【目的】 基于单细胞测序技术探究绒山羊毛乳头细胞标记基因,优化毛乳头细胞体外鉴定的方法,为研究绒山羊毛囊发生发育提供良好的细胞模型。【方法】 运用Seurat单细胞分析法分析陕北白绒山羊胚胎期60、90、120 d皮肤组织的单细胞测序数据。原始数据经质控、过滤、标准化后,采用UMAP方法进行数据降维与聚类分析。通过对比已报道的毛囊相关标记基因,获得完整绒山羊毛囊细胞类群谱系信息。通过基因差异表达分析,筛选绒山羊毛乳头细胞特异性标记基因。利用免疫荧光试验鉴定标记蛋白在绒山羊皮肤组织中的表达与分布情况,进一步筛选毛乳头区域特异性表达蛋白。体视镜下机械分离完整绒山羊毛囊,采用酶消化法分离绒山羊毛乳头区域并在体外培养至细胞分离,最终通过差速贴壁法纯化细胞。待毛乳头细胞纯度较高时,利用免疫荧光试验验证候选标记蛋白在分离细胞中的表达情况。【结果】 从单细胞水平分析了绒山羊毛囊发生过程中涉及的关键细胞转录信息,成功获得绒山羊皮肤中的17个主要细胞类群信息,鉴定出包括真皮细胞谱系、表皮细胞谱系、毛乳头细胞、毛干细胞、内根鞘细胞等绒山羊皮肤结构关键细胞类群,以及周皮细胞、巨噬细胞、肌肉细胞等其他功能细胞类群。筛选获得毛乳头细胞特异性基因427个,包括SOX2、FGF7、APOD、BMP3、HHIP、HEY2和SPON1等,这些基因在绒山羊毛乳头细胞中的表达丰度远高于其他细胞类型,被认为是毛乳头细胞特异性标记基因。组织免疫荧光试验进一步证明SOX2、FGF7与APOD等蛋白在绒山羊毛乳头区域内特异性表达,可用于皮肤组织中绒山羊毛乳头细胞的定位。此外,本研究在成功分离单根绒山羊次级毛囊的基础上,实现了绒山羊毛乳头区域的贴壁培养,成功观测到大量细胞从毛乳头区域逐步迁移分离的过程。细胞免疫荧光试验结果显示SOX2、FGF7与APOD均在绒山羊毛乳头细胞中表达,且SOX2阳性细胞约占毛乳头细胞总量的76%左右,而FGF7和APOD阳性细胞则占98%以上。结合绒山羊皮肤组织免疫荧光定位结果,SOX2、FGF7与APOD等标记可用于鉴定体外分离培养的绒山羊毛乳头细胞。【结论】 利用单细胞测序技术描述了绒山羊主要皮肤细胞的转录组信息,筛选出毛乳头细胞特异性表达基因。经免疫荧光试验证实,单细胞测序鉴定标记基因的方法简单高效,且具备较高准确率。筛选的SOX2、FGF7与APOD不仅为绒山羊毛乳头细胞体内定位提供了有效的标记,而且为多标记鉴定毛乳头细胞提供可能,更为进一步研究毛囊发育相关基因的功能及调控机制奠定重要基础。
【目的】 测定引种自日本的多花黑麦草标准品种DUS测试用性状的一致性和特异性状况,优化我国多花黑麦草DUS测试体系,进而更快速准确地鉴定多花黑麦草新品种(系)。【方法】 选择在成都平原种植的7个引自日本的多花黑麦草标准品种,在每个标准品种群体中选取15株长势一致的材料,基于其DUS测试用性状数据对标准品种进行聚类分析,鉴定标准品种在成都平原DUS性状表达情况。通过计算供试材料单株的18个DUS测试用性状的变异系数和方差值,并对测试用性状进行嵌套方差分析,筛选出品种内一致性较高、品种群体间特异性明显的性状。对筛选出来的性状进行概率分级,基于该等级划分为参试国审品种和新品系进行聚类分析和品种鉴定,并对参试品种的测试性状进行相关性分析。【结果】 根据标准品种的18个DUS测试用性状的具体数值可以明确地将标准品种聚为7类,且DUS性状表达充分,能较为清晰地相互区分,可以进行后续的相关分析。品种内的一致性分析结果表明,叶色程度、春化后生长习性、孕穗期株幅、孕穗期旗叶宽、孕穗期旗叶长宽比和外颖长在多个品种内部的一致性表现较差。