中国农业科学 ›› 2023, Vol. 56 ›› Issue (12): 2288-2301.doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2023.12.005
廖富荣1(), 陈红运1, 沈建国2, 方志鹏1, 黄蓬英1, 陈青1, 林玲玲1, 洪钧1
收稿日期:
2023-03-30
接受日期:
2023-04-18
出版日期:
2023-06-16
发布日期:
2023-06-27
联系方式:
廖富荣,Tel:0592-6806943;E-mail:lfr005@163.com
基金资助:
LIAO FuRong1(), CHEN HongYun1, SHEN JianGuo2, FANG ZhiPeng1, HUANG PengYing1, CHEN Qing1, LIN LingLing1, HONG Jun1
Received:
2023-03-30
Accepted:
2023-04-18
Published:
2023-06-16
Online:
2023-06-27
摘要:
【目的】使用简并引物RT-PCR方法并结合序列测定与分析,为甲型香石竹斑驳病毒属(Alphacarmovirus)、乙型香石竹斑驳病毒属(Betacarmovirus)和丙型香石竹斑驳病毒属(Gammacarmovirus)病毒建立一种快速、灵敏、广谱的检测鉴定方法。【方法】通过基因组序列的多重比对分析,在依赖于RNA的RNA聚合酶(RdRp)基因的保守区域设计1对简并引物Carmo-F2/Carmo-R2,在引物5′端分别加入非互补的富含AT序列(AATAAATCATAA)形成引物Carmo-F2a/Carmo-R2a,测试简并引物RT-PCR方法的广谱性、特异性和灵敏度,并对PCR产物进行测序、序列分析和系统发育分析。利用该方法对来自厦门的扶桑(Hibiscus rosa-sinensis)样品进行病毒检测。【结果】利用Carmo-F2/Carmo-R2和Carmo-F2a/Carmo-R2a两对引物建立的RT-PCR方法,扩增甲型、乙型和丙型香石竹斑驳病毒属病毒的部分RdRp基因,扩增片段分别约为500和550 bp。该方法成功用于检测甲型香石竹斑驳病毒属的香彩雀花碎色病毒(angelonia flower break virus,AnFBV)、小花矮牵牛斑驳病毒(calibrachoa mottle virus,CbMV)、香石竹斑驳病毒(carnation mottle virus,CarMV)、天竺葵花碎色病毒(pelargonium flower break virus,PFBV),乙型香石竹斑驳病毒属的木槿褪绿环斑病毒(hibiscus chlorotic ringspot virus,HCRSV),丙型香石竹斑驳病毒属的甜瓜坏死斑点病毒(melon necrotic spot virus,MNSV),显示出良好的广谱性。特异性检测表明,简并引物Carmo-F2/Carmo-R2和Carmo-F2a/Carmo-R2a在玉米褪绿斑驳病毒(maize chlorotic mottle virus,MCMV;Machlomovirus)、天竺葵线纹病毒(pelargonium line pattern virus,PLPV;Pelarspovirus)、香石竹环斑病毒(carnation ringspot virus,CRSV;Dianthovirus),健康的西瓜、甜瓜、南瓜、大豆、豌豆植物未扩增到预期大小的条带。灵敏度检测表明,简并引物Carmo-F2/Carmo-R2最低可检测到10-2稀释液,简并引物Carmo-F2a/Carmo-R2a可检测到10-3稀释液,在5′端加入非互补的富含AT序列可以提高简并引物RT-PCR检测方法的灵敏度。BLAST分析表明,测定的序列均与相应病毒种类具有最高序列一致性。部分RdRp基因氨基酸序列的系统发育分析结果符合目前通读病毒亚科(Procedovirinae)病毒的分类情况,且可以把病毒鉴定到种的水平。采集13份疑似病毒症状的扶桑样品,均检出木槿褪绿环斑病毒。【结论】基于简并引物Carmo-F2/Carmo-R2和Carmo-F2a/Carmo-R2a的RT-PCR方法,可用于甲型、乙型和丙型香石竹斑驳病毒属病毒的筛查检测,结合序列分析及系统发育分析可进行病毒种类的快速鉴定,并有助于发现新的病毒种类。厦门扶桑植物受到木槿褪绿环斑病毒的侵染。
廖富荣, 陈红运, 沈建国, 方志鹏, 黄蓬英, 陈青, 林玲玲, 洪钧. 香石竹斑驳病毒属简并引物RT-PCR检测方法的建立[J]. 中国农业科学, 2023, 56(12): 2288-2301.
