中国农业科学 ›› 2023, Vol. 56 ›› Issue (18): 3556-3573.doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2023.18.006
哈丹丹1(), 郑红霞2(
), 张振昊2, 竺利红3, 刘浩1, 王教瑜2,3(
), 周雷2(
)
收稿日期:
2023-04-25
接受日期:
2023-07-04
出版日期:
2023-09-16
发布日期:
2023-09-21
通信作者:
联系方式:
哈丹丹,E-mail:danha61@163.com。郑红霞,E-mail:hxzh_bio@126.com。哈丹丹和郑红霞为同等贡献作者。
基金资助:
HA DanDan1(), ZHENG HongXia2(
), ZHANG ZhenHao2, ZHU LiHong3, LIU Hao1, WANG JiaoYu2,3(
), ZHOU Lei2(
)
Received:
2023-04-25
Accepted:
2023-07-04
Published:
2023-09-16
Online:
2023-09-21
摘要:
【目的】以玉米穗腐病优势病原菌和伏马毒素主要产毒菌拟轮枝镰孢(Fusarium verticillioides)为研究对象,构建组成型表达绿色荧光蛋白GFP、红色荧光蛋白DsRED、过氧化物酶体靶向标记蛋白DsRED-PTS1和细胞骨架F-actin结合蛋白LifeAct-GFP的荧光菌株,观察拟轮枝镰孢侵染玉米须表皮的穿透结构,明确拟轮枝镰孢侵染结构形成的调控机制和影响因素。【方法】通过农杆菌介导的遗传转化方法将荧光表达载体pCOM-GFP、pCOM-DsRED、pCOM-DsRED-PTS1和pCOM-LifeAct-GFP分别导入拟轮枝镰孢野生型菌株D85-2中,PCR鉴定含有目标基因的转化子,激光共聚焦显微镜观察各荧光蛋白的表达和分布;接种玉米须观察侵染结构;赛璐酚膜模拟植物表皮穿透试验,观察穿透结构和F-actin的动态组装;使用F-actin聚合抑制剂Latrunculin A、三环唑和活性氧抑制剂DPI(diphenyleneiodonium chloride)检测穿透结构形成的影响因素。【结果】建立了以遗传霉素G418为抗性标记的遗传转化方法;FV-GFP和FV-DsRED菌株分别具有清晰、明亮的绿色荧光和红色荧光,FV-DsRED-PTS1菌株中红色荧光呈圆点状分布,符合真菌中过氧化物酶体的分布特征,FV-LifeAct-GFP菌株孢子和菌丝内部具有丝絮状绿色荧光,符合真菌中F-actin蛋白的分布特征;玉米须表皮侵染过程中观察到菌丝顶端膨大类似附着枝侵染结构;赛璐酚膜模拟穿透试验观察到穿透结构中F-actin蛋白的成环组装;药物胁迫试验表明,穿透结构的形成受F-actin蛋白聚合和活性氧调控。同时,三环唑能够抑制穿透。【结论】构建了4种荧光标记菌株,细胞定位清晰,具有正常的生长表型和致病力,能够满足致病机制相关研究需求;明确了拟轮枝镰孢在侵染玉米时能够形成一种菌丝顶端膨大的类似附着枝状的侵染结构;确定了F-actin成环聚集、细胞骨架组装和活性氧调控是影响拟轮枝镰孢侵染结构形成的关键因素。
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图3
拟轮枝镰孢荧光转化子的PCR鉴定 A:FV-GFP;B:FV-DsRED;C:FV-LifeAct-GFP;D:FV-DsRED-PTS1。P:质粒阳性对照(pCOM-GFP、pCOM-DsRED、pCOM-LifeAct-GFP、pCOM-DsRED-PTS1)The plasmids pCOM-GFP, pCOM-DsRED, pCOM-LifeAct-GFP, pCOM-DsRED-PTS1;WT:野生型D85-2基因组阴性对照Negative control standing for the wild-type D85-2 genome;随机挑选稳定遗传的转化子FV-GFP(G1,G2,G3)、FV-DsRED(R1,R2,R3)、FV-LifeAct-GFP(A1,A2,A3)和FV-DsRED-PTS1(P1,P2,P3)各3个,提取基因组DNA,PCR扩增检测G418抗性基因NPTII片段(引物:G418-F/G418-R)、GFP片段(引物:GFP-F/GFP-R)和DsRED片段(引物:RED-F/RED-R) Genomic DNA samples of randomly selected three stable genetic transformants FV-GFP (G1, G2, G3), FV-DsRED (R1, R2, R3), FV-LifeAct-GFP (A1, A2, A3), and FV-DsRED-PTS1 (P1, P2, P3), were amplificated by PCR to detect NPTII fragments of G418 resistance genes (primers: G418-F/G418-R), GFP fragments (primers: GFP-F/GFP-R), and DsRED fragments (primers: RED-F/RED-R)"
图5
