中国农业科学 ›› 2023, Vol. 56 ›› Issue (17): 3261-3276.doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2023.17.003
• 专题:转基因、基因编辑技术培育除草剂抗性棉花 • 上一篇 下一篇
王宛如1(), 曹跃芬1, 盛况1, 陈进红1,2, 赵天伦1,2, 祝水金1,2(
)
收稿日期:
2022-12-29
接受日期:
2023-03-02
出版日期:
2023-09-01
发布日期:
2023-09-08
通信作者:
联系方式:
王宛如,E-mail:11816033@zju.edu.cn。
基金资助:
WANG WanRu1(), CAO YueFen1, SHENG Kuang1, CHEN JinHong1,2, ZHAO TianLun1,2, ZHU ShuiJin1,2(
)
Received:
2022-12-29
Accepted:
2023-03-02
Published:
2023-09-01
Online:
2023-09-08
摘要: 【目的】 棉田杂草是限制棉花生长的因素之一,与棉花争夺营养、水分和光照,不仅影响棉花的生长发育,还影响棉花的产量和品质。通过基因工程途径培育高耐草甘膦优异棉花种质,实现棉田间化学除草,提高植棉的经济效益。 【方法】 将来源于耐辐射奇球菌(Deinococcus radiodurans)的EPSPS基因1174AALdico-2连接叶绿体转运肽,以35S为启动子,将2个目的基因串联后构建棉花转化载体。运用农杆菌活体转化技术,将目的基因导入棉花品种中棉所49,获得阳性转化体植株。以受体材料中棉所49和转化体自交分离得到的非转基因NON为对照,对转化体植株进行分子特征检测、草甘膦耐受性鉴定、农艺性状和经济性状等综合评价,以筛选出优良的转基因耐草甘膦棉花材料。 【结果】 通过农杆菌活体转化方法获得138个阳性转化体,对转化体植株进行目的基因PCR检测、Southern blot、Western blot分析和ELISA检测,从中筛选出17个分子特征明确、外源基因表达量高的阳性转化体。Southern blot和核苷酸测序结果表明,转化体插入位点和拷贝数各不相同,其中,ZD131、ZD185和ZD207等3个转化体为单拷贝插入位点,外源基因插入位点分别位于棉花D亚组第7染色体、D亚组第13染色体和A亚组第12染色体。草甘膦耐受性鉴定结果表明,17个阳性转化体均高耐草甘膦,其中ZD131、ZD185和ZD207等3个转化体的耐受性在3个世代之间稳定遗传,可耐4倍的田间草甘膦推荐剂量。农艺性状和经济性状评估结果表明,ZD131、ZD185和ZD207等3个转化体植株生长发育正常,表现出铃大、衣分高、结铃性强等特点,皮棉产量超过对照,纤维品质达到优质棉水平。【结论】 将来源于耐辐射奇球菌的EPSPS基因1174AALdico-2与叶绿体转运肽连接,多基因串联后构建转化载体,农杆菌活体转化技术转入中棉所49,通过一系列筛选后获得3份优良的转基因耐草甘膦材料ZD131、ZD185和ZD207,该方法在提高棉花耐草甘膦水平的同时,也提高了转基因材料的农艺和经济性状。
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表1
FPNI-PCR引物"
引物 Primers | 序列 Sequence (5′-3′) | 退火温度 Annealing temperature (℃) | 用途 Purpose |
---|---|---|---|
LB-SP1 | TTTCTCCATAATAATGTGTGAGTAGTTCCC | 68 | 特异性引物 Special primer |
LB-SP2 | CTCATGTGTTGAGCATATAAGAAACCCTTAG | 68 | |
LB-SP3 | CTAAAACCAAAATCCAGTACTAAAATCC | 68 | |
Rb-0b | CGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTT | 68 | |
Rb-1b | CCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATC | 68 | |
Rb-2b | GAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTT | 68 | |
FP1 | GTAATACGACTCACTATAGGGCACGCGTGGTNTCGASTWTSGWGTT | 62 | 融合兼并引物 Fusion arbitrary degenerates primer |
FP2 | GTAATACGACTCACTATAGGGCACGCGTGGTNGTCGASWGANAWGAA | 62 | |
FP3 | GTAATACGACTCACTATAGGGCACGCGTGGTWGTGNAGWANCANAGA | 62 | |
FP4 | GTAATACGACTCACTATAGGGCACGCGTGGTAGWGNAGWANCAWAGG | 62 | |
FP5 | GTAATACGACTCACTATAGGGCACGCGTGGTNGTAWAASGTNTSCAA | 62 | |
FP6 | GTAATACGACTCACTATAGGGCACGCGTGGTNGACGASWGANAWGAC | 62 | |
FP7 | GTAATACGACTCACTATAGGGCACGCGTGGTNGACGASWGANAWGAA | 62 | |
FP8 | GTAATACGACTCACTATAGGGCACGCGTGGTGTNCGASWCANAWGTT | 62 | |
FP9 | GTAATACGACTCACTATAGGGCACGCGTGGTNCAGCTWSCTNTSCTT | 62 | |
FSP1 | GTAATACGACTCACTATAGGGC | 62 | |