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表1
本研究使用的病毒分离物"
病毒Virus | 分离物Isolate | 提供者Provider |
---|---|---|
甲型香石竹斑驳病毒属Alphacarmovirus | ||
香彩雀花碎色病毒Angelonia flower break virus (AnFBV) | LPC36600 | 美国Agdia, USA |
小花矮牵牛斑驳病毒Calibrachoa mottle virus (CbMV) | LPC83000 | 美国Agdia, USA |
CbMV | 07008PC | 德国Loewe, Germany |
香石竹斑驳病毒Carnation mottle virus (CarMV) | LPC68000 | 美国Agdia, USA |
CarMV | 07057PC | 德国Loewe, Germany |
天竺葵花碎色病毒Pelargonium flower break virus (PFBV) | LPC90000 | 美国Agdia, USA |
PFBV | 07073PC | 德国Loewe, Germany |
乙型香石竹斑驳病毒属Betacarmovirus | ||
木槿褪绿环斑病毒Hibiscus chlorotic ringspot virus (HCRSV) | LPC12300 | 美国Agdia, USA |
丙型香石竹斑驳病毒属Gammacarmovirus | ||
甜瓜坏死斑点病毒Melon necrotic spot virus (MNSV) | LPC12402 | 美国Agdia, USA |
MNSV | 07097PC | 德国Loewe, Germany |
玉米褪绿斑驳病毒属Machlomovirus | ||
玉米褪绿斑驳病毒Maize chlorotic mottle virus (MCMV) | LPC17002 | 美国Agdia, USA |
天竺葵环斑病毒属Pelarspovirus | ||
天竺葵线纹病毒Pelargonium line pattern virus (PLPV) | 07094PC | 德国Loewe, Germany |
石竹属病毒属Dianthovirus | ||
香石竹环斑病毒Carnation ringspot virus (CRSV) | P20-27 | 中国CAIQ, China* |
表2
用于引物设计的病毒基因组序列"
病毒Virus | 登录号GenBank accession number |
---|---|
甲型香石竹斑驳病毒属Alphacarmovirus | |
侧金盏花属花叶病毒Adonis mosaic virus | LC171345 |
香彩雀花碎色病毒Angelonia flower break virus | NC_007733 |
小花矮牵牛斑驳病毒Calibrachoa mottle virus | NC_021926 |
香石竹斑驳病毒Carnation mottle virus | NC_001265, AF192772, AJ811998, FJ843021, HQ660513, KR002041 |
金银花环斑病毒Honeysuckle ringspot virus | NC_014967, HQ677625 |
羽扇豆脉明病毒Nootka lupine vein-clearing virus | NC_009017 |
天竺葵花碎色病毒Pelargonium flower break virus | NC_005286, DQ256073 |
巨人柱仙人掌病毒Saguaro cactus virus | NC_001780 |
乙型香石竹斑驳病毒属Betacarmovirus | |
碎米荠褪绿斑驳病毒Cardamine chlorotic fleck virus | NC_001600 |
木槿褪绿环斑病毒Hibiscus chlorotic ringspot virus | NC_003608 |
日本鸢尾坏死环斑病毒Japanese iris necrotic ring virus | NC_002187 |
芜菁皱缩病毒Turnip crinkle virus | NC_003821 |
丙型香石竹斑驳病毒属Gammacarmovirus | |
豇豆斑驳病毒Cowpea mottle virus | NC_003535 |
甜瓜坏死斑点病毒Melon necrotic spot virus | NC_001504, JX879088 |
豌豆茎坏死病毒Pea stem necrosis virus | NC_004995 |
大豆黄斑驳花叶病毒Soybean yellow mottle mosaic virus | NC_011643 |
表4
香石竹斑驳病毒属相关病毒的简并引物"
名称Name | 序列Sequence (5′-3′) * | 位置Position in AF192772 | 说明Note |