在进行品种群体间特异性分析时发现,孕穗期株高、孕穗期旗叶长宽比和小穗密度在品种群体间的特异性较差,其中孕穗期旗叶长宽比的品种群体间方差分量为54.83%,群体内单株间方差分量为45.17%。对筛选出的10个数量性状进行K-S检验及χ2检验,仅有基部小穗长符合χ2检验。最终将10个数量性状划分为5个等级,基于此性状分级结果对参试的多花黑麦草国审品种及新品系进行鉴定,结果表明供试品种能聚类为8个与品种相互对应的分组,证明了此性状分级对于多花黑麦草品种鉴定的可靠性。此外,基于参试品种性状表达级别绘制的热图结果表明,品种“特高德”在营养生长期的叶长明显区别于其他参试品种,表现为叶长较短;品种“川农2号”表现为春化后株高较高;品种“钻石T×长江2号”的穗下茎节长度明显短于其他参试品种;“达伯瑞”品种群体内一致性表现较差;“川农1号”“川农2号”品种群体内一致性表现较好。同时,筛选出的10个性状之间相关性较低,独立性较强,仅有3组性状间的相关系数大于0.5,可以作为DUS测试用性状。【结论】 基于日本标准品种建立的DUS测试用性状分级体系可以应用于我国多花黑麦草的品种鉴定和区分,研究结果为多花黑麦草品种DUS测试方法体系的优化提供了重要的技术和理论参考。
【背景】 作为我国本土重要的资源昆虫,中华蜜蜂（Apis cerana cerana,简称中蜂）对我国初冬季低温开花植物的传粉具有重要的生态价值,其传粉习性与嗅觉系统密切相关。前期对中蜂采集蜂高、低温处理后的触角转录组数据分析发现,与昆虫嗅觉相关的尼曼匹克C2型蛋白（Niemann-Pick type C2 protein,NPC2）基因家族在低温时表达量上升。【目的】 以中蜂NPC2家族基因为研究对象,克隆并分析其结构特征和表达谱以及高、低温处理下表达量的差异,为深入研究中蜂NPC2基因家族在中蜂低温适应的嗅觉感受功能提供参考。【方法】 基于中蜂高、低温转录组测序结果,利用RT-PCR克隆获得中蜂NPC2基因ORF序列,进行系统进化树分析和三维结构预测,然后通过实时荧光定量PCR分析中蜂NPC2基因在不同发育时期、组织的时空表达谱,以及高、低温时的表达量变化。【结果】 获得4个中蜂NPC2基因——AcNPC2a、AcNPC2b、AcNPC2c、AcNPC2d的ORF全长,分别为447、480、459和465 bp,编码148、159、152和154个氨基酸,预测蛋白分子量为16.12—18.53 kD,等电点分别为7.98、7.57、6.56和6.34。进化树分析显示AcNPC2与意大利蜜蜂的NPC2同源序列亲缘关系最近,与其他膜翅目昆虫NPC2也有一定相似性。实时荧光定量PCR结果显示,AcNPC2a在新出房蜂的腹部表达量最高,其次是在哺育蜂的腹部以及幼虫期;AcNPC2b在新出房蜂的胸部表达最高,在采集蜂的头部、胸部和后足也有表达;AcNPC2c在哺育蜂和采集蜂的触角中呈高丰度表达;AcNPC2d在采集蜂的头部表达量最高。经低温处理后,4个AcNPC2基因在采集蜂触角中的表达量均有所上升,但差异不显著。【结论】 AcNPC2具有NPC2蛋白的保守结构,其基因家族成员在中蜂的时空表达谱中呈现多样性,其中AcNPC2c在触角中呈高丰度表达,表明其与中蜂嗅觉感受功能关系密切。AcNPC2基因家族在低温时采集蜂触角中表达量均有所上升,表明该基因家族有可能参与中蜂的低温适应性,或与初冬季访花行为有关。
