中国农业科学 ›› 2023, Vol. 56 ›› Issue (16): 3213-3225.doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2023.16.013
王东(), 陈万昭, 李宏博, 秦蕾, 徐琦琦, 刘泽鹏, 夏利宁(
)
收稿日期:
2022-05-18
接受日期:
2023-02-14
出版日期:
2023-08-16
发布日期:
2023-08-18
通信作者:
联系方式:
王东,E-mail:1005621397@qq.com。
基金资助:
WANG Dong(), CHEN WanZhao, LI HongBo, QIN Lei, XU QiQi, LIU ZePeng, XIA LiNing(
)
Received:
2022-05-18
Accepted:
2023-02-14
Published:
2023-08-16
Online:
2023-08-18
摘要:
【目的】了解新疆阿克苏地区猪源粪肠球菌中optrA和lsa(E)的流行及传播特点,并探明optrA和lsa(E)阳性粪肠球菌的耐药情况,为评估两个耐药基因对公共卫生的影响和危害提供科学依据。【方法】对新疆农业大学兽医药理学实验室分离保存的322株粪肠球菌采用PCR的方法进行optrA和lsa(E)筛查,根据CLSI推荐药物及方法采用琼脂稀释法测定optrA和lsa(E)阳性菌株对氨苄西林、红霉素、泰乐菌素、四环素、多西环素、利奈唑胺、氟苯尼考、万古霉素、左氧氟沙星、恩诺沙星、庆大霉素和沃尼妙林的最小抑菌浓度(MIC)并进行耐药判定,利用PCR方法筛查相应的耐药基因,包括ermA、ermB、ermC、fexA、fexB、tet(K)、tet(L)、tet(M)、aac(6')-le-aph(2")-Ia和cfr。选取31株不同来源的optrA和lsa(E)阳性粪肠球菌进行MLST分子分型和接合转移试验。【结果】共193株粪肠球菌检出optrA和/或lsa(E),其中38株optrA和lsa(E)共存,9株仅携带optrA,146株仅携带lsa(E)。这193株粪肠球菌对红霉素、泰乐菌素、四环素、多西环素、庆大霉素和沃尼妙林的耐药率均达到100%,虽然optrA检出率远低于lsa(E),但optrA阳性菌株总体耐药程度明显高于仅携带lsa(E)的菌株以及optrA、lsa(E)双阴性的菌株,其耐药基因的检出结果也呈现相同趋势。optrA和lsa(E)共存和仅携带optrA菌株的多重耐药谱集中在8耐和10耐,占比分别为84.6%和100.0%,而仅携带lsa(E)的菌株和optrA、lsa(E)双阴性菌株的多重耐药谱主要集中在6—8耐,占比为89.4%和90.7%。进一步分析optrA、lsa(E)与耐药性之间的关系发现,耐药较为严重的猪场optrA和lsa(E)的检出率也相对较高。耐药基因检出结果显示:193株菌均不同程度地携带ermB、ermC、tet(K)、tet(L)、tet(M)、aac(6')-Ie-aph(2")-Ia、fex(A),并且optrA、lsa(E)共存的菌株及仅携带optrA菌株的耐药基因检出率总体上也高于仅携带lsa(E)的菌株和optrA、lsa(E)双阴性菌株。MLST和接合转移试验结果提示,optrA/lsa(E)菌株遗传环境复杂、可能既存在克隆传播又存在水平转移的现象。【结论】新疆阿克苏地区猪源粪肠球菌中optrA和lsa(E)的高携带率以及高耐药水平表明该地区耐药形势严峻,对当地生猪养殖业甚至于公共卫生安全都造成威胁,应及时采取措施以防控耐药性的进一步发展。
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表2
相关耐药基因引物序列、片段大小及退火温度"
引物名称 Primer | 引物序列 Sequences (5'-3') | 片段大小 Products (bp) | 退火温度 Annealing temperature (℃) | |||
---|---|---|---|---|---|---|
ermA-F | TCTAAAAAGCATGTAAAAGAA | 645 | 53.0 | |||
ermA-R | CTTCGATAGTTTATTAATATTAGT | |||||
ermB-F | GAAAAAGTACTCAACCAAATA | 639 | 50.0 | |||
ermB-R | AGTAACGGTACTTAAATTGTTTAC | |||||
ermC-F | TCGAAACGTAATATAGATAAA | 642 | 47.5 | |||
ermC-R | GCTAATATTGTTTAAATCGTCAAT | |||||
tet(L)-F | GTTGCGCGCTATATTCCAAA | 788 | 51.7 | |||
tet(L)-R | TTAAGCAAACTCATTCCAGC | |||||
tet(K)-F | TTAGGTGAAGGGTTAGGTCC | 718 | 49.9 | |||
tet(K)-R | GCAAACTCATTCCAGAAGCA | |||||
tet(M)-F | ACAGAAAGCTTATTATATAAC | 171 | 48.5 | |||
tet(M)-R | TGGCGTGTCTATGATGTTCAC | |||||
fexA-F | GTACTTGTAGGTGCAATTACGGCTGA | 1272 | 57.0 | |||
fexA-R | CGCATCTGAGTAGGACATAGCGTC | |||||
fexB-F | TTCCCACTATTGGTGAAAGGAT | 750 | 51.9 | |||
fexB-R | GCAATTCCCTTTTATGGACGTT | |||||
cfr-F | TGAAGTATAAAGCAGGTTGGGAGT | 746 | 53.2 | |||
cfr-R | ACCATATAATTGACCACAAGCAGC | |||||
aac(6')-aph(2")-F | CCAAGAGCAATAAGGGATACC | 672 | 58.0 | |||
aac(6')-aph(2")-R | ACCCTCAAAAACTGTTGTTGC |
