表层（0—20 cm）及亚表层（20—40 cm）土壤水溶性总盐、有机质、矿质元素及酶活性等土壤生化性状及果实品质指标，分析其变化特征。【结果】自然生草不仅显著提高了黄河三角洲梨园0—40 cm不同土层有机质含量，同时有效降低了土壤含盐量；在0—20 cm表土层，自然生草2年的土壤硝态N等主要矿质营养元素含量均极显著低于对照，而自然生草7年的土壤硝态N主要矿质营养元素含量均极显著高于对照，但在20—40 cm亚表层，生草2—7年土壤硝态N等主要矿质营养元素含量均极显著低于对照；自然生草7年梨园的0—20 cm表层土壤脲酶和碱性磷酸酶活性为0.79 mg•g-1和1.25 mg•g-1，分别是对照的3.8倍和1.5倍，而二者在20—40 cm亚表层无显著差异；自然生草4年及7年的果实脆度、可溶性固形物含量、香气总量、总糖含量及糖酸比均明显高于生草2年的各项指标，差异达显著或极显著水平。相关分析表明，在0—20 cm表土层，土壤5种酶活性与N、P、K、Mg及Zn大都极显著正相关；而在20—40 cm亚表层，除过氧化氢酶外，其它4种酶活性与所有养分间的相关性大都不显著。【结论】自然生草对降低黄河三角洲梨园0—40 cm不同土层土壤含盐量及增加土壤有机质含量均具有明显作用；随着生草年限的增加，自然生草能有效提高参试梨园表层土壤酶活性及土壤矿质营养元素含量，并提升果实鲜食品质。

不同水稻品种大米直链淀粉含量对加工米粉丝品质的影响

王永辉, 张业辉, 张名位, 魏振承, 唐小俊, 张瑞芬, 邓媛元, 张雁

中国农业科学. 2013, 46(1): 109-120. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2013.01.013

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【目的】分析米粉丝加工中不同水稻品种大米原料的直链淀粉含量对米粉丝品质的影响，为确定适合米粉丝加工用大米原料标准提供依据。【方法】以直链淀粉含量介于16.45%—29.64%的14个不同籼型水稻品种为材料，分别采用一步成型法制作米粉丝，分析评价米粉丝的加工效果、感官品质、蒸煮品质和质构特性，通过相关分析建立大米原料直链淀粉含量与加工米粉丝品质之间的相关性。【结果】随着水稻品种大米原料直链淀粉含量的升高，米粉丝的加工效果显著提高，但当其含量超过26.14%后，米粉丝的加工效果反而出现下降的趋势；米粉丝的劲道感、爽滑感、不粘牙、光泽以及综合感官品质与大米原料的直链淀粉含量均呈显著正相关性（P＜0.05）；米粉丝的复水时间与大米原料的直链淀粉含量呈极显著正相关性（P＜0.01），而其膨胀率、断条率以及损失率则与大米原料直链淀粉含量呈极显著负相关性（P＜0.01）；米粉丝的硬度、咀嚼性、剪切力、拉伸长度、断裂力和破断功等质构特性指标与大米原料的直链淀粉含量亦均呈现极显著正相关性（P＜0.01）。【结论】采用一步成型法制作米粉丝时，米粉丝的加工效果、感官品质、蒸煮品质及质构特性与水稻品种大米原料直链淀粉含量之间存在密切的相关性，选用直链淀粉含量介于22.11%—25.45%的籼稻米原料加工的米粉丝具有较好的品质。

小麦高分子量谷蛋白亚基（HMW-GS）对面条感官质量的影响

张影全, 魏益民, 张波, 张晓科, 董凯娜, 刘锐

中国农业科学. 2013, 46(1): 121-129. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2013.01.014

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【目的】明确HMW-GS及其组合对面条感官质量特性的影响，筛选适于制作优质面条的HMW-GS及其组合。【方法】以大田种植的80份小麦品种为材料，实验室制作干白面条。采用标度感官评价方法，利用经过培训和测试的感官评价员组成的感官评价小组，对煮制后的面条进行感官质量评价。通过组间方差分析，研究Glu-A1、Glu-B1、Glu-D1位点内单个亚基及其亚基组合对面条感官质量的影响。【结果】方差分析结果表明，Glu-A1、Glu-B1、Glu-D1位点分别对光滑性、弹性和感官评价总分、硬度和黏性有显著影响（P＜0.1），Glu-A1、Glu-B1、Glu-D1位点内单个亚基对面条感官质量的影响大小为Null＞1、7+8＞7+9＞14+15、4+12＞5+10≥2+12。不同亚基组合的面条感官质量特性（色泽、硬度、弹性、光滑性）以及总分之间存在显著差异（P＜0.1）。亚基组合为Null/7+8/2+12、1/7+8/4+12、1/7+8/5+10的小麦品种制作面条的感官质量得分较高，且在部分感官质量特性方面表现突出。【结论】不同位点HMW-GS对面条感官质量有显著影响。Glu-B1位点上的7+8亚基为影响面条感官质量特性的主要亚基类型。亚基组合为Null/7+8/2+12、1/7+8/4+12和1/7+8/5+10的小麦品种制作的面条感官评分较好，为面条小麦品种选育的推荐亚基组合。

