中国农业科学 ›› 2023, Vol. 56 ›› Issue (15): 2977-2994.doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2023.15.012
刘德帅(), 冯美, 孙雨桐, 王烨, 迟敬楠, 姚文孔(
)
收稿日期:
2023-01-12
接受日期:
2023-03-31
出版日期:
2023-08-01
发布日期:
2023-08-05
通信作者:
联系方式:
刘德帅,E-mail:lds201220@163.com。
基金资助:
LIU DeShuai(), FENG Mei, SUN YuTong, WANG Ye, CHI JingNan, YAO WenKong(
)
Received:
2023-01-12
Accepted:
2023-03-31
Published:
2023-08-01
Online:
2023-08-05
摘要:
【目的】 DELLA蛋白属于植物特有的GRAS蛋白家族,是赤霉素信号转导途径中的重要调控因子,在植物生长发育和抵御逆境胁迫中发挥着重要作用。克隆欧洲葡萄VvGAI1,并对其进行亚细胞定位、蛋白互作和表达分析,为进一步研究DELLA蛋白在葡萄抗寒反应中的调控功能奠定基础。【方法】 以酿酒葡萄品种‘霞多丽'叶片为试材,采用同源克隆的方法获得VvGAI1序列。利用生物信息学方法分析该基因的序列特征,使用DNAMAN及MEGA7.0对VvGAI1蛋白序列及拟南芥序列进行多序列比对并构建系统进化树。通过亚细胞定位确定VvGAI1蛋白在细胞中的表达位置;利用酵母试验验证VvGAI1蛋白的转录激活活性;利用酵母双杂交和双分子荧光互补试验验证VvGAI1蛋白与VvJAZ9蛋白的互作关系;利用VvGAI1原核表达蛋白制备anti-VvGAI1兔源多克隆抗体;利用Western Blot技术检测VvGAI1蛋白在低温下的表达情况;通过相对电导率分析外源喷施茉莉酸和赤霉素对葡萄抗寒性的影响。【结果】 从‘霞多丽'叶片中克隆得到VvGAI1,其ORF为1 773 bp,编码590个氨基酸,位于第1条染色体,含有1个外显子,无内含子。VvGAI1蛋白相对分子质量为64.87 kDa,理论等电点pI为5.31,属于酸性不稳定亲水蛋白。VvGAI1具有高度保守的DELLA和GRAS结构域,属于植物GRAS家族的DELLA蛋白。蛋白聚类分析显示VvGAI1与拟南芥AtGAI和烟草NtGAI1亲缘关系较近。亚细胞定位与转录自激活结果显示VvGAI1是一个定位于细胞核中且具有转录激活活性的转录因子。酵母双杂交和双分子荧光互补试验也证实VvGAI1与VvJAZ9具有互作关系。将VvGAI1克隆至原核表达载体构建pET28b-VvGAI1重组表达载体,转化至大肠杆菌BL21中经16 ℃、1.0 mmol∙L-1异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达获得VvGAI1-His融合蛋白,再经抗原免疫,血清纯化后制备得到anti-VvGAI1兔源多克隆抗体。制备的anti-VvGAI1抗体可以特异性检测‘霞多丽'葡萄中的VvGAI1蛋白。Western Blot结果表明,低温处理下葡萄原生质体中VvGAI1蛋白呈先上升后下降的表达趋势,VvGAI1蛋白响应低温诱导表达。与对照相比,50 μmol·L-1茉莉酸甲酯(MeJA)处理可以提高葡萄的抗寒性,50 μmol·L-1赤霉素(GA3)处理使葡萄对寒冷变得敏感。【结论】 葡萄VvGAI1是一个与VvJAZ9相互作用的转录因子,VvGAI1对低温胁迫有响应,外源茉莉酸能够正调控冷胁迫反应,而赤霉素负调控冷胁迫反应。
刘德帅, 冯美, 孙雨桐, 王烨, 迟敬楠, 姚文孔. 葡萄VvGAI1与VvJAZ9蛋白互作及低温下的表达模式分析[J]. 中国农业科学, 2023, 56(15): 2977-2994.
