Please wait a minute...
Journal of Integrative Agriculture  2026, Vol. 25 Issue (10): 4351-4365    DOI: 10.1016/j.jia.2026.05.001
Agro-ecosystem & Environment Advanced Online Publication | Current Issue | Archive | Adv Search |
Natural variation in NIN-LIKE PROTEIN 4 is associated with divergent nitrogen use efficiency in Brassica juncea

Jian Zeng1*, Rumeng Wang1*, Shiyao Cui1, Xu Wang1, Haixing Song1, 2, Pan Gong1, 2#, Zhenhua Zhang1, 2#

1 College of Resources, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China

2 Yuelushan Laboratory, Changsha 410128, China

 Highlights 

● Identifies a high-NUE genotype H158 with superior antioxidant capacity, nitrogen assimilation, and uptake efficiency.

● Reveals a key gene BjuB04.NLP4, whose G/C variant influences transcriptional regulation and root-shoot ratio, with its haplotype distribution closely linked to soil nitrogen levels.

● Provides valuable genetic resources and a potential molecular marker for breeding rapeseed varieties with improved nitrogen use efficiency, aiding sustainable agriculture.

Download:  PDF in ScienceDirect  
Export:  BibTeX | EndNote (RIS)      
摘要  

过度施用氮肥虽能提高作物产量,却以牺牲生态系统健康为代价,因此提升氮素利用效率已成为可持续农业发展的迫切需求。本研究以高氮效基因型H158和低氮效基因型L159为材料,探究芥菜型油菜响应低硝态氮胁迫的生理与分子机制,以发掘可用于改良氮效率的遗传资源。水培实验表明,在低硝态氮条件下,H158相较于L159表现出更强的抗氧化能力、氮同化能力及氮素吸收效率。田间试验进一步验证了上述结果:在不同施氮水平下,H158均具有更高的产量和农学氮肥利用率。基因组比较分析鉴定出1,654个与氮效率相关的基因,其中包括NIN-LIKE PROTEIN 4(BjuB04.NLP4)。该基因启动子区的G/C变异影响其转录调控功能,并调控根冠比对氮素供应的响应。值得注意的是,BjuB04.NLP4-HAP2单倍型(H158)在低氮土壤中占主导地位,而BjuB04.NLP4-HAP1单倍型(L159)更常见于高氮土壤。综上,本研究发掘并解析了可用于培育高氮效油菜品种的宝贵遗传资源,同时提供了优良种质和功能性分子标记。



Abstract  

While excessive nitrogen fertilizer application enhances crop yields, it does so at the expense of ecosystem health, making the enhancement of nitrogen use efficiency (NUE) an imperative for sustainable agriculture. This study investigates the mechanisms underlying the response to low nitrate (LN) stress in two Brassica juncea genotypes: a high-NUE (H158) and a low-NUE (L159), aiming to identify genetic resources for improved NUE. Hydroponic experiments revealed that H158 displayed enhanced antioxidant capacity, nitrogen assimilation, and nitrogen uptake efficiency (NUpE) under LN conditions relative to L159. Field trials corroborated these findings, with H158 demonstrating higher yields and greater agronomic nitrogen use efficiency (ANUE) across a gradient of nitrogen application rates. Genomic analysis identified 1,654 genes associated with NUE, including NIN-LIKE PROTEIN 4 (BjuB04.NLP4), whose G/C variants influenced transcriptional regulation and root-to-shoot ratio responses to nitrogen availability. Notably, BjuB04.NLP4-HAP2 (H158) was predominant in low-nitrogen soils, while BjuB04.NLP4-HAP1 (L159) was more common in high-nitrogen soils. Collectively, our findings uncover and characterize valuable genetic resources for breeding rapeseed varieties with enhanced NUE, providing both elite germplasm and functional molecular markers.