秦川牛花纹肉剪切力值与胶原蛋白吡啶交联和热溶解性的关系

卢桂松, 王复龙, 朱易, 万可慧, 彭增起

中国农业科学. 2013, 46(1): 130-135. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2013.01.015

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【目的】通过对花纹肉剪切力值与胶原蛋白吡啶交联含量的对比研究，发掘脂肪沉积改善牛肉嫩度的内在原因。【方法】以秦川公牛花纹肉为试验材料，研究相同年龄不同花纹等级、相同花纹等级不同年龄的牛肉样品剪切力值、胶原蛋白热溶解性以及吡啶交联含量的变化规律。【结果】对花纹等级相同（B级）的西冷来说，随着年龄的增长，羟赖氨酰吡啶嗡（HP）交联逐渐增加，赖氨酰吡啶嗡（LP）交联先增加后减少，胶原蛋白热溶解性下降，牛肉剪切力值增加；对相同年龄的西冷来说（4对永久齿），随着花纹等级的提高，HP交联含量逐渐减少，胶原蛋白热溶解性升高，牛肉剪切力值下降。【结论】脂肪沉积过程中，胶原蛋白中HP交联受抑，胶原蛋白未能形成丰富的成熟交联，加热时更容易形成明胶，使牛肉剪切力值下降，嫩度提高。

牛fabp3和fabp4基因真核表达载体的构建及在小鼠成肌细胞中的表达

王杰, 奥旭东, 李文斌, 白海栋, 岳永莉, 于海泉

中国农业科学. 2013, 46(1): 136-145. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2013.01.016

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【目的】分别构建牛fabp3和fabp4基因真核表达载体，并观察载体转染小鼠成肌细胞后基因的表达以及对内源fabp3和fabp4基因表达的影响，检测肉质性状形成相关基因在转基因细胞中的表达及对内源功能基因的影响。【方法】以pDsRED质粒为骨架载体，分别将人肌红蛋白启动子与目的基因相连、CMV启动子与红色荧光蛋白报告基因相连构建肌肉特异性表达fabp3基因的载体pDsHF3和表达fabp4基因的载体pDsHF4；用脂质体瞬时转染小鼠成肌细胞，72 h后用2%孕马血清诱导成肌细胞向肌管的分化；利用real-time PCR技术检测转染前后成肌细胞中外源牛fabp3和fabp4基因和内源小鼠fabp3和fabp4基因的表达量。【结果】与对照组相比，小鼠成肌细胞分别转染pDsHF3和pDsHF4表达载体，24 h后外源牛fabp3和fabp4基因均获得高水平的表达，48 h后有所回落；而内源小鼠fabp3和fabp4基因在成肌细胞和诱导分化的肌管细胞中的表达均受到不同程度的影响。【结论】构建的真核表达载体能在成肌细胞中高效表达，外源牛fabp3或fabp4基因的转入能够影响小鼠成肌细胞及肌管中内源fabp3和fabp4基因的表达。

应用Solexa测序技术挖掘山羊卵巢组织microRNA

张晓东, 凌英会, 张运海, 李运生, 刘亚, 曹鸿国, 张子军, 殷宗俊, 丁建平, 章孝荣

中国农业科学. 2013, 46(1): 146-153. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2013.01.017

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【目的】旨在构建、分析山羊卵巢组织miRNA表达谱，为进一步研究特定miRNA与山羊卵泡发育及性激素分泌等相关生殖活动的关系奠定理论基础。【方法】首先从山羊卵巢组织总RNA中分离小片段RNA，然后进行Solexa测序和生物信息学分析，最后利用q-PCR技术验证miRNA在山羊卵巢组织中的表达。【结果】共鉴定出508个山羊卵巢组织表达的miRNA和19个对应的miRNA*，这些miRNA在哺乳动物（绵羊、牛、猪、马、狗）进化过程中高度保守；q-PCR验证了8个miRNA在山羊卵巢组织中的表情况，定量结果与测序结果一致。【结论】成功构建了山羊卵巢组织miRNA表达文库，山羊卵巢组织miRNA表达丰富且其表达量各异。

