中国农业科学 ›› 2023, Vol. 56 ›› Issue (19): 3747-3758.doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2023.19.004
许福春1,2(), 赵静若2(
), 张振楠2, 胡改元2, 龙璐2(
)
收稿日期:
2023-05-05
接受日期:
2023-06-12
出版日期:
2023-10-01
发布日期:
2023-10-08
通信作者:
联系方式:
许福春,E-mail:henanxufuchun@163.com。赵静若,E-mail:707398769@qq.com。许福春和赵静若为同等贡献作者。
基金资助:
XU FuChun1,2(), ZHAO JingRuo2(
), ZHANG ZhenNan2, HU GaiYuan2, LONG Lu2(
)
Received:
2023-05-05
Accepted:
2023-06-12
Published:
2023-10-01
Online:
2023-10-08
摘要:
【目的】通过克隆陆地棉GhCPR5,分析其蛋白结构、表达模式和生物学功能,探究其在棉花响应黄萎病菌与灰霉病菌侵染中的功能和作用机制,为棉花抗病机制研究和育种提供理论基础和候选基因。【方法】根据棉花响应黄萎病菌侵染的转录组数据筛选到GhCPR5,并从陆地棉TM-1中克隆获得GhCPR5的全长编码序列。利用生物信息学技术分析GhCPR5的保守结构域、蛋白结构特征和同源基因的系统进化关系;利用实时荧光定量PCR(qPCR)分析GhCPR5在棉花根、茎、叶、胚珠、纤维、花瓣中的表达模式和黄萎病菌诱导的表达模式;构建病毒诱导的GhCPR5沉默载体TRV:CPR5,利用农杆菌介导的瞬时转化方法创建GhCPR5抑制表达植株,并借助RT-PCR和qPCR技术检测GhCPR5的干涉效率。对TRV:00和TRV:CPR5植株进行黄萎病菌和灰霉病菌接种,观察比较TRV:00和TRV:CPR5植株对病原菌的抗性差异;利用qPCR检测TRV:00和TRV:CPR5植株中防御相关基因的表达量,分析GhCPR5的作用机制。【结果】从陆地棉TM-1中克隆获得GhCPR5,其CDS全长1 683 bp,编码560个氨基酸,蛋白质相对分子量为62.883 kDa,等电点为9.01。多重序列比对和进化树分析显示,GhCPR5与榴莲、可可等物种CPR5同源性较高。此外,GhCPR5与不同物种CPR5的C端蛋白结构高度保守,含有4—5个跨膜结构域。GhCPR5在棉花幼苗真叶中的表达量最高,茎中表达量最低,且其表达受黄萎病菌诱导。在正常条件下,GhCPR5抑制表达植株TRV:CPR5和对照植株TRV:00在发育上无明显差异。但是,接种黄萎病菌后,TRV:CPR5植株对黄萎病菌表现敏感,发病率和病情指数显著高于TRV:00植株。黄萎病菌和灰霉病菌的离体叶片接种和台盼蓝染色结果显示,TRV:CPR5叶片上的病斑面积显著高于TRV:00叶片,说明下调GhCPR5表达降低了棉花对黄萎病菌和灰霉病菌的抗性。此外,GhCPR5抑制植株体内JAZ1表达量显著上升,而PR3、PR4和PR5的表达量显著下降。【结论】GhCPR5正调控棉花抗病性,下调GhCPR5表达可显著降低棉花对黄萎病菌和灰霉病菌的抗性。
许福春, 赵静若, 张振楠, 胡改元, 龙璐. 陆地棉GhCPR5的克隆及其在抗病中的功能分析[J]. 中国农业科学, 2023, 56(19): 3747-3758.
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表1
研究所用引物"
引物名称Primer name | 引物序列Primer sequence (5′-3′) |
---|---|
VIGS-GhCPR5-F | CGGGGTACCGATGTTGATCGGCCTTCTGT |
VIGS-GhCPR5-R | CGCGGATCCGCAACTCAGCCTGTCCTGT |
qRT-GhCPR5-F | TCTGTGGTTTGGCTGGGAAGT |
qRT-GhCPR5-R | GGCATAAGACCGCACAATAAGG |
qRT-JAZ1-F | AGCCTCAAAAAGGAAGACCTCAAAC |
qRT-JAZ1-R | TGGCTGCTCAATCACCATAGTAATC |
qRT-JAZ3-F | TGATTTTGCTCAAGGAGATAACGCT |
qRT-JAZ3-R | TGATTGCCTACTCGTTGCCTGT |
qRT-NPR1-F | CTAGCTTGCGGAGGGATTGATACC |
qRT-NPR1-R | GAGATGGCTGACCTGTCAAACTGC |
qRT-PR3-F | ACTCCACAATCACCGAAGCCAT |
qRT-PR3-R | GCATTCCAACCCTTACCACATTC |
qRT-PR4-F | CAGGAGAAGGAGCGACTGTGA |
qRT-PR4-R | TCCCACATCCAAATCTAACCC |
qRT-PR5-F | AAGGAGTCCACCACAATCACCG |
qRT-PR5-R | CTGGCACTGCTATGGCTCGTAT |
图1
棉花GhCPR5蛋白序列分析 A:GhCPR5与拟南芥CPR5氨基酸序列比对。AT5G64930:拟南芥CPR5;Gh_A02G1287/Gh_D03G0427:陆地棉基因组库中A、D基因组上的GhCPR5序列;CPR5:GhCPR5的扩增序列。B:GhCPR5与其他物种CPR5的系统进化树。Dz:榴莲,XP_022739926,Tc:可可,XP_007048101,Me:木薯,XP_021633464,Cs:茶树,XP_028102180,At:拟南芥,AT5G64930,Sb:高粱,XP_002454622,Zm:玉米,NP_001146273,Os:水稻,XP_015643035,Vv:葡萄,XP_002280314,Pt:毛果杨,XP_006380467,Hs:木槿,XP_039044948,Gm:大豆,XP_006581733。C:GhCPR5蛋白跨膜结构域(TMs)预测"
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