【目的】菲利普孢囊线虫（Heterodera filipjevi）是全球小麦生产上的一种重要病原物，早期快速准确的检测对于小麦孢囊线虫病的防控至关重要。本研究基于TaqMan探针法的实时荧光定量PCR（real-time fluorescent quantitative PCR with TaqMan probes, TaqMan-qPCR）技术建立了一种直接从田间土壤中快速检测和定量分析H. filipjevi的方法。【方法】根据 H. filipjevi的RAPD-SCAR 序列（KC529338）设计TaqMan-qPCR特异性的引物和探针，利用已鉴定的27个线虫群体的DNA进行引物特异性检测；利用单条 J2 DNA稀释液（4-0，4-1，4-2，4-3，4-4，4-5，4-6 和 4-7）和单个雌虫DNA稀释液（10-0，10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6和10-7），以及基因组 DNA 的稀释液（100 μg.μL-1，10 μg.μL-1，1 μg.μL-1，0.1 μg.μL-1，0.01 μg.μL-1，0.001 μg.μL-1，100 pg.μL-1 和 10 pg.μL-1）对引物的灵敏度进行检测。通过人工将不同数量（0.1, 1, 10, 100和1000条）的 H. filipjevi添加到灭菌土中，建立了线虫数量的对数与CT值的标准曲线和回归方程，对32份田间土壤样品中H. filipjevi数量进行了评估，并对实时荧光定量PCR检测方法与传统定量方法进行了相关性分析。【结果】本研究建立的菲利普孢囊线虫TaqMan-qPCR检测技术具有极高的特异性和灵敏度，能够从13 种27 个线虫种群中特异的检测出菲利普孢囊线虫，检测阈值低至4-3个单条J2 DNA、10-3个单条雌虫DNA和0.01μg. μL-1基因组DNA。田间土壤样品检测发现，实时荧光定量PCR定量检测方法与传统定量检测法呈现出较好的线性关系（R²= 0.8259）。【结论】本研究建立的TaqMan-qPCR检测H. filipjevi技术特异性强、灵敏度高，能广泛适用于田间土壤开展H. filipjevi快速检测和定量分析。
象耳豆根结线虫是一类在全球范围内发生且危害多种作物的重要病原线虫，其主要分布于全球的热带和亚热带地区。然而，目前关于影响其分布的主要环境因子以及未来潜在分布区域变化的研究还未有报道。在本研究中，我们根据象耳豆根结线虫在全球不同地区发生报道的相关数据，利用Maximum Entropy（MaxEnt）模型对这类根结线虫在中国及全球的潜在地域分布进行了预测。同时，我们利用3套气候模式（BCC-CSM2-MR, CanESM5和CNRM-CM6-1）对象耳豆根结线虫到本世纪50年代和90年代的潜在分布区域进行了预测，对其在不同气候条件下潜在分布区域的变化进行了分析。结果显示，象耳豆根结线虫的最佳适生区域为亚洲、南美洲、北美洲和非洲北纬30度到南纬30度之间的区域。Bio16（全年最湿润季度的降水量）、bio10（全年最热季度的平均气温）以及bio11（全年最冷季度的平均气温）是影响象耳豆根结线虫潜在分布最重要的环境因子。进一步的预测结果显示，在未来的气候条件下，全球象耳豆根结线虫的最佳适生区域将不断向高纬度地区扩展。该结果将为象耳豆根结线虫的防控提供理论基础。