中华蜜蜂普通气味结合蛋白ASP2的气味结合功能模式分析

李红亮, 张林雅, 庄树林, 倪翠侠, 韩宝瑜, 商晗武

中国农业科学. 2013, 46(1): 154-161. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2013.01.018

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【目的】研究中华蜜蜂（Apis cerana cerana）体外重组普通气味结合蛋白AcerASP2与不同气味信息的结合功能和模式。【方法】通过诱导条件的优化和纯化，在获得的重组AcerASP2蛋白基础上，研究竞争性荧光探针1-NPN及不同结构气味信息与蛋白的相互作用关系，并通过同源建模和分子对接解析蛋白与气味信息的结合模式和机理。【结果】通过条件摸索获得了可溶性表达的重组中蜂ASP2蛋白，荧光光谱分析1-NPN与AcerASP2的解离常数K1-NPN为7.38 μmol•L-1，结合位点数n为1.0321。在7种气味信息中，4-烯丙基藜芦醚亲和力最强，其IC50和解离常数KD分别达到7.09和3.46 μmol•L-1。分子对接显示AcerASP2具有1个呈狭长的口袋状的疏水性结合内腔，4-烯丙基藜芦醚绝大部分位于该预测疏水性内腔中，且与Lys74产生2个氢键。【结论】中华蜜蜂AcerASP2由于特殊的空间结构而具有较强的气味信息结合能力，且易通过与疏水内腔中的赖氨酸残基产生氢键而促进结合。

荧光定量PCR作为猪瘟兔化弱毒疫苗效价检验替代方法的研究与应用

陈锴, 姚华伟, 王长江, 徐璐, 范学政, 赵启祖, 邹兴启, 朱元源, 赵燕, 杨光友, 王琴

中国农业科学. 2013, 46(1): 162-169. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2013.01.019

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【目的】建立一种快速、敏感、特异的检测猪瘟兔化弱毒疫苗（HCLV）的荧光定量PCR方法(FQ-PCR)，为猪瘟兔化弱毒疫苗的效力检验提供一替代方法。【方法】在猪瘟兔化弱毒疫苗基因组3′非编码区设计一对针对猪瘟兔化弱毒株的特异性引物和一条MGB探针，并进行反应体系及反应条件优化，以及特异性、灵敏度、稳定性及符合性试验。将此方法用于部分批次疫苗厂疫苗半成品的定量检验，与兔热反应进行比较，寻求两方法的相关性。【结果】试验结果证实，CT值与模板之间呈现良好的相关性，相关系数为0.9998，扩增效率为101.14%；该方法仅扩增HCLV，不扩增HCLV以外的其它病原，显示良好的特异性；具有较高的灵敏度，能检测模板中4.35个cDNA拷贝量，比CSFV-RT-nPCR高1个数量级。将此方法应用于4个厂家17个批次的34份猪瘟兔化弱毒疫苗效力检验，两只兔子均无热反应（不合格）样品共11份，FQ-PCR CT值为21.15—27.30；两只兔子一只呈现定型热，一只无热反应的样品12份，CT值为17.47—23.70；两只兔子都呈现定型热或者一只呈现定型热一只呈现轻热反应（合格品）样品共11份，CT值为17.10—20.8。【结论】建立的HCLV-FQ-PCR方法能特异性的检测疫苗核酸含量，与家兔热反应测定结果存在良好的相关性，可以用于猪瘟疫苗半成品中HCLV定量检测。

转录靶向猪Jiv基因shRNA细胞株的建立及抗猪瘟病毒转基因猪的构建

郭抗抗, 雷安民, 宁蓬勃, 程敏, 何雷, 刘伟, 谭学超, 徐磊, 曹伟伟, 张彦明

中国农业科学. 2013, 46(1): 170-178. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2013.01.020