【目的】 探讨ADIPOQ遗传变异对绵羊生长性状的影响,找到与宁夏优质肉羊培育中生长性状相关的分子遗传标记,为宁夏优质肉羊的分子辅助育种的研究提供依据。【方法】 首先利用液相捕获测序技术获得ADIPOQ在杜泊羊、滩羊和小尾寒羊中的变异位点,同时采集383只3个品种的不同杂交后代群体耳组织,采用飞行质谱技术对确定的SNPs位点进行基因分型检测,并使用Haploview软件对多态性位点进行连锁不平衡分析和构建单倍型,与绵羊初生和3月龄的生长性状进行关联分析。【结果】 共筛选到7个SNPs位点,且7个位点在杂交后代群体中均表现出多态性,SNP1—SNP7位点的优势基因型分别为CC、GG、GG、CT、AG、GG和AA,优势等位基因分别为C、G、G、C、G、G和A。X 2检验发现,所有位点均处于Hardy-Weinberg平衡状态（除SNP7位点在所有个体中偏离了平衡）。SNP1（F2代除外）、SNP4、SNP5和SNP6位点在各杂交后代及所有个体中均处于中度多态（0.25≤PIC<0.50）,SNP2和SNP3在F2代及SNP7在H1代群体中均处于中度多态（0.25≤PIC<0.50）,而在其他群体中处于低度多态（PIC<0.25）。连锁不平衡分析发现,SNP2-SNP3和SNP5-SNP6形成了两处强连锁,均构建出3种单倍型,组合后分别形成4和6种基因型,其中优势基因型分别为H1H1和H4H6。将SNP2-SNP3和SNP5-SNP6形成的单倍型再组合后产生13种基因型,其优势基因型为H1H1H4H6。单个位点关联分析表明：SNP1位点在F1代群体中,GG基因型的初生胸围显著高于CG基因型（P<0.05）,在H2代群体中,CC基因型的初生体斜长显著高于CG基因型（P<0.05）。SNP2位点在H1代群体中,CC基因型的初生体高显著低于CG和GG基因型（P<0.05）。SNP3位点在F1代群体中,AG基因型的3月龄体重显著高于GG基因型（P<0.05）,在H1代群体中,AA基因型的初生体高显著低于AG和GG基因型（P<0.05）。SNP4位点在F1代群体中,CC基因型的3月龄体重显著高于CT和TT基因型（P<0.05）,在F2代群体中,CT基因型的初生体重和初生胸围显著高于TT基因型（P<0.05）,在H1代群体中,TT基因型的初生体重显著低于CC和CT基因型（P<0.05）,在H2代群体中,TT基因型的初生体高和初生体斜长显著高于CT基因型（P<0.05）。SNP5位点在F2代群体中,AA基因型的初生体高和初生体斜长显著高于GG基因型（P<0.05）。SNP6位点的不同基因型在F2代、H1代和H2代的初生体重、体高、体斜长、3月龄体高和胸围上均有不同程度的显著差异（P<0.05）。SNP7位点在H2代群体中,AA基因型的初生体斜长显著高于GA基因型（P<0.05）。联合所有群体进行分析时发现,SNP2位点CG基因型的初生体重和体斜长显著高于GG基因型（P<0.05）,SNP4位点TT基因型的初生体重显著低于CC和CT基因型（P<0.05）,SNP6位点AA基因型的初生体重显著高于GG和GA基因型（P<0.05）、初生胸围显著高于GG基因型（P<0.05）,其他5个位点的基因型在生长性状上均无显著差异（P>0.05）。单倍型组合关联分析发现：H2H3基因型的初生体重和初生体斜长显著高于其他基因型（P<0.05）;而SNP5-SNP6单倍型组合中,H5H5基因型的初生体重显著高于H5H6和H6H6（P<0.05）、初生体高显著高于H5H6（P<0.05）、初生胸围显著高于H6H6（P<0.05）,H4H4基因型的3月龄体重显著高于H5H5基因型（P<0.05）、3月龄体高和体斜长显著高于H4H6基因型（P<0.05）、3月龄胸围显著高于H4H5、H5H6和H5H5基因型（P<0.05）。