FSP2 | ACTATAGGGCACGCGTGGT | 62 |
表2
1174AALdico-2在3个转化体不同组织的表达量"
供试材料 Plant material | 1174AALdico-2±SD (µg·g-1) | |||
---|---|---|---|---|
根Root | 茎Stem | 叶Leaf | 种子Seed | |
ZD131 | 14.07±1.22 | 14.20±1.20 | 14.22±1.20 | 12.16±1.11 |
ZD185 | 13.87±1.32 | 13.88±1.40 | 14.12±1.21 | 11.26±1.21 |
ZD207 | 13.57±1.24 | 14.22±1.50 | 13.18±1.30 | 11.56±1.21 |
NON (CK1) | 0 | 0 | 0 | 0 |
中棉所49 CCRI 49 (CK2) | 0 | 0 | 0 | 0 |
表3
棉花转化体鲜重减少50%时的草甘膦浓度"
供试材料 Plant material | IC50草甘膦浓度 IC50 glyphosate concentration (mmol·L-1) | 标准误 Standard error |
---|---|---|
ZD131 | 57.60 | ±2.03a |
ZD135 | 51.40 | ±2.33ab |
ZD157 | 45.50 | ±2.34ab |
ZD159 | 44.30 | ±2.12b |
ZD163 | 47.40 | ±2.29ab |
ZD169 | 46.60 | ±2.29ab |
ZD171 | 41.10 | ±2.33b |
ZD185 | 58.50 | ±1.78a |
ZD187 | 46.60 | ±1.75ab |
ZD197 | 39.30 | ±1.67b |
ZD199 | 38.30 | ±1.77b |
ZD207 | 58.80 | ±1.98a |
ZD237 | 45.50 | ±2.28ab |
ZD241 | 46.30 | ±1.65ab |
ZD243 | 45.50 | ±2.56ab |
ZD251 | 50.10 | ±2.67ab |
ZD255 | 55.30 | ±2.67a |
NON (CK1) | 0.33 | ±0.03c |
中棉所49 CCRI 49 (CK2) | 0.41 | ±0.03c |
表4
不同剂量草甘膦处理后棉花转化体的为害指数"
材料 Plant material | 推荐剂量(1﹕200稀释) Recommended dose (1﹕200 dilution) | 2倍推荐剂量(1﹕100稀释) 2 times recommended dose (1﹕100 dilution) | 4倍推荐剂量(1﹕50稀释) 4 times recommended dose (1﹕50 dilution) | ||||||||||||
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
Ⅰ | Ⅱ | Ⅲ | Ⅳ | 平均Average | Ⅰ | Ⅱ | Ⅲ | Ⅳ | 平均 Average | Ⅰ | Ⅱ | Ⅲ | Ⅳ | 平均 Average | |
ZD131 | 1.20 | 0.20 | 1.00 | 0.20 | 0.65 | 0.10 | 1.20 | 1.40 | 1.20 | 0.98 | 4.80 | 4.80 | 8.40 | 4.80 | 5.70 |
ZD185 | 0.30 | 1.20 | 0.50 | 0.03 | 0.51 | 1.40 | 1.30 | 0.20 | 2.10 | 1.25 | 9.70 | 8.60 | 8.70 | 6.70 | 8.43 |
ZD207 | 0.00 | 0.40 | 0.00 | 0.20 | 0.15 | 1.00 | 0.60 | 1.20 | 0.93 | 0.93 | 5.70 | 3.70 | 8.30 | 7.80 | 6.38 |
17个转化体平均Average (17) | 2.93 | 3.20 | 3.24 | 3.06 | 3.11 | 5.11 | 6.00 | 6.33 | 5.90 | 5.84 | 17.41 | 18.68 | 20.22 | 19.10 | 18.85 |
NON (CK1) | / | / | / | / | / | / | / | / | / | / | / | / | / | / | / |
中棉所49 CCRI 49 (CK2) | / | / | / | / | / | / | / | / | / | / | / | / | / | / | / |
表5
2倍推荐剂量草甘膦处理后3个世代棉花转化体的成活率"
材料 Plant meterial | T2 | T3 | T4 | ||||||||||||
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
Ⅰ | Ⅱ | Ⅲ | Ⅳ | 平均 Average | Ⅰ | Ⅱ | Ⅲ | Ⅳ | 平均 Average | Ⅰ | Ⅱ | Ⅲ | Ⅳ | 平均 Average | |
ZD131 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
ZD185 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
ZD207 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
17个转化体平均Average (17) | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
