• • 上一篇
柯娜,郝志云,王建清,甄慧敏,罗玉柱,胡江,刘秀,李少斌,赵志东,黄兆春,梁维炜,王继卿*
KE Na, HAO ZhiYun, WANG JianQing, ZHEN HuiMin, LUO YuZhu, HU Jiang, LIU Xiu, LI ShaoBin, ZHAO ZhiDong, HUANG ZhaoChun, LIANG WeiWei, WANG JiQing*
摘要: 【背景】MicroRNAs(miRNA)是一类小RNA分子(18—23nt),广泛参与了家畜乳腺发育和泌乳性能的调控。项目组前期在小尾寒羊上应用RNA-Seq研究发现,miR-221在空怀期乳腺组织中的表达量是泌乳期的3.6倍,但是尚不清楚miR-221对绵羊乳腺发育的调控机制。【目的】探讨miR-221通过靶向基因IRS1抑制绵羊乳腺上皮细胞的活力和增殖数量,为揭示miR-221对绵羊泌乳性能的分子调控机理提供理论参考。【方法】采集小尾寒羊乳腺、心脏、肝脏、肾脏、脾脏、肺脏、背最长肌和卵巢等8个组织样本,采用实时荧光定量PCR(reverse transcription-quantitative PCR, RT-qPCR)技术,构建miR-221在绵羊8个组织中的表达谱。采用细胞转染、CCK-8和Edu等方法,研究miR-221对绵羊乳腺上皮细胞活力和增殖的影响。利用miRDB和miRanda数据库,预测miR-221的靶基因,结合功能富集分析,确定目标靶基因,构建靶基因的野生型和突变性载体,进而用双荧光素酶报告试验,验证miR-221与预测靶基因间的靶向关系。分析过表达和沉默miR-221对靶基因及其信号通路下游功能基因的影响。【结果】RT-qPCR结果表明,miR-221在绵羊乳腺等8个组织中均表达,其中在肺脏和脾脏中的表达量最高,在背最长肌和肾脏中的表达量最低。CCK-8结果表明,miR-221模拟物抑制了绵羊乳腺上皮细胞的活力(P<0.01),而miR-221抑制剂提高了乳腺上皮细胞的活力(P<0.05)。Edu实验发现,miR-221模拟物减少了Edu标记的阳性乳腺上皮细胞数量(P<0.01),而miR-221抑制剂增加了Edu标记的阳性乳腺上皮细胞数量(P<0.01)。双荧光素酶报告实验结果表明,miR-221模拟物抑制了胰岛素受体底物1(insulin receptor substrate 1, IRS1)基因3′UTR区域的双荧光素酶活性(P<0.01),而miR-221抑制剂提高了该基因的活性(P<0.05),表明IRS1是miR-221的一个靶基因。RT-qPCR结果进一步发现,过表达miR-221降低了绵羊乳腺上皮细胞中IRS1和PIK3R1的表达量(P<0.05),沉默miR-221则提高了这2个基因的表达量(P<0.05)。过表达或沉默miR-221对乳腺上皮细胞中IGF1R的表达量没有显著影响(P>0.05)。【结论】miR-221通过抑制靶基因IRS1的表达量,最终抑制了绵羊乳腺上皮细胞的活力和增殖数量。