中国农业科学 ›› 2024, Vol. 57 ›› Issue (2): 227-235.doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2024.02.001
郭乃辉1,2(), 张文忠1(
), 圣忠华2(
), 胡培松1,2(
)
收稿日期:
2023-06-13
接受日期:
2023-07-24
出版日期:
2024-01-16
发布日期:
2024-01-19
通信作者:
联系方式:
郭乃辉,E-mail:guonaihuirice@163.com。张文忠,E-mail:zwzhong@126.com。郭乃辉和张文忠为同等贡献作者。
基金资助:
GUO NaiHui1,2(), ZHANG WenZhong1(
), SHENG ZhongHua2(
), HU PeiSong1,2(
)
Received:
2023-06-13
Accepted:
2023-07-24
Published:
2024-01-16
Online:
2024-01-19
摘要:
【目的】 休眠是水稻重要的农艺性状。适当的休眠可以抑制水稻的穗发芽现象,是确保产量和品质的关键因素。然而,水稻休眠调控的基因及其调控网络仍需进一步研究。已知基因MODD编码未知功能的蛋白,负向调控水稻脱落酸信号和抗旱性,但其调控水稻休眠的功能未知。研究MODD在调控水稻休眠中的功能,有助于完善水稻休眠调控网络,同时为抗穗发芽遗传育种提供新的理论基础和种质资源。【方法】 根据RGAP数据库公布的基因序列,构建MODD的CRISPR-Cas9敲除载体,通过农杆菌介导的遗传转化方法转化中花11(ZH11)愈伤组织,从而获得水稻转基因植株;利用PCR扩增、测序技术及qRT-PCR技术筛选并鉴定MODD敲除纯合系;根据2个突变系(KO-1和KO-2)的CDS得到突变系的氨基酸序列,然后,用DNAMAN对比ZH11和2个突变系(KO-1和KO-2)的蛋白序列;利用Linux系统筛选出MODD在水稻中的同源基因;取开花后35 d的种子,调查ZH11和敲除系的发芽率;利用酵母单杂和LUC试验验证MODD的上游基因。【结果】 查找到水稻中有6个MODD的同源基因,分别为LOC_Os07g41160、LOC_Os03g30570、LOC_Os03g53630、LOC_Os04g35430、LOC_Os03g17050和LOC_Os06g01170;成功构建了敲除载体,并转入ZH11中,获得2个纯合突变系(KO-1和KO-2);qRT-PCR结果表明,2个突变系(KO-1和KO-2)的MODD表达量显著降低;蛋白序列分析表明,KO-1和KO-2的移码突变造成了蛋白翻译的提前终止;发芽率结果显示,2个突变系(KO-1和KO-2)的发芽率在吸水第3天比ZH11分别显著降低了15%和15%;之后差异逐渐扩大,在第6天差异达到最大,比ZH11分别显著降低35%和35%;2个突变系(KO-1和KO-2)的穗发芽现象显著低于ZH11;酵母单杂试验结果表明,在酵母中,ABI5可以结合MODD的启动子区域,并且进一步把结合范围缩小至300 bp以内;LUC结果显示,加入ABI5的荧光值是单独加NONE空载荧光值的2.6倍,说明ABI5可以激活MODD的表达。【结论】 敲除MODD可以增加种子的休眠,MODD可能通过ABA信号途径调控种子休眠。
郭乃辉, 张文忠, 圣忠华, 胡培松. 利用CRISPR/Cas9技术编辑MODD增强水稻休眠性[J]. 中国农业科学, 2024, 57(2): 227-235.
GUO NaiHui, ZHANG WenZhong, SHENG ZhongHua, HU PeiSong. CRISPR/Cas9-Mediated Editing of MODD Enhances Rice Dormancy[J]. Scientia Agricultura Sinica, 2024, 57(2): 227-235.
表1
文中的引物"
引物名称Primer name | 引物序列Primer sequence (5′-3′) | 用途Usage |
---|---|---|
MODD-CRISPR-F | TGTGTGGGATGAATGGAGGAAGCGAA | CRISPR/Cas9载体构建 CRISPR/Cas9 vector construction |
MODD-CRISPR-R | AAACTTCGCTTCCTCCATTCATCCCA | |
CX-F | TCCCAGTCACGTTGTAA | 筛选阳性克隆Screening for positive clones |
pLACZ-MODD-F | ATCTGTCGACCTCGAGACTCAAACGGACGAAATATGTGG | 酵母单杂Y1H |
pLACZ-MODD-R | GAGCACATGCCTCGAGTCCGGCAAGCTAGCTAGCCA | |
PB42AD-ABI5-F | TGCCTCTCCCGAATTCATGGCATCGGAGATGAGCAA | |
PB42AD-ABI5-R | CGAGTCGGCCGAATTCTCACCACATGCAGCTGCCGC | |
pLACZ-MODD-1-F | ATCTGTCGACCTCGAGACTCAAACGGACGAAATATGTGG | |
pLACZ-MODD-1-R | GAGCACATGCCTCGAGGGCCGCTGCGACGAG | |
pLACZ-MODD-2-F | ATCTGTCGACCTCGAGGTACGGCCCGGCCC | |
pLACZ-MODD-2-R | GAGCACATGCCTCGAGTTCTCACCCGATCCACACC | |
pLACZ-MODD-3-F | ATCTGTCGACCTCGAGACGTGTCGGTGTGGAGGG | |
pLACZ-MODD-3-R | GAGCACATGCCTCGAGGAGCCGAAGCCGACCAG | |
pLACZ-MODD-4-F | ATCTGTCGACCTCGAGCTACGGCGATGGTCGGCTTGA | |
pLACZ-MODD-4-R | GAGCACATGCCTCGAGTCCGGCAAGCTAGCTAGCCA | |
p190Luc-MODD-F | GGCCAGTGCCAAGCTTACTCAAACGGACGAAATATGTGG | LUC活性检测 LUC activity test |
p190Luc-MODD-R | AGGGTCTTGCAGATCTTCCGGCAAGCTAGCTAGCCA | |
NONE-ABI5-F | TAGAACTAGTGGATCCATGGCATCGGAGATGAGCA | |
NONE-ABI5-R | GCTTGATATCGAATTCTCACCACATGCAGCTGCC | |
OsActin-qF | GTCCTCTTCCAGCCTTCCTT | 实时荧光定量分析 qRT-PCR |
OsActin-qR | CTCATCCTGTCAGCAATGCC | |
MODD-qF | GCAAGAGGGTTGAAGGCTTC | |
MODD-qR | GGGATAGGGTTGACGACGAT |
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