表3
粪肠球菌中携带optrA、lsa(E)的阳性菌株检出结果"
基因携带情况 Gene carriage status | 检出率(检出数/菌株总数)Detectable rate (Number of detections/ total number of strains) | ||||
---|---|---|---|---|---|
A猪场 A farm | B猪场 B farm | C猪场 C farm | D猪场 D farm | 合计 Total | |
共存菌株 Coexistence of two genes | 4.5%(2/44) | 27.2%(22/81) | 0(0/35) | 8.6%(14/162) | 11.8%(38/322) |
仅检出optrA的菌株 Strains with only the optrA detected | 4.5%(2/44) | 8.6%(7/81) | 0(0/35) | 0(0/162) | 2.8%(9/322) |
仅检出lsa(E)的菌株 Strains with only the lsa(E) detected | 11.4%(5/44) | 33.3%(27/81) | 22.8%(8/35) | 63.0%(102/162) | 45.3%(146/322) |
表4
不同养殖场粪肠球菌药敏试验"
抗菌药物 Antibacterial drug | 猪场(耐药数/菌株数)Swine farm (Number of drug resistance/ Number of strains) | ||||
---|---|---|---|---|---|
A猪场 A farm | B猪场 B farm | C猪场C farm | D猪场 D farm | 合计 Total | |
AMP | 0.0% a(0/44) | 0.0% a(0/81) | 0.0% a(0/146) | 0.0% a(0/162) | 0.0%(0/322) |
ERY | 97.7% a(43//44) | 100.0% a(81/81) | 94.3% a(33/35) | 100.0% a(162/162) | 99.1%(319/322) |
TYL | 97.7% a(43/44) | 100.0% a(81/81) | 91.4% a(32/35) | 100.0% a(162/162) | 98.8%(318/322) |
LZD | 11.4% a(5/44) | 35.8% b(29/81) | 0.0% c(0/35) | 7.4% ac(12/162) | 14.3%(46/322) |
TET | 100.0% a(44/44) | 100.0% a(81/81) | 97.1% a(34/35) | 100.0% a(162/162) | 99.7%(321/322) |
DOX | 100.0% a(44/44) | 100.0% a(81/81) | 100.0% a(35/35) | 100.0% a(162/162) | 100.0%(322/322) |
VAN | 0.0% a(0/44) | 0.0% a(0/81) | 0.0% a(0/35) | 0.0% a(0/162) | 0.0%(0/322) |
FFC | 29.5% a(13/44) | 54.3% b(44/81) | 0.0% c(0/35) | 17.9% a(29/162) | 26.7%(86/322) |
LEV | 11.4% ab(5/44) | 96.3% c(78/81) | 8.6% b(3/35) | 23.5% a(38/162) | 38.5%(124/322) |
ENR | 27.3% a(12/44) | 96.3% b(78/81) | 5.7% c(2/35) | 27.8% a(45/162) | 42.5%(137/322) |
GEN | 100.0% a(44/44) | 100.0% a(81/81) | 100.0% a(35/35) | 96.3% a(156/162) | 98.1%(316/322) |
VAL | 100.0% a(44/44) | 100.0% a(81/81) | 100.0% a(35/35) | 96.3% a(156/162) | 98.1%(316/322) |
表5
携带目标基因粪肠球菌药敏试验"
抗菌药物 Antibacterial drug | 耐药率(耐药菌株数/菌株总数)Drug resistance rate (number of drug-resistant strains/total number of strains) | |||
---|---|---|---|---|
共存菌株 Strain with coexistence of two genes | 仅检出optrA的菌株 Strains with only the optrA detected | 仅检出lsa(E)的菌株 Only lsa(E) positive strains | optrA、lsa(E)阴性菌株 optrA, lsa(E) negative strains | |
AMP | 0 a(0/38) | 0 a(0/9) | 0 a(0/146) | 0.0% a(0/129) |
ERY | 100.0% a(38/38) | 100.0% a(9/9) | 100.0% a(146/146) | 97.7% a(126/129) |
TYL | 100.0% a(38/38) | 100.0% a(9/9) | 100.0% a(146/146) | 96.9% a(125/129) |
LZD | 100.0% a(38/38) | 100.0% a(9/9) | 0% b(0/146) | 0.0% b(0/129) |
VAL | 100.0% a(38/38) | 100.0% a(9/9) | 100.0% a(146/146) | 99.2% a(128/129) |
TET | 100.0% a(38/38) | 100.0% a(9/9) | 100.0% a(146/146) | 99.2% a(128/129) |