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【目的】构建转入靶向猪Jiv基因shRNA干扰片段的阳性细胞株，通过比较各细胞株对猪瘟病毒增殖的干扰效果，筛选对猪瘟病毒增殖有明显抑制作用的细胞株，为抗猪瘟转基因猪的构建提供材料。【方法】研究设计了靶向猪Jiv基因的4个shRNA干扰片段，并构建插入干扰片段的慢病毒(P1、P2、P3、P4)。将慢病毒分别转染PK-15细胞，阳性细胞接种猪瘟病毒后72 h用实时荧光定量PCR检测猪瘟病毒RNA的量，以比较4种干扰细胞株对猪瘟病毒增殖的干扰效果。将对猪瘟病毒增殖有较好干扰效果的P2慢病毒干扰载体转染猪胎儿成纤维细胞，获得稳定表达靶向猪Jiv基因shRNA干扰片段的猪胎儿成纤维细胞株，作为抗猪瘟病毒转基因猪构建的供体细胞，将细胞核移植到成熟的去核猪卵母细胞中，获得体细胞核移植胚胎，移植入受体母猪输卵管中进行转基因猪构建，对获得的转基因猪进行外源基因的鉴定。【结果】获得了4株转入靶向猪Jiv基因shRNA干扰片段的PK-15细胞株，其中转入P2干扰载体的细胞株对猪瘟病毒的增殖有明显的抑制作用，将转入P2干扰载体的猪胎儿成纤维细胞株为核供体细胞通过体细胞核移植，获得经鉴定为外源基因插入阳性的转基因猪。【结论】细胞Jiv基因的表达对猪瘟病毒的增殖有一定的影响，筛选获得的一个干扰细胞株对猪瘟病毒的增殖有明显的干扰效果；通过体细胞核移植技术获得一头转入靶向猪Jiv基因shRNA干扰片段（P2）的转基因猪。

嵌合猪瘟病毒基因Ⅱ型E2抗原区的重组C株病毒构建及其生物学特性

童超, 陈宁, 廖迅, 袁雪梅, 李肖梁, 方维焕

中国农业科学. 2013, 46(1): 179-186. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2013.01.021

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【目的】目前使用的基因Ⅰ型猪瘟兔化弱毒C株疫苗是公认的安全、有效疫苗，但近年来基因Ⅱ群的猪瘟流行毒株比例增高，因此对猪瘟(CSF)的有效防控提出了更高要求。本研究旨在通过反向遗传学技术构建适应CSFV基因Ⅱ型的新型C株疫苗，为标记疫苗的开发奠定基础。【方法】在构建的C株感染性克隆基础上，拯救嵌合CSFV基因Ⅱ型HZ1-08毒株E2抗原区的重组C株病毒RecCHZE2，并分析其致病性和免疫原性。【结果】重组嵌合病毒RecCHZE2接种家兔后出现典型的定型热，兔脾脏肿大；重组嵌合病毒RecCHZE2接种猪只后没有发热和明显的白细胞减少，在接种后第12天检测到一过性的病毒血症；对接种猪血清检测结果表明，针对2型毒株的相应抗体在接种后的20 d达到高峰；接种猪血清针对C株和HZ1-08毒株的中和抗体效价相当，但C株免疫猪血清对流行毒株的中和抗体水平降低。【结论】重组嵌合病毒RecCHZE2不仅保留C株病毒弱毒的特性，且可提高针对Ⅱ型流行毒株的抗体水平。

猪瘟病毒石门重组标记毒株的构建与拯救

朱元源, 韩焘, 邹兴启, 范学政, 徐璐, 王琴, 赵启祖

中国农业科学. 2013, 46(1): 187-194. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2013.01.022

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【目的】中国控制猪瘟主要采用疫苗免疫，现有的猪瘟兔化弱毒疫苗有较好的免疫保护效果，但是不能从血清学上区分疫苗免疫猪与自然感染猪，猪瘟标记疫苗的研制与配套检测技术的开发可有效解决这一问题。【方法】利用猪瘟病毒低温诱变弱毒T株感染性克隆，将其全长结构蛋白基因替换为猪瘟病毒石门毒株全长结构蛋白基因，得到猪瘟石门重组病毒的全长感染性克隆pSMT；随后在pSMT E1蛋白的C端插入Flag抗原基因作为鉴别标记，构建猪瘟石门重组标记病毒的感染性克隆pSMT-Flag。经电转染法拯救出两株重组病毒vSMT和vSMT-Flag，通过SK6细胞进行病毒传代以获得重组病毒。【结果】多组酶切鉴定表明两株重组质粒成功构建，PCR扩增及测序、免疫过氧化酶单层细胞试验（IPMA）表明重组病毒已成功拯救且能成功传代。【结论】该标记病毒能够与Flag单抗发生特异性反应，且不影响E2蛋白中和表位与猪瘟单抗的结合，因此该毒株为研制CSFV新型标记疫苗提供了思路。

一个亚洲棉MYB家族新基因的克隆及特征分析

杨召恩, 杨作仁, 刘坤, 刘传亮, 张朝军, 李付广

中国农业科学. 2013, 46(1): 195-204. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2013.01.023

