棉花,咖啡酸-O-甲基转移酶基因,基因克隆,表达分析,原核表达," />
棉花,咖啡酸-O-甲基转移酶基因,基因克隆,表达分析,原核表达,"/>
Gossypium hirsuturm L.,caffeic acid O-methyltransferase,gene cloning,expression analysis,prokaryotic expression
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中国农业科学 ›› 2010, Vol. 43 ›› Issue (6): 1117-1126 .doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2010.06.003
倪志勇,吕萌,李波,王娟,白岩,范玲
NI Zhi-yong, LÜ, Meng, LI Bo, WANG Juan, BAI Yan, FAN Ling#br#
摘要:
【目的】克隆棉花木质素合成关键酶基因GhCOMT1、GhCOMT2和GhCOMT3全长cDNA序列,分析其在不同组织部位的表达情况并进行原核表达研究。【方法】根据棉花纤维特异表达cDNA文库分析得到的EST序列设计引物,采用RT-PCR技术克隆基因,用生物信息学方法对获得的cDNA序列及推定的氨基酸序列进行分析。采用半定量RT-PCR方法研究GhCOMT1、GhCOMT2和GhCOMT3在不同组织中的表达。构建了基因的原核表达载体,经酶切鉴定后转化到大肠杆菌BL21(DE3)中并诱导表达。【结果】从发育的棉花纤维中克隆了3个COMT基因cDNAs, GhCOMT1(GenBank登录号为FJ479708)、GhCOMT2(GenBank登录号为FJ479709)和GhCOMT3(GenBank 登录号为FJ848869)分别具有1 101 bp、1 098 bp、1 071 bp的开放阅读框,各自编码366、365和356个氨基酸。GhCOMT1、GhCOMT2和GhCOMT3在棉花各个组织中都有表达,GhCOMT1和GhCOMT2在根部的表达量最高,GhCOMT3在茎中表达量最高。SDS-PAGE电泳分析表明,3个蛋白的最佳诱导表达条件均为0.2 mmol8226;L-1IPTG在37℃下诱导6 h。【结论】从棉花中克隆了3个木质素合成关键酶基因GhCOMT1、GhCOMT2和GhCOMT3,为进一步的生物学功能研究及其应用奠定了基础。