中国农业科学 ›› 2016, Vol. 49 ›› Issue (9): 1818-1825.doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2016.09.018
王 芳1，冯 宇1,2，张 阁1，蒋 卉1，朱良全1，丁家波1
WANG Fang1, FENG Yu1,2, ZHANG Ge1, JIANG Hui1, ZHU Liang-quan1, DING Jia-bo1
摘要： 【目的】建立高通量牛布鲁氏菌间接ELISA诊断方法，为科学高效诊断牛布鲁氏菌病提供技术手段。【方法】以提纯的猪布鲁氏菌S2株脂多糖（LPS）作为包被抗原，采用棋盘滴定法确定了抗原包被浓度、包被液、抗原包被时间、封闭液、样品稀释液、血清稀释倍数、兔抗牛酶标抗体稀释液、兔抗牛酶标抗体稀释浓度、最佳TMB底物反应时间等参数，初步建立了牛布鲁氏菌间接ELSIA方法。并用上述条件初步建立的方法对176份牛布鲁氏菌病阳性血清和132份牛布鲁氏菌病阴性血清进行检测。检测结果经SPSS17.0软件分析，构建受试者工作特征曲线(ROC)及曲线下面积，确定敏感性和特异性；通过Youden指数确定阴阳性判定的临界点。使用质控阴、阳性血清评价试剂盒的批内和批间重复性。用本研究建立的ELISA试剂盒及商品化试剂盒同时对临床上1 200份牛血清样本进行比对检测，比较其符合率。【结果】通过棋盘法确定的试剂盒中各组分的最佳条件为：抗原包被浓度为10 μg·mL-1，最适包被液为碳酸盐缓冲液，最佳包被时间为2—8℃、16 h，最适血清稀释度为1﹕50，最佳封闭液为含有3%明胶的PBST，最佳样品稀释液为含有0.5%蔗糖的PBST，最佳兔抗牛酶标抗体稀释液为含有5%马血清的PBST，最佳兔抗牛酶标抗体工作浓度为1﹕20 000，最佳TMB底物反应时间为15 min。按上述条件建立的间接ELISA方法检测176份牛布鲁氏菌病阳性血清和132份牛布鲁氏菌阴性血清，并统计结果后使用SPSS17.0软件分析该方法受试者工作特征曲线（ROC）线下面积为0.98。最佳判定临界点为样本OD值/阳性OD值（S/P）×100%=20%。在此临界值上时，敏感性为97.7%，特异性为95.5%。对1 200份临床样本的比对检测显示，本研究建立的间接ELISA方法与进口商品化试剂盒的总符合率为96.25%。【结论】建立了特异性和敏感性良好的牛布鲁氏菌间接ELISA抗体检测方法。