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表1
引物列表"
引物名称 Primer name | 引物序列Primer sequence (5′→3′) | 用途 Purpose |
---|---|---|
VvGAI1-F | ATGAAGAGGGAGTATCATCATCCTCATC | 基因克隆 Gene cloning |
VvGAI1-R | TCAGTTGGAGGCAGGTGTGGAG | 基因克隆 Gene cloning |
pBI221-VvGAI1-F-Xba I | GAGAGAACACGGGGGACTCTAGAATGAAGAGGGAGTATCATCATCCTCATC | 亚细胞定位Subcellular localization |
pBI221-VvGAI1-R-Xho I | TTACCCATGGTACCCCGCTCGAGGTTGGAGGCAGGTGTGGAGG | 亚细胞定位Subcellular localization |
pGBKT7-VvGAI1-F-EcoRⅠ | TATGGCCATGGAGGCCGAATTCATGAAGAGGGAGTATCATCATCCTCATC | 自激活验证 Self-activation verification |
pGBKT7-VvGAI1-R-BamHⅠ | GCCGCTGCAGGTCGACGGATCCTCAGTTGGAGGCAGGTGTGGAG | 自激活验证 Self-activation verification |
pGBKT7-VvGAI1∆DELLA-F-EcoRⅠ | TATGGCCATGGAGGCCGAATTCATGGGTAAGGCTCTTTATTCCCATATCGAAC | 自激活验证 Self-activation verification |
pGBKT7-VvGAI1∆DELLA-R-BamHⅠ | GCCGCTGCAGGTCGACGGATCCTCAGTTGGAGGCAGGTGTGGAG | 自激活验证 Self-activation verification |
pGBKT7-VvGAI1∆GRAS-F-EcoRⅠ | TATGGCCATGGAGGCCGAATTCATGAAGAGGGAGTATCATCATCCTCATC | 自激活验证 Self-activation verification |
pGBKT7-VvGAI1∆GRAS-R-BamHⅠ | GCCGCTGCAGGTCGACGGATCCTCATGGAATTGCTTTGAGATCGTAATCCAAAGAC | 自激活验证 Self-activation verification |
pGADT7-VvGAI1-F-EcoRⅠ | GCCATGGAGGCCAGTGAATTCATGAAGAGGGAGTATCATCATCCTCATC | 酵母双杂 Yeast two-hybrid |
pGADT7-VvGAI1-R-BamHⅠ | CAGCTCGAGCTCGATGGATCCTCAGTTGGAGGCAGGTGTGGAG | 酵母双杂 Yeast two-hybrid |
pBI221-CE-VvJAZ9-F-Xba I | GAGAACACGGGGGACTCTAGAATGTCGAGCTCCTCGGATATTGC | BiFC验证 BiFC verification |
pBI221-CE-VvJAZ9-R-Xho I | GTACATGGTACCCCGCTCGAGCTTTGGAGATTTGGCAGCCAAGC | BiFC验证 BiFC verification |
pBI221-NE-VvGAI1-F-Xba I | GAGAACACGGGGGACTCTAGAATGAAGAGAGACCTCCTAGACAGTTGT | BiFC验证 BiFC verification |
pBI221-NE-VvGAI1-R-Xho I | GTACATGGTACCCCGCTCGAGTCAGTTGGAGGCAGGTGTGGAG | BiFC验证 BiFC verification |
pET28b-VvGAI1-F-Nde I | TGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGAAGAGGGAGTATCATCATCCTC | 原核表达Prokaryotic expression |
pET28b-VvGAI1-R-Xho I | AGTGGTTGGTGGTGGGGTGCTCGAGTCAGTTGGAGGCAGGTGTGGAG | 原核表达Prokaryotic expression |
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