





中国农业科学 ›› 2024, Vol. 57 ›› Issue (8): 1490-1505.doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2024.08.006
姜兴林1(
), 于连伟1(
), 付涵1, 艾妞1, 崔荧钧5, 李好海6, 夏子豪7, 袁虹霞1, 李洪连1,3,4, 杨雪1,2(
), 施艳1(
)
收稿日期:2023-12-06
接受日期:2024-02-04
出版日期:2024-04-16
发布日期:2024-04-24
通信作者:
联系方式:
姜兴林,E-mail:1442295312@qq.com。于连伟,E-mail:ylwnet972@163.com。姜兴林和于连伟为同等贡献作者。
基金资助:
JIANG XingLin1(
), YU LianWei1(
), FU Han1, AI Niu1, CUI YingJun5, LI HaoHai6, XIA ZiHao7, YUAN HongXia1, LI HongLian1,3,4, YANG Xue1,2(
), SHI Yan1(
)
Received:2023-12-06
Accepted:2024-02-04
Published:2024-04-16
Online:2024-04-24
摘要:
【背景】黄瓜绿斑驳花叶病毒(cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)是我国重要的检疫性植物病毒,严重降低了世界范围内蔬菜以及瓜类的产量。MYB蛋白家族庞大,功能多样,存在于所有真核生物中。大多数MYB作为转录因子控制植物的发育和代谢,并对植物应对生物和非生物胁迫反应起重要的调控作用。前期研究显示CGMMV侵染后可以显著上调寄主转录因子基因NbMYB1R1的表达。【目的】明确NbMYB1R1参与CGMMV侵染的机制,为CGMMV病害防控提供理论依据。【方法】运用MEGA 7.0构建系统进化树,对NbMYB1R1的氨基酸序列进行系统进化分析;通过构建NbMYB1R1的荧光表达载体,转化GV3101农杆菌后浸润本氏烟叶片,激光共聚焦显微镜观察其亚细胞定位;利用qRT-PCR技术分析NbMYB1R1在CGMMV侵染不同时期的转录水平及NbMYB1R1沉默烟草植株中活性氧(reactive oxygen species,ROS)相关基因的转录变化;通过沉默NbMYB1R1及下游调控基因NbAOX1a和NbAOX1b,分析NbMYB1R1及下游调控基因NbAOX1a和NbAOX1b在CGMMV侵染过程中的作用;瞬时过表达NbMYB1R1和NbMYB1R1关键氨基酸突变体,分析NbMYB1R1对CGMMV侵染的影响;使用台盼蓝染色以及DAB染色观察瞬时过表达NbMYB1R1造成的细胞死亡是否与程序性细胞死亡(programmed cell death,PCD)以及ROS的积累有关;运用酵母双杂交技术验证NbMYB1R1是否与CGMMV相关蛋白互作。【结果】系统进化树分析表明,NbMYB1R1属于1R MYB大类并与多种烟草的MYB转录因子同源性极高;亚细胞定位结果显示NbMYB1R1定位于细胞核;在CGMMV侵染的烟草植株中,NbMYB1R1的转录水平对比健康植株有明显变化,在CGMMV侵染8、12 d时NbMYB1R1的转录水平显著上调;在沉默内源基因NbMYB1R1的植株上接种CGMMV,3 d后NbMYB1R1沉默植株系统叶出现斑驳、卷曲症状,而对照植株在3.5 d时才出现症状;同时CGMMV CP mRNA水平和蛋白水平检测结果也表明沉默NbMYB1R1可以有效促进CGMMV的积累;在本氏烟叶片瞬时过表达NbMYB1R1及其突变体3 d时检测CGMMV蛋白水平表达量,结果显示过表达NbMYB1R1可以有效抑制CGMMV的侵染,DNA结合结构域缺失后会减轻NbMYB1R1对CGMMV的抑制;台盼蓝和DAB染色结果表明,在瞬时过表达NbMYB1R1蛋白后导致ROS积累并引起细胞死亡;在沉默内源基因NbMYB1R1的植株叶片上检测ROS相关基因的转录水平,发现交替氧化酶基因AOX1a、AOX1b转录水平显著上调;在沉默内源基因NbAOX1a和NbAOX1b的植株上接种CGMMV,4 d后NbAOX1a和NbAOX1b沉默植株系统叶出现斑驳、卷曲症状,而对照植株在3.5 d时就出现症状;同时CGMMV CP mRNA水平和蛋白水平检测结果也表明沉默NbAOX1a和NbAOX1b可以有效抑制CGMMV的积累;酵母双杂交结果显示NbMYB1R1不与CGMMV编码蛋白直接相互作用。【结论】随着CGMMV侵染,防御相关基因NbMYB1R1表达上调,从而抑制下游基因AOX1a、AOX1b的表达并激活细胞内产生ROS抑制病毒侵染,但NbMYB1R1不是通过与CGMMV病毒蛋白直接互作而产生此作用。由此可见,NbMYB1R1在CGMMV侵染过程中发挥了重要作用。
姜兴林, 于连伟, 付涵, 艾妞, 崔荧钧, 李好海, 夏子豪, 袁虹霞, 李洪连, 杨雪, 施艳. 转录因子NbMYB1R1通过促进活性氧积累抑制病毒侵染[J]. 中国农业科学, 2024, 57(8): 1490-1505.