腐烂茎线虫（Ditylenchus destructor）是一种重要的检疫性病原线虫，严重危害甘薯、马铃薯和中药材等根茎类作物。该线虫的种内分化明显，根据ITS-rDNA序列差异，国外的研究将其分为A-G 7个单倍型，但主要集中于马铃薯和甘薯的线虫群体。本研究对腐烂茎线虫中药材群体ITS-rDNA序列及其RNA二级结构进行分析，以明确其单倍型分化，并通过ITS-rDNA与28S D2-D3系统发育关系、ITS-RFLR和ITS特异性引物PCR扩增进一步验证不同群体单倍型的分化。在甘肃、青海、陕西、内蒙和黑龙江等5个省，共采集当归、党参、马铃薯和甘薯的腐烂茎线虫群体43个，其中中药材群体37个。线虫群体的ITS-rDNA序列长度为727 bp-969 bp，长度差异主要表现在ITS1区串联重复序列的数量不同，且串联重复序列在ITS1二级结构中形成了稳定的茎环，即H9螺旋。依据H9螺旋结构的有无及其差异，43个群体的ITS-rDNA序列可划分为10个单倍型。与已知单倍型（A-G）对比分析，发现其中3个单倍型分别与A、B和C单倍型一致，而另外7个单倍型与已知单倍型不同，将其依次命名为H、I、J、K、L、M和N单倍型，这7个新单倍型均来源于中药材。综合本研究和已知单倍型分类体系，腐烂茎线虫中发现A-N 14个单倍型。ITS和28S系统发育分析显示，所有单倍型群体分化为两支：A单倍型为一支，B-N单倍型为另一支。对比ITS和28S系统发育树，发现A单倍型均单独聚为一支，但B-N分支不太一致，且不同单倍型系统发育关系较为混乱。ITS-RFLP和特异性引物PCR结果显示，H和A单倍型酶切图谱和特异性片段长度相同， B和C单倍型特异性片段长度相同，但其它单倍型间存在明显差异。除K单倍型不同群体间有差异外，其它单倍型的群体间无明显差异。本研究发现了腐烂茎线虫中药材群体中存在新的单倍型，并明确了不同单倍型的差异，该结果将推动茎线虫生物学的研究进展，且对中药材腐烂茎线虫病的识别和防治具有指导意义。
为明确我国主要甜菜产区线虫的种类和危害程度，2015-2018年我们对我国甜菜主要产区进行了系统的调查和检测。在新疆伊犁州新源县的甜菜地调查发现，部分区域甜菜长势弱，植株黄化、矮化明显，受害植株根系有明显的须根团，根上有大量的白色雌虫。采用形态学和形态测量学的方法对孢囊线虫的雌虫、孢囊和二龄幼虫进行显微观察和测量，结果表明，在我国新疆新源县甜菜上发现的孢囊群体的2龄幼虫、孢囊及阴门锥的特征和关键形态测量值与国外已报道的甜菜孢囊线虫基本一致。采用分子生物学的方法对孢囊线虫新疆新源群体的核糖体DNA-ITS、28S-D2/D3和线粒体DNA COI基因进行克隆、测序和分析发现，新源群体的核糖体DNA-ITS, 28S-D2/D3 和线粒体DNA COI基因序列和国外已报道的甜菜孢囊线虫的一致性为99.81-100%，进化分析显示新疆新源群体与国外甜菜孢囊线虫群体聚类为一个进化分支，同时采用甜菜孢囊线虫特异性引物SHF6和rDNA2，从新疆新源群体中扩增出长度为255 bp的特异性条带，分子生物学检测结果表明：我国新疆甜菜上发现的孢囊线虫为甜菜孢囊线虫。采用柯赫氏法则，将500头二龄幼虫分别接种到甜菜（SD21816）和油菜（德油6号）根系中，15天后在甜菜和油菜根系上分别发现了137和157个孢囊和雌虫，表明新疆新源群体能够在甜菜和油菜上完成生活史，且形态学和分子生物学鉴定结果和田间样品完全一致。综上所述，经形态学鉴定和分子特征分析确认，在我国新疆新源县甜菜上发现的孢囊线虫为我国检疫性有害生物——甜菜孢囊线虫，这也是甜菜孢囊线虫在我国的首次明确报道。
禾谷孢囊线虫H. avenae是一种重要的植物病原线虫，严重影响禾谷类作物的产量。目前已在我国河南、河北、江苏、青海、西藏等16个省(市)发生危害。本研究通过人工接种试验和田间试验，利用抽穗期根系中的线虫数量指标评价了青海栽培二棱大麦 (QH2R)、青海栽培六棱大麦 (QH6R) 和西藏栽培二棱大麦 (TB2R) 对禾谷孢囊线虫的抗病性，并通过接种试验和显微观察，评价了两个高抗品种中线虫的侵染和发育情况。为更好地评价不同品种对H. avenae的抗感性，首先比较了两种常用的抗性评价方法——繁育系数法 (PPR) 和单株雌虫/孢囊数量法 (NFP) 的准确性。对田间自然条件下186个品种受害情况的调查结果表明，利用NFP法鉴定出的感病品种数量显著高于PPR法鉴定的感病品种数量，表明NFP法更利于鉴定大麦品种的抗病性。