中国农业科学 ›› 2023, Vol. 56 ›› Issue (7): 1311-1321.doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2023.07.009
杨岭1(), 田晓丽2, 桂连友1, 王福莲1, 张国辉1(
)
收稿日期:
2022-12-10
接受日期:
2023-01-17
出版日期:
2023-04-01
发布日期:
2023-04-03
联系方式:
杨岭,E-mail:202071666@yangtzeu.edu.cn。
基金资助:
YANG Ling1(), TIAN XiaoLi2, GUI LianYou1, WANG FuLian1, ZHANG GuoHui1(
)
Received:
2022-12-10
Accepted:
2023-01-17
Published:
2023-04-01
Online:
2023-04-03
摘要:
【目的】 通过构建柑橘大实蝇(Bactrocera minax)BminOBP6的C末端截短突变体(TOBP6),比较野生型BminOBP6和突变体TOBP6对气味配体的结合能力,检测在不同pH条件下二者对气味配体结合能力的差异,为揭示BminOBP6与配体的互作机制提供参考。【方法】 通过在线工具SWISS MODEL对BminOBP6进行同源建模,根据构建的3D模型确定将被切除的BminOBP6第6个α螺旋(α6)之后的C末端序列;设计特异性引物扩增BminOBP6的C末端截短突变体(TOBP6)的编码序列,即TOBP6;构建重组表达载体pET32a/TOBP6,将此重组载体与实验室保存的重组载体pET32a/BminOBP6分别转入原核细胞BL21(DE3)中,异源表达野生型BminOBP6及其突变体TOBP6;以1-NPN为荧光探针进行荧光竞争结合试验,检测BminOBP6和TOBP6在两种pH环境(pH 7.4和pH 5.0)下对1-十一醇和(+)-柠檬烯的结合能力。【结果】 序列比对结果显示,BminOBP6与致倦库蚊(Culex quinquefasciatus)CquiOBP1的序列具有很高的相似性,为62.6%,远高于30%,因此选择以CquiOBP1的3D结构作为BminOBP6同源建模模板。模型显示BminOBP6的α6之后是由8个氨基酸残基(D117—P124)组成的C末端序列,即将被切除的C末端序列。在此基础上设计引物克隆获得了编码TOBP6的cDNA序列,并构建了其重组表达载体pET32a/TOBP6,该重组载体和pET-32a/BminOBP6重组载体分别转入大肠杆菌细胞中进行了异源表达。荧光竞争结合试验结果显示,在pH为7.4时,BminOBP6与1-十一醇和(+)-柠檬烯具有很强的结合能力,Ki值分别为6.89和9.50 μmol·L-1。当pH降至5.0时,BminOBP6却丧失了对1-十一醇的结合能力,同时与(+)-柠檬烯的结合能力也大幅减弱,Ki值从9.50 μmol·L-1升至31.26 μmol·L-1;而不论在何种pH条件下,TOBP6均丧失了对这两种气味配体的结合能力。【结论】 pH在柑橘大实蝇 BminOBP6与其配体结合和释放过程中发挥了重要作用,并且BminOBP6的C末端在配体的结合中起着关键作用。
杨岭, 田晓丽, 桂连友, 王福莲, 张国辉. 柑橘大实蝇气味结合蛋白BminOBP6与其气味配体的互作机制[J]. 中国农业科学, 2023, 56(7): 1311-1321.
YANG Ling, TIAN XiaoLi, GUI LianYou, WANG FuLian, ZHANG GuoHui. Interaction Mechanisms Between Bactrocera minax Odorant-Binding Protein BminOBP6 and Its Ligands[J]. Scientia Agricultura Sinica, 2023, 56(7): 1311-1321.
图1
BminOBP6同源建模构建的三维结构 A:BminOBP6与模板蛋白CquiOBP1氨基酸序列同源性比对Sequence alignment between BminOBP6 and CquiOBP1;B:BminOBP6三维结构3D structure of BminOBP6;C:BminOBP6 Pro-CHECK质量评估结果The result of Pro-CHECK quality assessment of 3D structure of BminOBP6;D:BminOBP6的C末端截短突变体(TOBP6)三维结构3D structure of BminOBP6 C terminus-truncated mutant (TOBP6)"
图3
pET-32a/BminOBP6与pET-32a/TOBP6的表达和纯化产物的SDS-PAGE分析 A:1:未经诱导的pET-32a/BminOBP6表达产物Expression products of pET-32a/BminOBP6 without induction;2:经诱导的pET-32a/BminOBP6表达产物Expression products of pET-32a/BminOBP6 with induction;3:BminOBP6上清The supernatant of BminOBP6;4:BminOBP6包涵体The inclusion body of BminOBP6;5:BminOBP6带有His-Tag BminOBP6 with His-Tag;6:BminOBP6去除His-Tag BminOBP6 without His-Tag;M1:宝生物蛋白分子量标准TaKaRa protein molecular weight marker;M2:赛默飞预染蛋白分子量标准Thermo scientific pageruler prestained protein ladder。B:1:未经诱导的pET-32a/TOBP6表达产物Expression products of pET-32a/TOBP6 without induction;2:经诱导的pET-32a/TOBP6表达产物Expression products of pET-32a/TOBP6 with induction;3:TOBP6上清The supernatant of TOBP6;4:TOBP6包涵体The inclusion body of TOBP6;5:TOBP6带有His-Tag TOBP6 with His-Tag;6:TOBP6去除His-Tag TOBP6 without His-Tag;M2:赛默飞预染蛋白分子量标准Thermo scientific pageruler prestained protein ladder"
图4
BminOBP6和TOBP6的荧光竞争结合特性 A:pH 7.4条件下的BminOBP6 BminOBP6 at pH 7.4;B:pH 5.0条件下的BminOBP6 BminOBP6 at pH 5.0;C:pH 7.4条件下的TOBP6 TOBP6 at pH 7.4;D:pH 5.0条件下的TOBP6 TOBP6 at pH 5.0。1:与1-NPN的结合曲线及Scatchard方程Binding curves and Scatchard plots of protein and 1-NPN;2:与1-十一醇的竞争结合曲线Binding curves of protein to 1-undecanol;3:与(+)-柠檬烯的竞争结合曲线Binding curves of protein to (+)-limonene"
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