SNP2-SNP3和SNP5-SNP6形成的单倍型再组合后,H2H3H4H4基因型的初生体重、体高、体斜长和胸围最高,与其他基因型有不同程度的差异,H1H1H4H6的3月龄体斜长显著低于H1H2H4H4和H2H2H4H4基因型（P<0.05）。【结论】 ADIPOQ的遗传变异对绵羊的生长性状具有不同程度的影响,研究中的7个SNPs位点可以作为宁夏优质肉羊选育中生长性状的潜在分子标记。
【背景】 母体放牧历史可以改变羊草（Leymus chinensis）克隆后代的形态及光合生理性状,也可以改变其对干旱环境的响应,但是母体放牧历史是否影响了羊草克隆后代对家畜啃食的响应尚不清楚。【目的】 研究母体放牧历史是否增强了羊草克隆后代对模拟家畜啃食（刈割）的适应性。【方法】 利用不同放牧历史的羊草克隆后代（1983年围封 VS 长期自由放牧）进行室内盆栽试验,从个体性状、子株数、生物量及生物量分配等角度对比了其对模拟放牧处理（刈割）的响应。【结果】 （1）母体放牧历史与刈割处理对羊草单株株高、单株生物量交互作用极显著,放牧羊草克隆后代（GZ）单株株高、单株生物量对刈割处理的抵抗力较围封羊草克隆后代（NG）强;但是,母体放牧历史并没有明显改变羊草克隆后代子株数对刈割处理的响应。（2）母体放牧历史与刈割处理对羊草根茎生物量交互作用显著,对地上、根系及总生物量交互作用不显著,但是NG地上、根系及总生物量在刈割处理下的表型可塑性指数及绝对减少量均明显大于GZ。因此,母体放牧经历增强了羊草克隆后代对刈割处理的适应性。（3）NG在刈割处理下被刈割掉的地上部分生物量显著小于GZ,但是NG的被刈割程度（被刈割生物量/总生物量）显著高于GZ。（4）GZ生物量分配对刈割处理响应不显著,但是刈割处理显著降低了NG的根茎生物量分配。【结论】 羊草母体经历放牧干扰后,其克隆后代对家畜啃食的适应性增强;母体放牧历史并不通过改变生物量分配增强羊草克隆后代的适牧性,叶片光合生理的响应及避牧性可能是母体放牧历史增强羊草克隆后代的途径。本研究通过控制试验排除土壤等环境因子的干扰,从植物自身角度出发,研究其克隆后代表型性状对放牧的响应,这对充分认识草原生态系统放牧退化过程及退化修复过程提供了新的视角。
【背景】MicroRNAs（miRNA）是一类小RNA分子（18—23nt）,广泛参与了家畜乳腺发育和泌乳性能的调控。项目组前期在小尾寒羊上应用RNA-Seq研究发现,miR-221在空怀期乳腺组织中的表达量是泌乳期的3.6倍,但是尚不清楚miR-221对绵羊乳腺发育的调控机制。【目的】探讨miR-221是否通过靶向基因IRS1抑制绵羊乳腺上皮细胞的活力和增殖数量,为揭示miR-221对绵羊泌乳性能的分子调控机理提供理论参考。【方法】采集小尾寒羊乳腺、心脏、肝脏、肾脏、脾脏、肺脏、背最长肌和卵巢等8个组织样本,采用实时荧光定量PCR（reverse transcription-quantitative PCR, RT-qPCR）技术,构建miR-221在绵羊8个组织中的表达谱。采用细胞转染、CCK-8和Edu等方法,研究miR-221对绵羊乳腺上皮细胞活力和增殖的影响。利用miRDB和miRanda数据库,预测miR-221的靶基因,结合功能富集分析,确定目标靶基因,构建靶基因的野生型和突变型载体,进而用双荧光素酶报告实验,验证miR-221与预测靶基因间的靶向关系。