DOX | 100.0% a(38/38) | 100.0% a(9/9) | 100.0% a(146/146) | 100.0% a(129/129) |
VAN | 0 a(0/38) | 0 a(0/9) | 0 a(0/146) | 0 a(0/129) |
FFC | 100.0% a(38/38) | 100.0% a(9/9) | 13.7% b(20/146) | 17.8% b(23/129) |
LEV | 52.6% a(20/38) | 77.0% a(7/9) | 40.4% a(59/146) | 29.5% b(38/129) |
ENR | 55.3% a(21/38) | 77.0% a(7/9) | 45.9% a(67/146) | 29.5% b(38/129) |
GEN | 100.0% a(38/38) | 100.0% a(9/9) | 95.9% a(140/146) | 100.0% a(129/129) |
表6
携带optrA和/或lsa(E)粪肠球菌中其他耐药基因的检出情况"
耐药基因 Drug-resistant gene | 耐药基因检出率(耐药菌株数/菌株总数) Detection rate of drug-resistant genes (number of drug-resistant strains/total number of strains) | |||
---|---|---|---|---|
共存菌株 Strain with coexistence of two genes | 仅检出optrA的菌株 Strains with only the optrA detected | 仅检出lsa(E)的菌株 Only lsa(E) positive strains | optrA、lsa(E)阴性菌株 optrA, lsa(E) negative strains | |
ermA | 89.5% a(34/38) | 100.0% a(9/9) | 1.4% b(2/146) | 3.1%b(4/129) |
ermB | 100.0% a(38/38) | 100.0% a(9/9) | 100.0% a(146/146) | 94.6%a(122/129) |
ermC | 28.9% ab(11/38) | 55.5% b(5/9) | 20.5% a(30/146) | 45.7%a(59/129) |
fexA | 97.4% a(37/38) | 88.8% a(8/9) | 6.8% b(10/146) | 6.2%b(8/129) |
fexB | 0 a(0/38) | 0 a(0/9) | 0.7% a(1/146) | 1.6%a(2/129) |
tet(K) | 84.2% a(32/38) | 100.0% a(9/9) | 39.7% b(58/146) | 71.3%a(92/129) |
tet(L) | 100.0% a(38/38) | 100.0% a(9/9) | 89.7% a(131/146) | 90.7%a(117/129) |
tet(M) | 100.0% a(38/38) | 100.0% a(9/9) | 100.0% a(146/146) | 100.0%a(129/129) |
aac(6')-le -aph(2")-Ia | 100.0% a(38/38) | 44.4% b(4/9) | 93.2% a(136/146) | 39.5%b(51/129) |
cfr | 0 a(0/38) | 0 a(0/9) | 0 a(0/146) | 0.0%a(0/129) |
表7
粪肠球菌挑选及MLST分型"
菌株 Strain | 携带基因 Carried gene | 猪场 Swine farm | ST分型 ST type |
---|---|---|---|
A1 | optrA、lsa(E) | A | ST16 |
A13 | lsa(E) | A | ST480 |
A22 | optrA | A | ST16 |
A43 | optrA | A | ST633 |
B45 | lsa(E) | B | ST1061 |
B51 | lsa(E) | B | ST1061 |
B53 | lsa(E) | B | ST1058 |
B77 | optrA、lsa(E) | B | ST1058 |
B78 | optrA、lsa(E) | B | ST1058 |
B80 | optrA | B | ST1058 |
B89 | optrA、lsa(E) | B | ST1061 |
B101 | optrA、lsa(E) | B | ST1058 |
B119 | optrA、lsa(E) | B | ST1058 |
B120 | optrA | B | ST1058 |
B121 | optrA、lsa(E) | B | ST1061 |
B122 | optrA | B | ST1058 |
B125 | lsa(E) | B | ST1061 |
C140 | lsa(E) | C | ST1007 |
C144 | lsa(E) | C | ST532 |
C145 | lsa(E) | C | ST532 |
C148 | lsa(E) | C | ST81 |
C152 | lsa(E) | C | ST532 |
C159 | lsa(E) | C | ST1061 |
C160 | lsa(E) | C | ST1061 |
D5 | optrA、lsa(E) | D | ST632 |
D9 | lsa(E) | D | ST32 |
D32 | optrA、lsa(E) | D | ST369 |
D105 | optrA、lsa(E) | D | ST369 |
D108 | lsa(E) | D | ST632 |
D158 | lsa(E) | D | ST369 |
D159 | optrA、lsa(E) | D | ST369 |
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