NON (CK1) | / | / | / | / | / | / | / | / | / | / | / | / | / | / | / |
中棉所49 CCRI 49 (CK2) | / | / | / | / | / | / | / | / | / | / | / | / | / | / | / |
表6
2倍推荐剂量草甘膦处理后3个世代转化体的为害指数"
供试材料 Plant material | 平均值Average | 标准差SD | 变异系数CV (%) | ||||||
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
T2 | T3 | T4 | T2 | T3 | T4 | T2 | T3 | T4 | |
ZD131 | 1.01 | 0.99 | 0.98 | 0.02 | 0.03 | 0.02 | 1.98 | 3.03 | 2.04 |
ZD185 | 1.28 | 1.26 | 1.25 | 0.10 | 0.10 | 0.10 | 7.81 | 7.94 | 8.00 |
ZD207 | 1.02 | 1.12 | 0.93 | 0.12 | 0.11 | 0.09 | 11.76 | 9.82 | 9.68 |
17个转化体平均Average (17) | 5.88 | 5.82 | 5.84 | 0.26 | 0.31 | 0.32 | 4.42 | 5.33 | 5.48 |
NON (CK1) | / | / | / | / | / | / | / | / | / |
中棉所49 CCRI 49 (CK2) | / | / | / | / | / | / | / | / | / |
表7
棉花转化体农艺性状调查结果(2020—2021)"
供试材料 Plant material | 生育期 Growth period (d) | 株高 Plant height (cm) | 果枝数 Fruit branches | 单株铃数 Bolls per plant | 铃重 Boll weight (g) | 衣分 Lint percentage (%) | 枯萎病指 Fusarium wilt index | |
---|---|---|---|---|---|---|---|---|
发病率 Disease rate (%) | 病指 Disease index | |||||||
ZD131 | 120 | 119.7 | 16.2 | 26.4 | 5.8 | 42.5 | 24.3 | 7.8 |
ZD185 | 125 | 115.0 | 12.3 | 22.4 | 5.4 | 40.1 | 29.0 | 11.8 |
ZD207 | 129 | 98.6 | 12.7 | 25.6 | 5.2 | 40.5 | 29.3 | 11.2 |
17个转化体平均Average (17) | 129 | 98.6 | 12.7 | 21.1 | 5.2 | 40.5 | 29.3 | 11.2 |
NON (CK1) | 136 | 124.4 | 16.8 | 22.1 | 5.6 | 38.4 | 27.8 | 15.9 |
中棉所49 CCRI 49 (CK2) | 126 | 126.1 | 17.7 | 21.7 | 5.5 | 39.0 | 34.8 | 20.5 |
表8
棉花转化体的产量表现(2020—2021)"
供试材料 Plant material | 籽棉Seed cotton | 皮棉Lint | ||||
---|---|---|---|---|---|---|
产量 Yield (kg·hm-2) | 为CK1 as CK1 (%) | 为CK2 as CK2 (%) | 产量 Yield (kg·hm-2) | 为CK1 as CK1 (%) | 为CK2 as CK2 (%) | |
ZD131 | 6092.54 | 107.7 | 106.9 | 2589.55 | 119.2** | 116.5** |
ZD185 | 5865.67 | 103.7 | 102.9 | 2352.24 | 108.3* | 105.8 |
ZD207 | 5617.91 | 99.3 | 98.6 | 2274.63 | 104.8 | 102.4 |
17个转化体平均Average (17) | 5105.97 | 90.3 | 89.6 | 2068.66 | 95.2 | 93.0 |
NON (CK1) | 5656.72 | 100.0 | 99.3 | 2171.64 | 100.0 | 97.7 |
中棉所49 CCRI 49 (CK2) | 5698.51 | 100.7 | 100.0 | 2222.39 | 102.3 | 100.0 |
表9
棉花转化体的纤维品质测定结果(2020—2021)"
供试材料 Plant material | 上半部长度 Fiber length (mm) | 整齐度指数 Uniformity (%) | 断裂比强度 Strength (cN·tex-1) | 马克隆值 Micronaire | 伸长率 Elongation (%) |
---|---|---|---|---|---|
ZD131 | 32.7 | 85.7 | 32.1 | 4.9 | 6.8 |
ZD185 | 30.7 | 85.3 | 30.3 | 5.0 | 6.8 |
ZD207 | 31.3 | 85.4 | 34.6 | 4.5 | 6.7 |
17个转化体平均Average (17) | 28.0 | 82.9 | 28.9 | 5.3 | 6.8 |
NON (CK1) | 32.3 | 85.5 | 30.4 | 5.0 | 6.9 |
中棉所49 CCRI 49 (CK2) | 33.1 | 82.3 | 31.2 | 4.2 | 6.6 |
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