中国农业科学 ›› 2025, Vol. 58 ›› Issue (12): 2427-2438.doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2025.12.012
收稿日期:
2025-02-19
接受日期:
2025-04-14
出版日期:
2025-06-19
发布日期:
2025-06-19
通信作者:
联系方式:
阮桥君,E-mail:qiaojunruan@163.com
基金资助:
RUAN QiaoJun(), MAO MiaoMiao, ZHANG YuanYuan, LIN XiaoRong, CHEN ZhongZheng(
)
Received:
2025-02-19
Accepted:
2025-04-14
Published:
2025-06-19
Online:
2025-06-19
摘要:
【目的】茶氨酸是由底物乙胺和谷氨酸经茶氨酸合成酶催化合成。乙胺是茶树茶氨酸生成的主要限制因子,其由丙氨酸脱羧酶(CsAlaDC)催化丙氨酸脱羧而来。通过酵母单杂交从茶叶文库中筛选获得调控CsAlaDC的转录因子,从转录因子角度探究茶树体内乙胺合成调控的分子机制,为茶氨酸合成和后续开展茶树遗传改良提供理论基础和技术参考。【方法】以‘英红9号’茶树为材料,通过PCR克隆CsAlaDC启动子,以其为诱饵,利用酵母单杂交从文库中筛选获得候选转录因子,克隆候选转录因子的CDS,并回转验证。利用生物信息学方法对候选转录因子进行蛋白结构域、蛋白大小及可溶性分析,借助双荧光素酶试验探究候选转录因子对CsAlaDC的表达调控作用,并用亚细胞定位技术测定候选转录因子在细胞内的分布情况。【结果】克隆获得‘英红9号’茶树CsAlaDC启动子,包含真核生物基本的TATA-box和CAAT-box等启动子核心元件,I-box、G-Box、TCT-motif、TCCC-motif、Box4等光响应相关元件,CAT-box分生组织表达相关顺式作用元件,以及ABRE脱落酸响应元件、TC-rich repeats防御和压力反应顺式作用元件,还有MYB、MYC和WRKY等转录因子家族识别结合位点。以CsAlaDC启动子为诱饵进行酵母单杂交,从‘英红9号’cDNA文库中筛选获得17个结合蛋白,经初筛,获得5个候选转录因子,克隆CDS,并回转验证,获得3个转录因子:CsFBX、CsBBX和CsASR。双荧光素酶试验表明,CsBBX和CsASR对CsAlaDC具有转录激活作用,CsFBX无显著调控活性。亚细胞定位表明,CsFBX和CsBBX定位于细胞核,CsASR定位于细胞核和细胞质。【结论】从‘英红9号’cDNA文库中筛选获得3个调控乙胺合成关键酶基因CsAlaDC的转录因子:CsFBX、CsBBX和CsASR,均能结合CsAlaDC启动子,且CsBBX和CsASR对CsAlaDC具有转录激活作用。
阮桥君, 毛苗苗, 张媛媛, 林晓蓉, 陈忠正. 茶树‘英红9号’乙胺合成关键酶基因CsAlaDC转录因子的筛选[J]. 中国农业科学, 2025, 58(12): 2427-2438.
RUAN QiaoJun, MAO MiaoMiao, ZHANG YuanYuan, LIN XiaoRong, CHEN ZhongZheng. Screening of Transcription Factors for Key Enzyme Gene CsAlaDC Involved in Ethylamine Synthesis in Yinghong 9 (Camellia sinensis)[J]. Scientia Agricultura Sinica, 2025, 58(12): 2427-2438.