FV-GFP和FV-DsRED菌株的荧光观察 A:FV-GFP菌株不同发育阶段孢子和菌丝中GFP绿色荧光的分布和定位Distribution and localization of GFP green fluorescence in spores and hyphae of FV-GFP strain at different developmental stages;B:FV-DsRED菌株不同发育阶段孢子和菌丝中DsRED红色荧光的分布和定位Distribution and localization of DsRED fluorescence in spores and hyphae of FV-DsRED strain at different developmental stages"
图6
FV-LifeAct-GFP和FV-DsRED-PTS1菌株中F-actin细胞骨架和过氧化物酶体的荧光观察 A:FV-LifeAct-GFP菌株不同发育阶段孢子和菌丝中F-actin细胞骨架绿色荧光信号的分布和定位Distribution and localization of F-actin cytoskeleton with GFP fluorescence in spores and hyphae of FV-LifeAct-GFP strain at different developmental stages;B:FV-DsRED-PTS1菌株不同发育阶段孢子和菌丝中过氧化物酶体红色荧光信号的分布和定位Distribution and localization of peroxisomes with DsRED fluorescence in spores and hyphae of FV-DsRED-PTS1 strain at different developmental stages"
图8
FV-LifeAct-GFP菌株中F-actin细胞骨架绿色荧光以及FV-DsRED-PTS1菌株中过氧化物酶体红色荧光与细胞壁染色剂CFW的混合定位观察 A:FV-LifeAct-GFP菌株中F-actin细胞骨架绿色荧光与CFW的混合定位观察Observation of GFP labeled F-actin cytoskeleton mixed with CFW staining in the FV-LifeAct-GFP strain;B:FV-DsRED-PTS1菌株中过氧化物酶体红色荧光与CFW的混合定位观察Observation of DsRED labeled peroxisomes with red fluorescence mixed with CFW staining in the FV-DsRED-PTS1 strain"
图9
拟轮枝镰孢侵染玉米须的细胞结构以及穿透结构中F-actin蛋白的成环组装 A:新鲜玉米须接种拟轮枝镰孢野生型菌株D85-2 24 h后的发病情况Disease symptom of fresh maize silk 24 hours after inoculation with wild-type strain D85-2;CK:H2O对照H2O control。B:拟轮枝镰孢野生型菌株D85-2分生孢子接种玉米须24 h后形成的菌丝顶端膨大的附着枝状侵染结构The conidia of the wild-type strain D85-2 of F. verticillioides inoculated on maize silk for 24 hours form an enlarged hyphopodium like infection structures at the top of the hypha。C:拟轮枝镰孢在玉米须表皮细胞间隙形成的穿透结构The penetrating structure formed by F. verticillioides in the intercellular space of maize silk epidermis。D:FV-LifeAct-GFP荧光菌株的穿透结构及其内部F-actin蛋白的成环状组装The penetration structure of FV-LifeAct-GFP fluorescent strain and the circular assembly of intracellular F-actin proteins"
图10
F-actin肌动蛋白聚合抑制剂Latrunculin A降低了拟轮枝镰孢的膜穿透能力 Before:拟轮枝镰孢分生孢子在覆盖玻璃纸的CM平板上培养3 d Conidia of F. verticillioides were inoculated on the center of the cellophane membrane laid on the CM plates cultured for 3 days;After (0 dpi):CM平板上玻璃纸连同生长的菌丝一起被揭除的时间点The time point when the cellophane membranes were removed;After (2 dpi) :揭除玻璃纸后继续培养2 d的CM平板The time point when the plates without the cellophane membranes were cultured for next two days。图11同The same as Fig. 11"
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