分析过表达和沉默miR-221对靶基因及其信号通路下游功能基因的影响。【结果】RT-qPCR结果表明,miR-221在绵羊乳腺等8个组织中均表达,其中在肺脏和脾脏中的表达量最高,在背最长肌和肾脏中的表达量最低。CCK-8结果表明,miR-221模拟物抑制了绵羊乳腺上皮细胞的活力（P<0.01）,而miR-221抑制剂提高了乳腺上皮细胞的活力（P<0.05）。Edu试验发现,miR-221模拟物减少了Edu标记的阳性乳腺上皮细胞数量（P<0.01）,而miR-221抑制剂增加了Edu标记的阳性乳腺上皮细胞数量（P<0.01）。双荧光素酶报告实验结果表明,miR-221模拟物抑制了胰岛素受体底物1（insulin receptor substrate 1, IRS1）基因3′UTR区域的双荧光素酶活性（P<0.01）,而miR-221抑制剂提高了该基因的活性（P<0.05）,表明IRS1是miR-221的一个靶基因。RT-qPCR结果进一步发现,过表达miR-221降低了绵羊乳腺上皮细胞中IRS1和PIK3R1的表达量（P<0.05）,沉默miR-221则提高了这2个基因的表达量（P<0.05）。过表达或沉默miR-221对乳腺上皮细胞中IGF1R的表达量没有显著影响（P>0.05）。【结论】miR-221通过抑制靶基因IRS1的表达量,最终抑制了绵羊乳腺上皮细胞的活力和增殖数量。
【背景】颗粒细胞类固醇激素的合成能力对卵泡发育及成熟具有重要作用,但其关键的调控因子尚不完全清楚。笔者前期的研究表明肝激酶B1（liver kinase B1,LKB1）基因参与细胞的脂类代谢,类固醇激素的合成与脂类代谢密切相关,并且有研究结果亦显示LKB1敲除可引起小鼠卵巢早衰,表明LKB1对维持卵巢的功能很关键,其在颗粒细胞的确切功能需要进一步研究。【目的】探究LKB1在牛卵泡中的表达模式及其对颗粒细胞类固醇激素生成相关基因的调控作用, 为母牛繁殖生理调控研究提供理论依据。【方法】采用免疫组织化学染色对LKB1蛋白在卵泡中进行定位研究;同时分离培养牛原代颗粒细胞,并以促卵泡素受体（follicle stimulating hormone receptor, FSHR）蛋白作为标记基因,细胞免疫荧光染色鉴定颗粒细胞及纯度;然后以原代颗粒细胞为模型,采用siRNA沉默LKB1的技术,利用qRT-PCR方法检测LKB1功能缺失对类固醇激素合成相关基因表达的影响,另一方面采用腺病毒过表达LKB1,qRT-PCR和ELISA技术验证LKB1对类固醇激素合成相关基因表达的调控作用及雌二醇分泌。【结果】 1) LKB1蛋白在卵泡中的细胞均表达,但颗粒细胞的染色信号强于膜细胞,进一步的定量分析显示颗粒细胞的表达量显著高于卵泡膜细胞。2) 分离培养的牛原代卵泡颗粒细胞贴壁生长、细胞形态多呈圆形,能被颗粒细胞标志基因FSHR抗体标记。3) RNAi技术能显著抑制LKB1的表达。与对照相比,siRNA1和siRNA2干扰LKB1的效率分别为48% (P<0.05)和52% (P<0.05);沉默LKB1显著降低颗粒细胞类固醇激素合成基因 STAR (P<0.01)、CYP11A1 (P<0.01)和CYP19A1 (P<0.05)的表达,分别下调了约为对照组的60%、80%和50%。4) LKB1过表达腺病毒及对照组对颗粒细胞均具有高的感染效率,LKB1过表达效率高达10倍（P<0.01）;过表达LKB1显著上调STAR (P<0.01)、CYP11A1 (P<0.01)和CYP19A1 (P<0.05)的表达,进一步研究显示LKB1基因功能获得促进颗粒细胞雌二醇的分泌（P<0.05）。【结论】LKB1在卵泡颗粒细胞中高表达,促进类固醇激素生成基因STAR 、CYP11A1和CYP19A1的表达和雌二醇的分泌。本研究将为LKB1调控牛颗粒细胞类固醇激素合成的功能提供直接的理论依据。