Keywords:  Brassica juncea       nitrogen use efficiency        BjuB04.NLP4        haplotype        genotype  
Received: 09 September 2025   Accepted: 19 March 2026 Online: 01 May 2026  
Fund: This study was partially supported by the National Natural Science Foundation of China (32402666 and U21A20236), the Natural Science Foundation of Hunan Province, China (2025JJ60141), the Scientific Research Foundation of Education Bureau of Hunan Province, China (23B0203), the Major Project for Agricultural Biological Breeding, Ministry of Agriculture and Rural Affairs of China (2023ZD0404201), the Earmarked Fund for China Agriculture Research System (CARS-01-30), and the Innovation Foundation for Graduate of Hunan Province, China (CX20240657).
About author:  Jian Zeng, E-mail: 1214223485@qq.com; Rumeng Wang, E-mail: 15526461183@163.com; #Correspondence Pan Gong, E-mail: gongpan309@163.com; Zhenhua Zhang, E-mail: zhzh1468@163.com * These authors contributed equally to this study.

Cite this article: 

Jian Zeng, Rumeng Wang, Shiyao Cui, Xu Wang, Haixing Song, Pan Gong, Zhenhua Zhang. 2026. Natural variation in NIN-LIKE PROTEIN 4 is associated with divergent nitrogen use efficiency in Brassica juncea. Journal of Integrative Agriculture, 25(10): 4351-4365.

Asif I, Niu J, Dong Q, Wang X, Gui H, Zhang H, Pang N, Zhang X, Song M. 2022. Physiological characteristics of cotton subtending leaf are associated with yield in contrasting nitrogen-efficient cotton genotypes. Frontiers in Plant Science, 13, 825116.


Bashri G, Prasad S M. 2016. Exogenous IAA differentially affects growth, oxidative stress and antioxidants system in Cd stressed Trigonella foenum-graecum L. seedlings: Toxicity alleviation by up-regulation of ascorbate-glutathione cycle. Ecotoxicology and Environmental Safety, 132, 329–338.

Bhaduri A M, Fulekar M. 2012. Antioxidant enzyme responses of plants to heavy metal stress. Reviews in Environmental Science and Bio/ Technology, 11, 55–69.

Borisov A Y, Madsen L H, Tsyganov V E, Umehara Y, Voroshilova V A, Batagov A O, Sandal N, Mortensen A, Schauser L, Ellis N, Tikhonovich I A, Stougaard J. 2003. The Sym35 gene required for root nodule development in pea is an ortholog of Nin from Lotus japonicus. Plant Physiology, 131, 1009–1017.

Bouchet A S, Laperche A, Bissuel-Belaygue C, Snowdon R, Nesi N, Stahl A. 2016. Nitrogen use efficiency in rapeseed. A review. Agronomy for Sustainable Development, 36, 38.

Chardin C, Girin T, Roudier F, Meyer C, Krapp A. 2014. The plant RWP-RK transcription factors: Key regulators of nitrogen responses and of gametophyte development. Journal of Experimental Botany, 65, 5577–5587.

Chen C J, Chen H, Zhang Y, Thomas H R, Frank M H, He Y H, Xia R. 2020. TBtools: An integrative toolkit developed for interactive analyses of big biological data. Molecular Plant, 13, 1194–1202.

Chen J X, Lian W T, Li Z, Guo X, Li Y N, Zhao H Y, Yi K K, Li X X, Liao H. 2025. Natural variation in the GmVPE1 promoter contributes to phosphorus re-translocation to seeds and improves soybean yield. Plant Biotechnology Journal, 23, 1359–1372.

Chen K E, Chen H Y, Tseng C S, Tsay Y F. 2020. Improving nitrogen use effi by manipulating nitrate remobilization in plants. Nature Plants, 6, 1126–1135. 