---|---|---|---|
Carmo-II | AARGTCGACCCGWNCCNMGNGTNATHCAACC | 1276-1301 | 原序列Original sequence[ |
Carmo-VI | GMMCTGCAGNACRCARTCRTCNCCRTTRTT | 1756-1776 | 原序列Original sequence[ |
Carmo-II2 | AARGTCGAYCCDGCHSCNMGDRTNATHMRDCC | 1276-1301 | 修订后序列Modified sequence |
Carmo-VI2 | GMMCTGCAVNACRCARTCRTCNCCRTTRTT | 1756-1776 | 修订后序列Modified sequence |
图2
简并引物Carmo-F2/R2(A、C)和Carmo-F2a/R2a(B、D)对不同种类香石竹斑驳病毒属病毒的常规RT-PCR(A、B)和一步RT-PCR(C、D)检测 M:100 bp DNA Ladder;1:AnFBV (Agdia LPC36600);2:CarMV (Agdia LPC68000);3:CbMV (Agdia LPC83000);4:HCRSV (Agdia LPC12300);5:PFBV (Agdia LPC90000);6:CarMV (Loewe 07057PC);7:CbMV (Loewe 07008PC);8:PFBV (Loewe 07073PC);9:PLPV (Loewe 07094PC);10:MNSV (Agdia LPC12402);11:MNSV (Loewe 07097PC);12:空白对照Blank control"
表5
简并引物RT-PCR扩增序列的BLASTn结果"
病毒种类,分离物Virus species, isolate | 长度Length (bp) | 序列一致性Nucleotide sequence identity |
---|---|---|
甲型香石竹斑驳病毒属Alphacarmovirus | ||
AnFBV, LPC36600 (Agdia) | 461 | 94.36% to NC_007733.2, AnFBV |
CbMV, LPC83000 (Agdia) | 458 | 99.13% to OK181769.1, CbMV |
CbMV, 07008PC (Loewe) | 458 | 99.78% to OK181769.1, CbMV |
CarMV, LPC68000 (Agdia) | / | / |
CarMV, 07057PC (Loewe) | 458 | 99.56% to MT682299.1, CarMV |
PFBV, LPC90000 (Agdia) | 461 | 97.61% to OP357950.1, PFBV |
PFBV, 07073PC (Loewe) | 461 | 97.83% to DQ256073.1, PFBV |
乙型香石竹斑驳病毒属Betacarmovirus | ||
HCRSV, LPC12300 (Agdia) | 458 | 99.55% to MT512573.1, HCRSV |
丙型香石竹斑驳病毒属Gammacarmovirus | ||
MNSV, 07097PC (Loewe) | 464 | 98.71% to OK558728.1, MNSV |
表6
厦门扶桑病毒的BLASTn结果"
分离物 Isolate | 与HCRSV的序列一致性 Nucleotide sequence identity with HCRSV |
---|---|
XL3 | 90.39% (MN080500)-98.47% (MK279671) |
XM1 | 88.86% (MN080500)-96.72% (KC876666) |
XM2 | 91.48% (DQ392986)-97.60% (OP779319) |
XM3 | 89.96% (MN080500)-96.29% (MK279671) |
XM4 | 89.96% (MN080500)-96.51% (MK279671) |
XM5 | 89.52% (MN080500)-96.29% (MK279671) |
XM6 | 88.86% (MN080500)-96.28% (KC876666) |
XM7 | 90.17% (MN080500)-99.34% (KY933060) |
XM8 | 89.96% (MN080500)-98.69% (KY933060) |
XM9 | 90.13% (MN080500)-96.05% (MK279671) |
XM11 | 90.13% (MN080500)-96.05% (OK636421) |
XM12 | 90.39% (MN080500)-97.60% (MK279671) |
XM13 | 90.39% (MN080500)-97.82% (MK279671) |
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