【目的】建立一种基于间接ELISA法的检测技术,用于检测羊副结核分枝杆菌(Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis, MAP)特异性抗体,以期为羊副结核病(Johne’s disease, JD)的流行病学监测与防控提供一种高效、可靠的血清学方法。【方法】选用前期分离菌株(MAP-XJB13)的培养上清作为MAP包被抗原,通过对包被液和包被条件、封闭液和封闭条件、抗原包被浓度、血清稀释比例、抗体孵育和显色时间、显色液品牌、样品稀释液和酶标二抗保护液的筛选和优化,确定间接ELISA最佳反应条件和临界值。通过敏感性、特异性、重复性、保存期和符合率评价已建立的羊MAP间接ELISA抗体检测方法的效果。最后,使用初步组装的试剂盒应用于黑龙江和内蒙古羊的临床样品检测。【结果】确定ELISA最佳反应条件为:包被液为CBS缓冲液,包被条件为37 ℃ 4 h,封闭液为5%鱼明胶+5%海藻糖+12%PEG4000,封闭条件为37 ℃ 2 h,抗原包被浓度为80 µg·mL-1,血清稀释度为1﹕40,酶标二抗血清稀释度为1﹕30 000,孵育条件为25 ℃条件下、一抗孵育30 min、酶标二抗孵育30 min、显色15 min,显色液为博奥龙,样品稀释液为1%卵清蛋白+0.5%海藻糖,酶标二抗保护液为0.1%卵清蛋白;建立的羊MAP间接ELISA抗体检测方法临界值为0.460,敏感性为95.89%,特异性为96.12%;交叉反应结果显示,在阴阳性结果成立的前提下,与羊布鲁氏菌阳性血清、绵羊丝状支原体阳性血清、山羊伪结核棒状杆菌阳性血清、羊结核阳性血清、山羊小反刍兽疫阳性血清、绵羊小反刍兽疫阳性血清和羊痘病毒阳性血清无交叉反应性;批内和批间变异系数分别在0.754%—7.812%和1.252%—7.277%之间,可稳定保存8个月;羊MAP间接ELISA抗体检测试剂盒与ID.vet副结核菌ELISA抗体检测试剂盒阳性符合率为95.89%,阴性符合率为95.55%,总符合率为95.56%。黑龙江和内蒙古两地的羊MAP的抗体阳性率为10.81%。【结论】成功开发了一种针对羊MAP的间接ELISA抗体检测方法。该方法表现出优良的特异性、较高的敏感性以及较长的保存期限,为JD的防控提供了有力的技术支持。