Cingolani P, Platts A, Wang le L, Coon M, Nguyen T, Wang L, Land S J, Lu X, Ruden D M. 2012. A program for annotating and predicting the effects of single nucleotide polymorphisms, SnpEff: SNPs in the genome of Drosophila melanogaster strain w1118; iso-2; iso-3. Fly (Austin), 6, 80–92.



Gill S S, Tuteja N. 2010. Reactive oxygen species and antioxidant machinery in abiotic stress tolerance in crop plants. Plant Physiology and Biochemistry, 48, 909–930.

Guerrero J, Andrello M, Burgarella C, Manel S. 2018. Soil environment is a key driver of adaptation in Medicago truncatula: New insights from landscape genomics. The New Phytologist, 219, 378–390.

Han X, Wu K, Fu X D, Liu Q. 2020. Improving coordination of plant growth and nitrogen metabolism for sustainable agriculture. aBIOTECH, 1, 255–275.

Hua Y P, Zhou T, Ding G D, Yang Q Y, Shi L, Xu F S. 2016. Physiological, genomic and transcriptional diversity in responses to boron deficiency in rapeseed genotypes. Journal of Experimental Botany, 67, 5769–5784.

Hua Y P, Zhou T, Liao Q, Song H X, Guan C Y, Zhang Z H. 2018. Genomics-assisted identification and characterization of the genetic variants underlying differential nitrogen use efficiencies in allotetraploid rapeseed genotypes. G3 (Bethesda), 8, 2757–2771. Ihaka R, Gentleman R. 1996. R: A language for data analysis and graphics. Journal of Computational and Graphical Statistics, 5,

299–314.

Inturrisi F C, Barbetti M J, Tirnaz S, Patel D A, Edwards D, Batley J. 2021. Molecular characterization of disease resistance in Brassica juncea-The current status and the way forward. Plant Pathology, 70, 13–34.

Islam S, Zhang J J, Zhao Y, She M Y, Ma W J. 2021. Genetic regulation of the traits contributing to wheat nitrogen use efficiency. Plant Science, 303, 110759.

Kang L, Qian L W, Zheng M, Chen L Y, Chen H, Yang L, You L, Yang B, Yan M L, Gu Y G, Wang T Y, Schiessl S V, An H, Blischak P, Liu X J, Lu H F, Zhang D W, Rao Y, Jia D H, Zhou D G, et al. 2021. Genomic insights into the origin, domestication and diversification of Brassica juncea. Nature Genetics, 53, 1392–1402.

Kaur J, Akhatar J, Goyal A, Kaur N, Kaur S, Mittal M, Kumar N, Sharma H, Banga S, Banga S S. 2020. Genome wide association mapping and candidate gene analysis for pod shatter resistance in Brassica juncea and its progenitor species. Molecular Biology Reports, 47, 2963–2974.

Kessel B, Schierholt A, Becker H C. 2012. Nitrogen use efficiency in a genetically diverse set of winter oilseed rape (Brassica napus L.). Crop Science, 52, 2546–2554.

Khator K, Shekhawat G S. 2020. Nitric oxide mitigates salt-induced oxidative stress in Brassica juncea seedlings by regulating ROS metabolism and antioxidant defense system. 3 Biotech, 10, 499.

Kim C K, Seol Y J, Perumal S, Lee J, Waminal N E, Jayakodi M, Lee S C, Jin S, Choi B S, Yu Y, Ko H C, Choi J W, Ryu K Y, Sohn S H, Parkin I, Yang T J. 2018. Re-exploration of U’s triangle Brassica species based on chloroplast genomes and 45s nrDNA sequences. Scientific Reports, 8, 7353.

Li G H, Zhang Y, Xu J W, Zhu C J, Hu Q Q, Xu K. 2025. Nitrogen uptake and carbon-nitrogen synergistic translocation improve yield and nitrogen use efficiency in the dep1 rice line. Journal of Integrative Agriculture, 24, 4787–4809.

Li H Q, Zhu X B, Wang J J, Wei Y H, Nai F R, Yu H D, Wang X C. 2024.

