中国农业科学 ›› 2023, Vol. 56 ›› Issue (7): 1322-1332.doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2023.07.010
收稿日期:
2022-12-20
接受日期:
2023-01-31
出版日期:
2023-04-01
发布日期:
2023-04-03
联系方式:
邵红扬,E-mail:hongyangshao2021@163.com。孟香,E-mail:1210987080@qq.com。邵红扬和孟香为同等贡献作者。
基金资助:
SHAO HongYang(), MENG Xiang(
), ZHANG Tao, CHEN Min(
)
Received:
2022-12-20
Accepted:
2023-01-31
Published:
2023-04-01
Online:
2023-04-03
摘要:
【目的】 明确美国白蛾(Hyphantria cunea)响应槲皮素诱导的差异表达P450基因及系统发育关系,探究美国白蛾P450基因对槲皮素诱导的剂量效应,以及P450基因在美国白蛾对槲皮素的解毒适应中的作用。【方法】 基于槲皮素诱导的美国白蛾中肠转录组数据,从中筛选显著差异表达的P450基因,应用MEGA X软件对5个P450 基因及其他近缘物种的P450基因进行系统进化关系分析;通过RT-qPCR技术检测5个P450基因在不同槲皮素浓度(0.5%、1.0%、2.0%和4.0%)处理下的表达模式;克隆CYP6ZB2全长cDNA序列,利用RNA干扰(RNAi)技术探明CYP6ZB2基因沉默对美国白蛾体重及存活率的影响。【结果】 从转录组的差异表达基因中筛选到5个显著响应槲皮素诱导的P450基因,经P450命名委员会分别被命名为CYP4G296、CYP4G297、CYP333A30、CYP304F33和CYP6ZB2(GenBank登录号:ON032363—ON032367)。系统发育分析表明,这5个基因被聚类到CYP2、CYP3、CYP4和线粒体CYP进化枝。RT-qPCR结果表明,P450基因响应槲皮素胁迫具有显著的剂量效应,CYP4G297、CYP304F33、CYP333A30和CYP4G296的表达均被不同浓度槲皮素抑制,CYP6ZB2的表达在0.5%—2.0%的槲皮素诱导下显著上调,而在4.0%的槲皮素浓度下被显著抑制。克隆CYP6ZB2的全长cDNA序列,CYP6ZB2具有完整的开放阅读框(ORF),编码500个氨基酸。RNAi结果表明,注射两种剂量(500和1 000 ng)dsCYP6ZB2均可显著抑制CYP6ZB2的表达,注射1 000 ng dsCYP6ZB2 48 h后干扰效率达到最高(96.9%)。CYP6ZB2被干扰的美国白蛾幼虫经0.5%槲皮素处理后体重增长量低于对照组,存活率(53.33%)分别为未处理组的61.5%和注射双蒸水组的72.7%(P<0.05)。【结论】 筛选鉴定到美国白蛾响应槲皮素诱导的5个P450基因,槲皮素对5个基因的诱导表达具有明显的剂量效应,说明不同的P450基因对槲皮素的响应模式存在差异。RNAi能高效沉默CYP6ZB2,0.5%槲皮素对CYP6ZB2被干扰的美国白蛾幼虫的生长发育具有一定抑制作用,表明CYP6ZB2在美国白蛾对槲皮素的解毒适应中发挥着重要作用。
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表1
RT-qPCR、基因克隆和dsRNA合成所用引物"
基因名称 Gene name | 引物序列 Primer sequence | 扩增效率 Amplification efficiency (%) | 相关系数 Correlation coefficient | 引物用途 Primer usage |
---|---|---|---|---|
CYP4G296 | F-CGACTCAGATCGCCCAGTAA R-TAACAGGCACTGGTGGGAAC | 99.2 | 0.995 | RT-qPCR |
CYP4G297 | F-ACAACAGTAGTGATTGCCACG R-TCGGGCAGGAAATTATCAGGA | 106.4 | 0.997 | RT-qPCR |
CYP333A30 | F-GGTGGCTATCACATCCCTCC R-TCGCCCGCGGATAATACTTT | 91.4 | 0.984 | RT-qPCR |
CYP304F33 | F-AACTTACGCTCGCCAGACAA R-TGCAGGCTTCAGTAATGGCT | 99.9 | 0.988 | RT-qPCR |
CYP6ZB2 | F-ACCCGAGAAATTTGACCCAGA R-TACACACACGCCGAATTGGA | 103.5 | 0.993 | RT-qPCR |
GAPDH | F-GACTGGCATGGCTTTCAGAG R-CATCGTAGCTAGCGGGTTTG | 96.5 | 0.999 | RT-qPCR |
EF1-α | F-TTATCGTCGCTGCTGGTACT R-GAGTGTGAAAGCGAGCAGAG | 103.5 | 0.999 | RT-qPCR |
CYP6ZB2 | F-ATGTCGGCTTTCTTACTGCTGT R-TTAGATTGGTATAAAATTGAGATATATGTCT | 基因克隆 Gene cloning | ||
dsCYP6ZB2 | F-TAATACGACTCACTATAGGG ATGTCGGCTTTCTTACTGCTGT R-TAATACGACTCACTATAGGGTTAGATTGGTATAAAATTGAGATATATGTCT | dsRNA合成 dsRNA synthesis |
表2
响应槲皮素诱导的P450基因的BLASTX结果"
基因名称Gene name | 登录号 Accession number | 转录水平 Transcription level | 编码蛋白长度 Encoded protein length (aa) | Best B<BOLD>LASTX</BOLD> match | ||||
---|---|---|---|---|---|---|---|---|
蛋白质名称 Protein name | 物种 Species | E值 E-value | 一致性 Identity (%) | 登录号 Accession number | ||||
CYP4G296 | ON032363 | Down (12%) | 362 | Cytochrome P450 CYP4G | 黑肾卷裙夜蛾 Plecoptera oculata | 0 | 90.11 | QFS21543.1 |
CYP4G297 | ON032364 | Down (5%) | 146 | Cytochrome P450 CYP4G | 美国白蛾 H. cunea | 6e-173 | 100.00 | BBD13397.1 |
CYP333A30 | ON032365 | Down (24%) | 507 | Cytochrome P450 CYP12A2-like | 粉纹夜蛾 T. ni | 0 | 63.85 | XP_026734554.1 |
CYP304F33 | ON032366 | Down (25%) | 289 | CYP15C1 | 大豆夜蛾 Anticarsia gemmatalis | 3e-179 | 79.29 | UBY12684.1 |
CYP6ZB2 | ON032367 | Up (2.69倍 2.69 times) | 500 | Cytochrome P450 6B6-like | 棉铃虫 H. armigera | 8e-171 | 51.65 | XP_021201217.1 |
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