中国农业科学 ›› 2024, Vol. 57 ›› Issue (22): 4416-4430.doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2024.22.003
杜艳伟1(), 阎晓光1(
), 赵晋锋1(
), 贾苏卿2, 王高鸿1, 余爱丽1, 张鹏1
收稿日期:
2024-05-12
接受日期:
2024-07-12
出版日期:
2024-11-16
发布日期:
2024-11-22
通信作者:
联系方式:
杜艳伟,E-mail:yanweidu@163.com。
基金资助:
DU YanWei1(), YAN XiaoGuang1(
), ZHAO JinFeng1(
), JIA SuQing2, WANG GaoHong1, YU AiLi1, ZHANG Peng1
Received:
2024-05-12
Accepted:
2024-07-12
Published:
2024-11-16
Online:
2024-11-22
摘要:
【目的】Ca2+-CBL-CIPK信号系统在植物响应非生物逆境中具有重要功能。克隆谷子SiCIPK21,并研究其抗逆功能,为谷子抗逆分子育种提供关键候选基因和理论依据。【方法】利用生物信息学分析SiCIPK21启动子区域的顺式作用元件,预测其蛋白与拟南芥AtCBL的互作关系。通过PCR技术克隆SiCIPK21,构建融合表达载体在烟草中瞬时表达,确定亚细胞定位。从谷子品种豫谷1号叶片中特异性扩增SiCIPK21的部分片段,构建重组载体VIGS-pTRV2-SiCIPK21,以谷子八氢番茄红素脱氢酶(SiPDS)为指示基因,选取二叶期的谷子幼苗,通过子叶注射进行侵染,利用病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)技术研究盐(250 mmol·L-1 NaCl)胁迫下SiCIPK21在谷子苗期的作用。在拟南芥中过表达SiCIPK21获得T3代转基因株系。在不同浓度NaCl(150/175 mmol·L-1)、甘露醇(300/400 mmol·L-1)和ABA(0.25/0.5 μmol·L-1)处理下对萌发期的表型进行分析,同时,对苗期的耐盐和耐旱表型进行分析。【结果】亚细胞定位显示,SiCIPK21位于细胞核。SiCIPK21可能与拟南芥AtCBL2、AtCBL3、AtCBL4、AtCBL9和AtCBL10互作。SiCIPK21启动子区域含有逆境应答元件,暗示SiCIPK21可能参与谷子的逆境应答。VIGS基因沉默试验表明,沉默谷子SiCIPK21植株对盐胁迫的敏感性增加。通过遗传转化获得3个独立的T3代拟南芥过表达株系(2#、3#和6#)。在不同浓度NaCl(150/175 mmol·L-1)、甘露醇(300/400 mmol·L-1)和ABA(0.25/0.5 μmol·L-1)条件下的萌发率、萌发速度、绿色子叶展开率、根系长度和鲜重均显著高于野生型植株(WT);在拟南芥苗期,过表达株系的成活率和叶绿素含量显著提高,对盐胁迫和干旱的耐受性增强。【结论】SiCIPK21是植物响应盐和干旱胁迫的正调控因子,SiCIPK21可作为提高谷子抗逆分子育种的候选基因。
杜艳伟, 阎晓光, 赵晋锋, 贾苏卿, 王高鸿, 余爱丽, 张鹏. 谷子SiCIPK21的克隆及功能分析[J]. 中国农业科学, 2024, 57(22): 4416-4430.
DU YanWei, YAN XiaoGuang, ZHAO JinFeng, JIA SuQing, WANG GaoHong, YU AiLi, ZHANG Peng. Cloning and Functional Verification of SiCIPK21 Gene in Foxtail Millet[J]. Scientia Agricultura Sinica, 2024, 57(22): 4416-4430.
表1
本研究中使用的引物序列"
引物名称 Primer name | 引物序列 Primer sequence (5′-3′) |
---|---|
SiCIPK21-GFP-F | ACTAGGGTCTCGCACCATGGCCATGGAGAAGAACCAAGACA |
SiCIPK21-GFP-R | ACTAGGGTCTCTCGCCCGTGGTGGTCCGCCTCG |
VIGS-pTRV2-SiCIPK21-F | AAGGTTACCGAATTCTCTAGGTTAGTGAAAAGGGGATCCTCATTTCCTC |
VIGS-pTRV2-SiCIPK21-R | GAGACGCGTGAGCTCGGTACGAAATTCTCCAGGTGATCATGGGTGTG |
pCMBIA3301-SiCIPK21-F | ACTAGGGTCTCGCACCATGGCCATGGAGAAGAACCAAGACA |
pCMBIA3301-SiCIPK21-R | ACTAGGGTCTCTACCGCTACGTGGTGGTCCGCCTC |
RT-qPCR-SiCIPK21-F | TAATCGCCAAGCACCTCCTA |
RT-qPCR-SiCIPK21-R | CTTGGTTCTTCTCCATGGCC |
PCR-SiCIPK21-F | ATGGCCATGGAGAAGAACCAAGACA |
PCR-SiCIPK21-R | CCTGTAGTTGCTCTGCGTGA |
β-Actin-F | CAGTGGACGCACAACAGGTAT |
β-Actin-R | AGCAAGGTCAAGACGGAGAAT |
表2
SiCIPK21启动子区域顺式作用元件预测"
顺式元件Cis-element | 典型序列Typical sequence | 特性Characteristic |
---|---|---|
TGA-element | AACGAC | 生长素响应Auxin-responsive element |
P-box | CCTTTTG | 赤霉素响应Gibberellin-responsive element |
CGTCA-motif | CGTCA | 茉莉酸甲酯响应Cis-acting regulatory element involved in the MeJA-responsiveness |
TGACG-motif | TGACG | |
LTR | CCGAAA | 低温响应Cis-acting element involved in low-temperature responsiveness |
MBS | CAACTG | 干旱响应MYB binding site involved in drought-inducibility |
ARE | AAACCA | 厌氧响应Cis-acting regulatory element essential for the anaerobic induction |
ATCT-motif | AATCTAATCC | 光响应Part of a conserved DNA module involved in light responsiveness |
Box 4 | ATTAAT | |
GATA-motif | GATAGGA | 光响应Part of a light responsive element |
TCT-motif | TCTTAC | |
chs-CMA2a | TCACTTGA | |
AE-box | AGAAACAA | |
MSA-like | TCAAACGGT | 细胞周期调控Cis-acting element involved in cell cycle regulation |
TC-rich repeats | ATTCTCTAAC | 防御和应激反应响应Cis-acting element involved in defense and stress responsiveness |
图2
SiCIPK21的VIGS载体构建及沉默SiCIPK21谷子的耐盐性鉴定 A:SiCIPK21的VIGS载体构建。a:SiCIPK21的PCR扩增;b:pTRV2-SiCIPK21载体的酶切验证。M:DNA Marker。B:沉默谷子SiPDS和SiCIPK21植株的表型。a:SiPDS沉默植株(pTRV2-SiPDS)的表型(左为对照,右为SiPDS沉默植株);b:SiCIPK21沉默植株的盐胁迫(250 mmol·L-1 NaCl)表型鉴定(左为对照,右为SiCIPK21沉默植株);c:沉默SiPDS后的植株表型。C:SiCIPK21沉默效率检测。D:盐胁迫下SiCIPK21沉默植株叶片中叶绿素含量。E:盐胁迫下SiCIPK21沉默植株叶片中丙二醛含量。*、**分别表示在0.05和0.01水平显著差异。下同"
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