【目的】流感病毒是一种人兽共患病原,常引起大流行,给人类健康造成巨大威胁,且流感病毒易发生变异,能不断逃逸宿主细胞的免疫反应,对现有抗流感药物产生耐药性,因此寻找抵抗流感的新方法迫在眉睫。研究通过探索NMRAL1(NmrA-like family domain-containing protein 1)对流感病毒复制的影响,并揭示其发挥作用的分子机制,为抗流感药物研发提供潜在靶点。【方法】采用siRNA干扰技术在A549细胞中下调表达NMRAL1,并通过Western Blot检测siRNA干扰后NMRAL1的表达水平;在下调表达NMRAL1的细胞中,分别感染A/Anhui/2/2005 (AH05) (H5N1)和A/WSN/33 (H1N1) 两株不同亚型流感病毒,利用蚀斑试验检测感染病毒后24和48 h细胞上清中的病毒滴度。为确定NMRAL1影响流感病毒复制的具体阶段,在HEK293T细胞中瞬时转染NMRAL1-Myc-pCAGGS质粒过表达NMRAL1,通过双荧光素酶报告系统检测过表达NMRAL1对流感病毒聚合酶活性的影响;使用免疫荧光技术对流感病毒NP蛋白进行染色,通过激光共聚焦试验观察下调表达NMRAL1对感染病毒后3、4、5、6和8 h NP蛋白在被感染细胞中的定位情况的影响,判断下调表达NMRAL1是否影响流感病毒的入核和出核过程;利用Western Blot检测下调表达NMRAL1对流感病毒各病毒蛋白表达的影响和对流感病毒激活I型干扰素通路下游IFN刺激基因（ISGs）表达的影响,利用间接免疫荧光试验进一步研究NMRAL1对流感病毒复制的影响。【结果】Western Blot检测发现NMRAL1 siRNA能显著下调NMRAL1表达,在下调表达NMRAL1的A549细胞中分别感染H5N1和H1N1病毒,并通过蚀斑试验检测感染病毒后细胞上清中的病毒滴度,结果显示在下调表达NMRAL1的细胞中,感染流感病毒后24和48 h收取的细胞上清中病毒滴度显著下降,表明NMRAL1能促进不同亚型流感病毒的复制;为进一步探索NMRAL1调控流感病毒复制的具体机制,利用双荧光素酶报告系统检测流感病毒聚合酶活性,发现过表达NMRAL1对流感病毒聚合酶活性无明显影响;激光共聚焦试验结果显示下调NMRAL1表达不影响NP蛋白的入核和出核过程,同时Western Blot检测表明下调NMRAL1表达不影响各病毒蛋白的表达;但荧光定量PCR试验结果显示下调NMRAL1表达能够促进流感病毒感染诱导的IFN-β mRNA水平上升,且Western Blot检测发现下调表达NMRAL1促进I型干扰素通路下游的MxA和IFITM3抗病毒蛋白的表达,与此同时,间接免疫荧光试验结果显示下调NMRAL1表达可显著抑制流感病毒复制。【结论】在流感病毒感染过程中,NMRAL1不影响流感病毒的入侵以及转录翻译过程,而是通过抑制I型干扰素通路激活从而抑制MxA、IFITM3等抗病毒因子的表达,最终促进流感病毒复制。研究证实宿主因子NMRAL1正调控流感病毒的复制,丰富了参与流感病毒复制的宿主因子网络。