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表1
本研究所用引物"
| 用途Use | 引物名称Primer name | 引物序列Primer sequence (5′-3′) |
|---|---|---|
| 酵母双杂交系统 Yeast two-hybrid | pGADT7- NbMYB1R1-F | ATATGGCCATGGAGGCCAGTGAATTCATGTCTAACGAATGCGGAAACAAAGA |
| pGADT7- NbMYB1R1-R | ATCTGCAGCTCGAGCTCGATGGATCCAGCCACACTAATTATGCTATCCCC | |
| pGBKT7-CP-F | TGCATATGGCCATGGAGGCCGAATTCATGGCTTACAATCCGATCACACCTA | |
| pGBKT7-CP-R | TGCGGCCGCTGCAGGTCGACGGATCCAGCTTTCGAGGTGGTAGCC | |
| pGBKT7-MP-F | TGCATATGGCCATGGAGGCCGAATTCATGTCTCTAAGTAAGGTGTCAGTCG | |
| pGBKT7-MP-R | TGCGGCCGCTGCAGGTCGACGGATCCGGTGTGATCGGATTGTAAGCC | |
| pGBKT7-129K-F | TGCATATGGCCATGGAGGCCGAATTCATGGCAAACATTAATGAACAAATCA | |
| pGBKT7-129K-R | TGCGGCCGCTGCAGGTCGACGGATCCTTTGGTAGGCACAGTGGTAGC | |
| pGBKT7-MET-F | TGCATATGGCCATGGAGGCCGAATTCATGGCAAACATTAATGAACAAATCA | |
| pGBKT7-MET-R | TGCGGCCGCTGCAGGTCGACGGATCCCTCGATCTGTACCTTCCTAACCTTCA | |
| pGBKT7-HEL-F | TGCATATGGCCATGGAGGCCGAATTCACATTAGTTGACGGAGTGCC | |
| pGBKT7-HEL-R | TGCGGCCGCTGCAGGTCGACGGATCCTTTGGTAGGCACAGTGGTAGC | |
| pGBKT7-P2-F | TGCATATGGCCATGGAGGCCGAATTCCAATTAATGCAGAACTCGCTGTATG | |
| pGBKT7-P2-R | TGCGGCCGCTGCAGGTCGACGGATCCCTTAGAGACATCTATGTAAAGACTAC | |
| 瞬时过表达 Over-expression | NbMYB1R1-GFP-F | ACGAGCTGTACAAGGGTACCATGTCTAACGAATGCGGAAACAAAGA |
| NbMYB1R1-GFP-R | CGGACTCTAGTTCATCTAGAAGCCACACTAATTATGCTATCCCC | |
| NbMYB1R1121-127-GFP-F | CCTACTCAGGTGGCCCTCCGCCGAAATAACATCAA | |
| NbMYB1R1121-127-GFP-R | GTTATTTCGGCGGAGGGCCACCTGAGTAGGGGTC | |
| 基因沉默 Virus induced gene silencing (VIGS) | NbMYB1R1 VIGS-F | AGTGGTCTCTGTCCAGTCCTCAAGACAAGGACCCCTACTC |
| NbMYB1R1 VIGS-R | GGTCTCAGCAGACCACAAGTGGTATTGGCCTAATGGGCT | |
| NbAOX1a/b VIGS-F | AGTGGTCTCTGTCCAGTCCT GTAGGAGGAATGTTGTTGCACT | |
| NbAOX1a/b VIGS-R | GGTCTCAGCAGACCACAAGT ATTACCCTTGTCTAATTCCTTGAGG | |
| 实时荧光定量PCR Quantitative real-time PCR | NbUBC-qPCR-F | TTTCGGTCCTGATGATACTCCC |
| NbUBC-qPCR-R | CACAGAGCAAAGACTGGATTGA | |