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【目的】克隆亚洲棉MYB家族的一个新基因（GaMYB2），研究其表达模式，分析其预期编码蛋白。【方法】利用RT-PCR和RACE技术克隆亚洲棉MYB2的cDNA序列全长；应用生物信息学软件分析该基因及预期编码蛋白的特征；采用实时荧光定量PCR技术对该基因的组织特异性和PEG6000模拟干旱胁迫处理下的表达模式进行分析。【结果】从亚洲棉(Gossypium arboreum L.)中克隆了MYB家族的一个新基因MYB2，该基因全长1 117 bp,ORF全长840 bp，编码279个氨基酸，含有MYB保守域，氨基酸的BALSTP分析表明GaMYB2氨基酸序列与已报道的水稻（BAA23338.1）、小麦(AAT37168.1)等的序列有40.50%到68.20%的相似性。亚细胞定位表明该基因在细胞核中表达，实时荧光定量PCR结果表明该基因在根和花中的表达量较高，并且响应17%的PEG6000模拟干旱胁迫处理，上调表达。【结论】GaMYB2是亚洲棉MYB家族的一个新基因，并认为该基因可能在棉花调控干旱胁迫的生理适应过程中发挥重要作用。

油菜BnICE1的克隆及表达分析

张腾国, 常燕, 王娟, 王宁, 王圆圆, 陈琼琼, 孙万仓

中国农业科学. 2013, 46(1): 205-214. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2013.01.024

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【目的】从超强抗寒油菜品种陇油6号中克隆抗寒转录因子BnICE1，并对其进行序列特征分析，研究BnICE1在低温胁迫下表达水平的变化，探讨BnICE1对油菜耐低温胁迫能力的影响。【方法】利用RACE技术获得油菜BnICE1全长的cDNA序列。对该序列进行生物信息学分析，采用实时荧光定量PCR研究BnICE1低温及不同组织表达量。【结果】cDNA片段全长1 737 bp，包含1 500 bp完整的开放阅读框，该基因编码499个氨基酸残基，分子量53.2 kD，等电点5.0。序列比对表明，该蛋白C端含有一个典型的bHLH结构域，与其它植物的ICE1蛋白具有较高的同源性，因此命名为BnICE1（GenBank登录号为JF268687）。进化树分析表明，BnlCE1同羊草和白菜亲缘关系较近。实时荧光定量PCR结果表明，该基因在油菜茎、叶和下胚轴均有表达，下胚轴中表达量最高，同时该基因的表达受低温胁迫诱导。【结论】从油菜中克隆了抗寒基因BnICE1，实时荧光定量PCR分析表明其在油菜适应低温胁迫的过程中发挥作用。

基于高斯函数的水稻叶曲线动态模拟

张永会, 汤亮, 刘小军, 刘蕾蕾, 曹卫星, 朱艳

中国农业科学. 2013, 46(1): 215-224. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2013.01.025

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【目的】以高斯函数为基础构建空间曲线模型，模拟研究水稻叶曲线空间变化特征。【方法】基于不同年份与施氮水平的水稻桶栽试验，定期利用三维激光扫描仪FastScan获取水稻主茎不同叶位叶曲线空间坐标数据，并利用动态建模技术构建水稻主茎不同叶位叶曲线动态模拟模型。【结果】水稻主茎不同叶位叶曲线末端与y轴正方向的夹角（AH）随生长度日（GDD）呈快-慢-快的变化趋势，符合S型曲线；从第1叶到第7叶，AH的最大值随叶位增加而增加，随后随叶位增加而减小；鞘叶夹角∠BFC与AH呈极显著线性关系。本文利用Logistic方程分别描述了不同施氮水平下水稻主茎各叶位叶曲线对应的AH以及叶曲线模型参数Sm随生长度日GDD的变化；使用分段函数描述了AH最大值随叶位的变化；将适宜施氮条件下水稻主茎第7叶位叶曲线末端与y轴正方向的夹角作为品种参数量化品种对叶曲线的影响，引入氮素影响因子量化不同氮素水平对叶片披垂度的影响。利用独立田间试验资料对所建立的模型进行检验后显示，不同施氮水平下主茎不同叶位叶曲线实测点到模拟曲线的改进Hausdorff距离（LTS-HD）的均值在分蘖中期和拔节期分别低于0.88 cm和1.18 cm。【结论】模型对水稻主茎叶曲线的空间动态变化过程具有较好的预测性，研究结果为进一步提高水稻叶片及植株的可视化效果提供了技术支持。

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