通过2015年至2017年的田间试验及2018年的人工接种试验，发现QH2R系列品种中形成的雌虫/孢囊数量最少，显著低于QH6R和TB2R系列品种。综合接种试验与田间试验的结果，从QH2R系列品种中鉴定出8个高抗品种 (Sunong7617, Sunong7635, Dongyuan87-14, Rudong14-46, Rudong87-57, Rudong87-8-45, Rudong88-14-2, Rudong88-67-1)，平均单株孢囊数量低于4.2个。对线虫发育进程的显微观察表明，高抗品种 (Sunong7635和Dongyuan87-14) 中H. avenae幼虫的侵入数量显著低于感病品种中幼虫的侵入数量，并且幼虫发育成雌虫的数量也显著减少。本研究中鉴定的高抗品种对于育种工作者培育禾谷孢囊线虫抗性品种、更加经济有效地控制禾谷孢囊线虫的危害等具有重要意义。
水稻干尖线虫可侵染水稻、大豆、棉花等多种作物，给农业生产造成严重损失。丝氨酸羧肽酶（SerineCarboxypeptidases，SCP）是植物寄生线虫致病的一个关键因子，但丝氨酸羧肽酶在水稻干尖线虫中的致病机制并不清楚。本研究以水稻干尖线虫为对象，利用原位杂交、qRT-PCR、瞬时表达、真核表达以及基因沉默等方法对水稻干尖线虫丝氨酸羧肽酶（AbSCP1）的功能进行研究。研究得出，AbSCP1基因全长1425 bp，编码氨基酸长度为474aa。AbSCP1编码蛋白具有信号肽、无跨膜结构域，与香蕉穿孔线虫SCP蛋白的序列相似性为67%。不同龄期水稻干尖线虫AbSCP1的qPCR分析得出，该基因在幼虫中的表达量最高，其次是雌虫、雄虫和卵。通过原位杂交证实，AbSCP1在水稻干尖线虫的食道腺中表达。使用昆虫细胞表达系统获得了AbSCP1蛋白，通过与特异性底物反应证实了该蛋白的羧肽酶活性，并得出了酶促反应最适的pH为4.5。使用烟草瞬时表达系统表达AbSCP1，在烟草细胞核中出现强烈的特异荧光信号，说明AbSCP1被定位在植物细胞核中。使用RNAi研究AbSCP1对水稻干尖线虫致病力、繁殖力的影响。结果得出，水稻干尖线虫取食AbSCP1特异的dsRNA 24 h后，AbSCP1的表达量显著下降。使用基因沉默后的线虫分别接种水稻和灰葡萄孢，分别统计水稻的发病等级和线虫数。结果表明，AbSCP1被沉默后，水稻干尖线虫的致病力、繁殖率均显著下降。本研究首次在水稻干尖线虫中明确了SCP是一类可被分泌到寄主细胞核中发挥作用的蛋白酶类效应子，在线虫寄生寄主过程中起到重要作用。本研究的成果将为以AbSCP1为靶标开发高效、安全的水稻干尖线虫防治措施奠定基础。
马铃薯孢囊线虫Globodera rostochiensis是国际公认的重要检疫性有害线虫，严重危害马铃薯。2018-2020年，在全国农业技术推广服务中心组织的全国马铃薯检疫性线虫调查中，从云南省昭通市鲁甸县和四川省越西县和昭觉县马铃薯根系发现金色孢囊线虫，经形态学观察鉴定、分子生物学rDNA-ITS及28S的D2-D3区域特征分析比对及种特异性引物ITS5和PITSr3检测确定为马铃薯金线虫Globodera rostochiensis（Wollenweber）Skarbilovich, 1959. 在隔离温室内采用盆栽人工接种的致病性研究结果表明，该三个金线虫种群都能侵染马铃薯（品种青薯9号）并繁殖，接种12周后，马铃薯上形成成熟雌虫，完成生活史。这是马铃薯金线虫在我国云南和四川省首次记录。