| NbMYB1R1-qPCR-F | GGGTTCATGCTCTTTGGTGT | |
| NbMYB1R1-qPCR-R | ACGGGTCCTAGCAGAAGGAT | |
| NbAOX1a-qPCR-F | TTGAGAACGTTCCTGCTCCT | |
| NbAOX1a-qPCR-R | TGGAGAGTCCCTTGAGCTGT | |
| NbAOX1b-qPCR-F | TTGAGAACGTTCCTGCTCCT | |
| NbAOX1b-qPCR-R | GGTGCTGGAGAGTCCTTGAG | |
| NbGST-qPCR-F | TGAAGGAAAGCGAAGCACAAT | |
| NbGST-qPCR-R | ACGACGGCGCGAATCAAACA | |
| NbSOD-qPCR-F | GCCGTCCTTAGCAGCAGTGAA | |
| NbSOD-qPCR-R | CCGGGTTTTAGGCCAGAGACAT | |
| NbAPX1-qPCR-F | GGAGTGGTTGCTGTTGAAGTC | |
| NbAPX1-qPCR-R | GGAGAGCCTTGTCTGATGG | |
| NbCAT3-qPCR-F | TGCGCATCACAATAATCACCAT | |
| NbCAT3-qPCR-R | TGTCGCGCTTTCCTGTCAA | |
| NbGPX2-qPCR-F | TTGTTTTGCCACTACCTTGTTCAG | |
| NbGPX2-qPCR-R | TTCATTTGGGGGTGTCAGATTAG | |
| CP-qPCR-F | ACAAGGTACCGCTTTCCAGA | |
| CP-qPCR-R | TACGACAGACGAGGGTAACG |
图4
NbMYBIR1沉默对CGMMV侵染的影响 A:TRV:NbMYB1R1和TRV:00在CGMMV侵染前后的生物学表型Biological phenotypes of TRV:NbMYBIR1 and TRV:00 before and after CGMMV infection;B:VIGS NbMYBIR1的沉默效率Silencing efficiency of VIGS NbMYBIR1;C:TRV:NbMYBIR1和TRV:00的植株被CGMMV侵染后系统侵染植株占比Proportion of systemic infected plants after infection with CGMMV in plants of TRV:NbMYBIR1 and TRV:00;D:TRV:NbMYBIR1对CGMMV CP转录水平的影响Effect of TRV:NbMYBIR1 on the transcription level of CGMMV CP;E:TRV:NbMYBIR1对CGMMV CP蛋白水平的影响 Effect of TRV:NbMYBIR1 on the protein level of CGMMV CP"
图8
NbAOX1a/b沉默对CGMMV侵染的影响 A:TRV:NbAOX1a/b和TRV:00在CGMMV侵染前后的生物学表型Biological phenotypes of TRV:NbAOX1a/b and TRV:00 before and after CGMMV infection;B:VIGS NbAOX1a和NbAOX1b的沉默效率Silencing efficiency of VIGS NbAOX1a and NbAOX1b;C:TRV:NbAOX1a/b和TRV:00的植株被CGMMV侵染后系统侵染植株占比Proportion of systemic infected plants after infection with CGMMV in plants of TRV:NbAOX1a/b and TRV:00;D:TRV:NbAOX1a/b对CGMMV CP的转录水平影响Effect of TRV: NbAOX1a/b on the transcription level of CGMMV CP;E:TRV:NbAOX1a/b对CGMMV CP蛋白水平的影响Effect of TRV:NbAOX1a/b on the protein level of CGMMV CP"
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