Unraveling differential characteristics and mechanisms of nitrogen uptake in wheat cultivars with varied nitrogen use efficiency. Plant Physiology and Biochemistry, 206, 108278.

Li P F, Du R J, Li Z P, Chen Z, Li J N, Du H. 2023. An integrated nitrogen utilization gene network and transcriptome analysis reveal candidate genes in response to nitrogen deficiency in Brassica napus. Frontiers in Plant Science, 14, 1187552.

Li P R, Zhang S J, Li F, Zhang S F, Zhang H, Wang X W, Sun R F, Bonnema G, Borm T J. 2017. A phylogenetic analysis of chloroplast genomes elucidates the relationships of the six economically important Brassica species comprising the triangle of U. Frontiers in Plant Science, 8, 111.

Li Q, Ding G D, Yang N M, White P J, Ye X S, Cai H M, Lu J W, Shi L, Xu F S. 2020. Comparative genome and transcriptome analysis unravels key factors of nitrogen use efficiency in Brassica napus

L. Plant, Cell & Environment, 43, 712–731.

Li T, Peng Z, Kangxi D, Inzé D, Dubois M. 2025. ETHYLENE RESPONSE FACTOR6, a central regulator of plant growth in response to stress. Plant, Cell & Environment, 48, 882–892.

Liang G H, Hua Y P, Chen H F, Luo J S, Xiang H K, Song H X, Zhang Z H. 2023. Increased nitrogen use efficiency via amino acid remobilization from source to sink organs in Brassica napus. The Crop Journal, 11, 119–131.

Liao H S, Yang C C, Hsieh M H. 2022. Nitrogen deficiency- and sucrose- induced anthocyanin biosynthesis is modulated by HISTONE DEACETYLASE15 in Arabidopsis. Journal of Experimental Botany, 73, 3726–3742.

Liu K H, Liu M H, Lin Z W, Wang Z F, Chen B Q, Liu C, Guo A P, Konishi M, Yanagisawa S, Wagner G, Sheen J. 2022. NIN-like protein 7 transcription factor is a plant nitrate sensor. Science, 377, 1419–1425.

Liu Q, Wu K, Song W Z, Zhong N, Wu Y Z, Fu X D. 2022. Improving crop nitrogen use efficiency toward sustainable green revolution. Annual Review of Plant Biology, 73, 523–551.

Liu Y, Wang H, Jiang Z, Wang W, Xu R, Wang Q, Zhang Z, Li A, Liang Y, Ou S, Liu X, Cao S, Tong H, Wang Y, Zhou F, Liao H, Hu B, Chu C. 2021. Genomic basis of geographical adaptation to soil nitrogen in rice. Nature, 590, 600–605.

Liu Y Q, Hu B, Chu C C. 2023. Toward improving nitrogen use efficiency in rice: Utilization, coordination, and availability. Current Opinion in Plant Biology, 71, 102327.

Magno Massuia de Almeida L, Coquemont-Guyot M, Elie N, Morvan- Bertrand A, Avice J C, Mollier A, Brunel-Muguet S. 2023. Repeated heat stress events during the reproductive phase impact the dynamic development of seeds in Brassica napus L. Plant Science, 327, 111559.

McAllister C H, Beatty P H, Good A G. 2012. Engineering nitrogen use efficient crop plants: The current status. Plant Biotechnology Journal, 10, 1011–1025.

Mehra P, Pandey B K, Giri J. 2015. Genome-wide DNA polymorphisms in low Phosphate tolerant and sensitive rice genotypes. Scientific Reports, 5, 13090.

Pathak R R, Ahmad A, Lochab S, Raghuram N. 2008. Molecular physiology of plant nitrogen use efficiency and biotechnological options for its enhancement. Current Science, 94, 1394–1403.