表1
CsAlaDC启动子调控元件分析"
位点名称 Site name | 数量 Quantity | 序列 Sequence | 功能描述 Function description |
---|---|---|---|
CAAT-box | 46 | CAAAT/CAAT/CAACCAACTCC | 启动子和增强子区域常见的顺式作用元件 Common cis-acting element in promoter and enhancer regions |
TATA-box | 121 | TATA | 启动子核心序列Core promoter element |
I-box | 1 | AAGATAAGGCT | 部分光响应元件Part of a light responsive element |
G-Box | 2 | CACGTT | 参与光反应的顺式作用调控元件 Cis-acting regulatory element involved in light responsiveness |
TCT-motif | 1 | TCTTAC | 部分光响应元件Part of a light responsive element |
TCCC-motif | 1 | TCTCCCT | 部分光响应元件Part of a light responsive element |
Box4 | 6 | ATTAAT | 部分参与光响应的保守DNA模块 Part of a conserved DNA module involved in light responsiveness |
A-box | 1 | CCGTCC | 顺式作用元件Cis-acting regulatory element |
CAT-box | 1 | GCCACT | 分生组织表达相关顺式作用元件 Cis-acting regulatory element related to meristem expression |
TC-rich repeats | 2 | ATTCTCTAAC | 防御和压力反应的顺式作用元件 Cis-acting element involved in defense and stress responsiveness |
ABRE | 6 | CGTACGTGCA | 脱落酸响应元件 Cis-acting element involved in the abscisic acid responsiveness |
MYB | 1 | CAACCA | MYB转录因子识别位点Binding sites for MYB transcription factors |
MYC | 2 | CATTTG | MYC转录因子识别位点Binding sites for MYC transcription factors |
ERE | 2 | ATTTCATA | 雌激素反应元件Estrogen response element |
W-Box | 2 | TTGACC | WRKY转录因子识别位点Binding sites for WRKY transcription factors |
表2
从文库中筛出与proCsAlaDC互作的候选蛋白"
序号 Sequence number | 基因ID Gene ID | 功能描述 Function description |
---|---|---|
1 | XM_002269237.5 | 欧亚葡萄亚硫酸盐氧化酶样蛋白Vitis vinifera sulfite oxidase-like |
2 | XM_028226709.1 | 茶树LIMR家族蛋白At5g01460样Camellia sinensis LIMR family protein At5g01460-like |
3 | XM_028196337.1 | 茶树锌指蛋白CONSTANS样4类似物Camellia sinensis zinc finger protein CONSTANS-LIKE 4-like |
4 | XM_028200475.1 | 茶树果胶酯酶抑制剂3 Camellia sinensis pectinesterase inhibitor 3 |
5 | XM_028252569.1 | 茶树未表征蛋白Camellia sinensis uncharacterized |
6 | XM_028216177.1 | 茶树器官特异性蛋白P4样Camellia sinensis organ-specific protein P4-like |
7 | XM_028234224.1 | 茶树60S核糖体蛋白L13-1样Camellia sinensis 60S ribosomal protein L13-1-like |
8 | XM_028266808.1 | 茶树可能的核酮糖-5-磷酸异构酶3(叶绿体型) Camellia sinensis probable ribose-5-phosphate isomerase 3, chloroplastic |
9 | XM_028214394.1 | 茶树40S核糖体蛋白S3a-2样Camellia sinensis 40S ribosomal protein S3a-2-like |
10 | KF880380.1 | 茶树脱落酸胁迫成熟蛋白ASR Camellia sinensis abscisic stress-ripening protein ASR (ASR) |
11 | XM_028204029.1 | 茶树F-box蛋白At5g03970样Camellia sinensis F-box protein At5g03970-like |
12 | XM_034853669.1 | 河岸葡萄未表征蛋白Vitis riparia uncharacterized |
13 | NM_001378517.1 | 欧亚葡萄60S酸性核糖体蛋白P2B样Vitis vinifera 60S acidic ribosomal protein P2B-like |
14 | XM_028233642.1 | 茶树可能的半乳糖醛酸转移酶样7 Camellia sinensis probable galacturonosyltransferase-like 7 |
15 | XM_028196820.1 | 茶树谷氨酸受体2.7样Camellia sinensis glutamate receptor 2.7-like |
16 | XM_028232263.1 | 茶树琥珀酸脱氢酶组装因子4(线粒体型样) Camellia sinensis succinate dehydrogenase assembly factor 4, mitochondrial-like |
17 | XM_010652188.2 | 欧亚葡萄可能的E3泛素蛋白连接酶XERICO Vitis vinifera probable E3 ubiquitin-protein ligase XERICO |
表3
候选转录因子蛋白的理化性质预测"
名称 Name | 长度 Length (bp) | 分子量 Molecular weight (Da) | 氨基酸总数 Number of amino acids | 等电点 Theoretical pI | 亲疏水性 Hydrophilicity | 稳定性 Stability | 亚细胞定位 Subcellular localization |
---|---|---|---|---|---|---|---|
CsFBX | 1407 | 54366.06 | 468 | 6.73 | 亲水Hydrophilic | 不稳定Unstable | 细胞核Nucleus |
CsBBX | 1080 | 39446.05 | 359 | 5.90 | 亲水Hydrophilic | 不稳定Unstable | 细胞核Nucleus |
CsASR | 546 | 19889.19 | 181 | 5.69 | 亲水Hydrophilic | 稳定Stable | 细胞质/细胞核Cytoplasm/Nucleus |
CsLIMR | 1533 | 56247.61 | 510 | 9.10 | 疏水Hydrophobic | 稳定Stable | 质膜Plasma membrane |
CsOrgan | 375 | 13840.49 | 124 | 4.97 | 亲水Hydrophilic | 稳定Stable | 细胞外基质Extracellular matrix |
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