钾（K）是一种重要的营养元素，可以提高作物的抗逆性/耐受性。K在抗植物寄生线虫中的应用表明，K处理可以减少线虫病的发生，提高作物产量。然而，K在水稻抗拟禾谷根结线虫（Meloidogyne graminicola）中的研究仍然缺乏。本研究首先用K2SO4直接处理线虫，发现K2SO4对线虫的死亡率、侵染率以及发育水平无显著影响；接着通过温室盆栽接种，发现0.5 mM K2SO4处理水稻后，根中的根结和线虫数量分别下降了57.2±4.4% 和59.2±6.6%，成年雌虫比例（70.9±5.6%）显著低于对照（90.7±5.1%），同时幼虫比例（27.0±6.3%）显著高于对照（6.0±3.2%），而水稻的生长不受影响；统计Pluronic明胶中水稻根尖吸引的线虫数量，发现接种后6小时K2SO4处理与清水处理之间并无显著差异；对接种后7天根结中巨细胞的形态、大小和数量进行显微观察，发现两个处理间也不存在显著差异；接着检测根结中胼胝质沉积，发现K2SO4处理后其沉积面积增加了67.9%，同时其合成基因OsGSL1和降解基因OsGNS5分别显著上调和下调；另外检测H2O2累积发现，接种后8和24 小时K2SO4处理的根中H2O2含量分别增加了78.2% 和118.7%，同时其合成基因OsRbohB也显著上调；再对水杨酸、茉莉酸、乙烯以及油菜素内酯等信号通路相关基因和病程相关蛋白基因的表达进行定量分析，发现在线虫侵染初期K2SO4处理显著上调了某些抗病相关基因的表达；最后对K通道基因OsAKT1和转运蛋白基因OsHAK5缺陷型植株进行接种，发现根结和线虫数量显著增加并且线虫的发育加快，同时K2SO4的作用降低。这些说明K2SO4通过激发基础防御反应提高了水稻对线虫的抗性，并且K通道和转运蛋白积极参与了寄主抗性。K及其通道和转运蛋白在寄主抗性中的应用，为进一步研究水稻抗线虫机制以及钾在植物抗生物胁迫中的功能奠定了基础。低钾能诱导水稻对拟禾谷根结线虫的抗性，为田间有效利用钾肥防控线虫病害提供了理论依据。
大豆孢囊线虫（SCN, Heterodera glycines）严重制约大豆生产。大豆抗线虫数量性状遗传位点Rhg4上的丝氨酸羟甲基转移酶编码基因（GmSHMT08）对大豆孢囊线虫有显著的抗性，但该基因如何介导了对大豆孢囊线虫的抗性机制仍不明晰，GmSHMT08能否与大豆孢囊线虫产生的蛋白发生互作仍不明确。本研究以GmSHMT08作为诱饵，通过酵母双杂交体系在线虫中筛选出了与GmSHMT08互作的一个热休克蛋白70片段（HgHSP70p）。通过GST pull-down和荧光双分子互补，进一步验证了HgHSP70p与GmSHMT08之间存在互作关系。本研究发现的HgHSP70基因可以作为关键候选基因，用于进一步探究GmSHMT08介导的对大豆孢囊线虫的抗性机制。
大豆孢囊线虫是世界范围内大豆生产的重要病原之一，生物防治目前已成为大豆孢囊线虫病防治的重要手段。黑曲霉NBC001由本实验室从小麦孢囊线虫群体上分离获得，其发酵液拌种在盆栽中不仅可以有效防治大豆孢囊线虫，而且对大豆具有一定的促生作用。本研究将在田间评价NBC001对大豆孢囊线虫的防治效果及对大豆根际土壤产生的微生态效应。研究结果表明在田间应用黑曲霉NBC001发酵浓缩液拌种可以有效防治大豆孢囊线虫病，防效达31.7%。高通量测序结果显示黑曲霉NBC001对大豆根际土壤微生物多样性和群落结构无显著影响，表明NBC001发酵浓缩液拌种对土壤生态环境安全。在大豆定植10天时，黑曲霉 NBC001促进了大豆根际土壤中放线菌门Actinobacteria，酸杆菌门Acidobacteria，叶瘤菌属Phyllobacterium，雷尔氏菌属Ralstonia和H16的丰度；而降低拟杆菌门Bacteroidetes，芽单胞菌门Gemmatimonadetes，Adhaeribacter，芽单胞菌属Gemmatimonas，鞘氨醇单胞菌属Sphingomonas，Flavisolibacter的丰度。在定植90 d时，影响程度减小，仅增加气微菌属Aeromicrobium和RB41属的丰度，降低H16的丰度，说明其对大豆根际土壤微生物物种丰度的影响是短暂的。同时结果也表明黑曲霉NBC001可以增加大豆根际土壤中有益微生物放线菌门、酸杆菌门、气微菌属和叶瘤菌属的丰度。综上所述生防菌黑曲霉NBC001对大豆根际土壤微生物无显著影响，因此在田间应用黑曲霉NBC001对土壤生态环境安全。研究结果将为黑曲霉NBC001的安全应用奠定理论基础，为大豆孢囊线虫病生物防治提供高效生防菌株。