Rakotoson T, Dusserre J, Letourmy P, Frouin J, Ratsimiala I R, Rakotoarisoa N V, Tuong-Vi C, Vom Brocke K, Ramanantsoanirina A, Ahmadi N, Raboin L M. 2021. Genome-wide association study of nitrogen use efficiency and agronomic traits in upland rice. Rice Science, 28, 379–390.

Shi Y J, Liu D, He Y Q, Tang J, Chen H F, Gong P, Luo J S, Zhang Z H. 2023. CHLORIDE CHANNEL-b mediates vacuolar nitrate efflux to improve low nitrogen adaptation in Arabidopsis. Plant Physiology, 193, 1987–2002.

Snowdon R J. 2007. Cytogenetics and genome analysis in Brassica crops. Chromosome Research, 15, 85–95.

De Summa S, Malerba G, Pinto R, Mori A, Mijatovic V, Tommasi S. 2017. GATK hard filtering: Tunable parameters to improve variant calling for next generation sequencing targeted gene panel data. BMC Bioinformatics, 18, 119.

Tegeder M, Masclaux-Daubresse C. 2018. Source and sink mechanisms of nitrogen transport and use. The New Phytologist, 217, 35–53.

Wang D J, Gao Y, Sun S M, Lu X, Li Q S, Li L W, Wang K, Liu J H. 2022. Effects of salt stress on the antioxidant activity and malondialdehyde, solution protein, proline, and chlorophyll contents of three malus species. Life (Basel), 12, 1929.

Wang G L, Ding G D, Li L, Cai H M, Ye X S, Zou J, Xu F S. 2014. Identification and characterization of improved nitrogen efficiency in interspecific hybridized new-type Brassica napus. Annals of Botany, 114, 549–559.

Wang R M, Luo J S, Zeng J, Xiong Y Y, Shu T C, He D W, Liu Z S, Zhang Z H. 2025. BjuB05. GS1.4 promotes nitrogen assimilation and participates in the domestication of shoot nitrogen use efficiency in Brassica juncea. Journal of Integrative Agriculture, 24, 1800–1812.


Wu J, Zhang Z S, Xia J Q, Alfatih A, Song Y, Huang Y J, Wan G Y, Sun L Q, Tang H, Liu Y, Wang S M, Zhu Q S, Qin P, Wang Y P, Li S G, Mao C Z, Zhang G Q, Chu C, Yu L H, Xiang C B. 2021. Rice NIN-LIKE PROTEIN 4 plays a pivotal role in nitrogen use efficiency. Plant Biotechnology Journal, 19, 448–461.

Xu Q Q, Sami A, Zhang H, Jin X Z, Zheng W Y, Zhu Z Y, Wu L L, Lei Y H, Chen Z P, Li Y, Yu Y, Zhang F G, Zhou K J, Zhu Z H. 2022. Combine influence of low temperature and drought on different varieties of rapeseed (Brassica napus L.). South African Journal of Botany, 147, 400–414.

Yang J H, Zhang C T, Zhao N, Zhang L L, Hu Z Y, Chen S, Zhang M F. 2018. Chinese root-type mustard provides phylogenomic insights into the evolution of the multi-use diversified allopolyploid Brassica juncea. Molecular Plant, 11, 512–514.

Yu J, Xuan W, Tian Y L, Fan L, Sun J, Tang W J, Chen G M, Wang B X, Liu Y, Wu W, Liu X L, Jiang X Z, Zhou C, Dai Z Y, Xu D Y, Wang C M, Wan J M. 2021. Enhanced OsNLP4-OsNiR cascade confers nitrogen use efficiency by promoting tiller number in rice. Plant Biotechnology Journal, 19, 167–176.

Zhang H, Jin Z Y, Cui F, Zhao L, Zhang X Y, Chen J C, Zhang J, Li Y Y, Li Y P, Niu Y X, Zhang W L, Gao C X, Fu X D, Tong Y P, Wang L, Ling H Q, Li J M, Xiao J. 2023. Epigenetic modifi regulate cultivar-specifi root development and metabolic adaptation to nitrogen availability in wheat. Nature Communications, 14, 8238.

Zhang R L, Jia G Q, Diao X M. 2023. geneHapR: An R package for gene haplotypic statistics and visualization. BMC Bioinformatics, 24, 199. Zhang X, Davidson E A, Mauzerall D L, Searchinger T D, Dumas P, Shen Y. 2015. Managing nitrogen for sustainable development. Nature, 528, 51–59.

Zhang X B, Ding Y G, Ma Q, Li F J, Tao R R, Li T, Zhu M, Ding J F, Li C Y, Guo W S, Zhu X K. 2023. Comparative transcriptomic and metabolomic analysis revealed molecular mechanism of two wheat near-isogenic lines response to nitrogen application. Plant Physiology and Biochemistry, 195, 47–57.

Zhang Z Z, Hu Z J, Xie S G, Riaz A, Zhang G P, Ye L Z. 2025. Natural Variation in NIN-LIKE PROTEIN 4 associated with spike-response to nitrogen in barley. Plant, Cell & Environment, 48, 5120–5132.

Zhao Y L, Li Y, Cao K, Yao J L, Bie H L, Khan I A, Fang W C, Chen C W, Wang X W, Wu J L, Guo W W, Wang L R. 2023. MADS-box protein PpDAM6 regulates chilling requirement-mediated dormancy and bud break in peach. Plant Physiology, 193, 448–465.

[1] Zhipeng Shi, Guohao Han, Tiantian Gu, Hanwen Yan, Yujie Chang, Shiyu Zhuo, Lijun Cao, Lixian Xing, Yuping Liu, Xiaofang Li, Yelun Zhang, Diaoguo An. Multi-dimensional comprehensive evaluation reveals the quality trait characteristics of wheat cultivars in the Huang-Huai wheat region of China[J]. >Journal of Integrative Agriculture, 2026, 25(6): 2299-2313.
[2] Rumeng Wang, Jinsong Luo, Jian Zeng, Yingying Xiong, Tianchu Shu, Dawei He, Zhongsong Liu, Zhenhua Zhang. BjuB05.GS1.4 promotes nitrogen assimilation and participates in the domestication of shoot nitrogen use efficiency in Brassica juncea[J]. >Journal of Integrative Agriculture, 2025, 24(5): 1800-1812.
[3] Feifan Wu, Luoyang Ding, Shane K Maloney, Dominique Blache, Mengzhi Wang. Temperament and production in ruminants: The microbiome as one of the factors that affect temperament[J]. >Journal of Integrative Agriculture, 2025, 24(11): 4111-4126.
[4] GUO Ya-fei, LI Dai-li, QIU Hai-ji, ZHANG Xiao-liang, LIU Lin, ZHAO Jing-jing, JIANG De-yuan. Genome-wide association studies reveal the genetic basis of amino acid content variation in tea plants[J]. >Journal of Integrative Agriculture, 2023, 22(11): 3364-3379.
[5] SHI Wen-jun, SHAO Hui, SHA Ye, SHI Rong, SHI Dong-feng, CHEN Ya-chao, BAN Xiang-ben, MI Guo-hua. Grain dehydration rate is related to post-silking thermal time and ear characters in different maize hybrids[J]. >Journal of Integrative Agriculture, 2022, 21(4): 964-976.
[6] TENG Jin-yan, YE Shao-pan, GAO Ning, CHEN Zi-tao, DIAO Shu-qi, LI Xiu-jin, YUAN Xiao-long, ZHANG Hao, LI Jia-qi, ZHANG Xi-quan, ZHANG Zhe. Incorporating genomic annotation into single-step genomic prediction with imputed whole-genome sequence data[J]. >Journal of Integrative Agriculture, 2022, 21(4): 1126-1136.
No Suggested Reading articles found!