【目的】 基于单细胞测序技术探究绒山羊毛乳头细胞标记基因,优化毛乳头细胞体外鉴定的方法,为研究绒山羊毛囊发生发育提供良好的细胞模型。【方法】 运用Seurat单细胞分析法分析陕北白绒山羊胚胎期60、90、120 d皮肤组织的单细胞测序数据。原始数据经质控、过滤、标准化后,采用UMAP方法进行数据降维与聚类分析。通过对比已报道的毛囊相关标记基因,获得完整绒山羊毛囊细胞类群谱系信息。通过基因差异表达分析,筛选绒山羊毛乳头细胞特异性标记基因。利用免疫荧光试验鉴定标记蛋白在绒山羊皮肤组织中的表达与分布情况,进一步筛选毛乳头区域特异性表达蛋白。体视镜下机械分离完整绒山羊毛囊,采用酶消化法分离绒山羊毛乳头区域并在体外培养至细胞分离,最终通过差速贴壁法纯化细胞。待毛乳头细胞纯度较高时,利用免疫荧光试验验证候选标记蛋白在分离细胞中的表达情况。【结果】 从单细胞水平分析了绒山羊毛囊发生过程中涉及的关键细胞转录信息,成功获得绒山羊皮肤中的17个主要细胞类群信息,鉴定出包括真皮细胞谱系、表皮细胞谱系、毛乳头细胞、毛干细胞、内根鞘细胞等绒山羊皮肤结构关键细胞类群,以及周皮细胞、巨噬细胞、肌肉细胞等其他功能细胞类群。筛选获得毛乳头细胞特异性基因427个,包括SOX2、FGF7、APOD、BMP3、HHIP、HEY2和SPON1等,这些基因在绒山羊毛乳头细胞中的表达丰度远高于其他细胞类型,被认为是毛乳头细胞特异性标记基因。组织免疫荧光试验进一步证明SOX2、FGF7与APOD等蛋白在绒山羊毛乳头区域内特异性表达,可用于皮肤组织中绒山羊毛乳头细胞的定位。此外,本研究在成功分离单根绒山羊次级毛囊的基础上,实现了绒山羊毛乳头区域的贴壁培养,成功观测到大量细胞从毛乳头区域逐步迁移分离的过程。细胞免疫荧光试验结果显示SOX2、FGF7与APOD均在绒山羊毛乳头细胞中表达,且SOX2阳性细胞约占毛乳头细胞总量的76%左右,而FGF7和APOD阳性细胞则占98%以上。结合绒山羊皮肤组织免疫荧光定位结果,SOX2、FGF7与APOD等标记可用于鉴定体外分离培养的绒山羊毛乳头细胞。【结论】 利用单细胞测序技术描述了绒山羊主要皮肤细胞的转录组信息,筛选出毛乳头细胞特异性表达基因。经免疫荧光试验证实,单细胞测序鉴定标记基因的方法简单高效,且具备较高准确率。筛选的SOX2、FGF7与APOD不仅为绒山羊毛乳头细胞体内定位提供了有效的标记,而且为多标记鉴定毛乳头细胞提供可能,更为进一步研究毛囊发育相关基因的功能及调控机制奠定重要基础。
【目的】 测定引种自日本的多花黑麦草标准品种DUS测试用性状的一致性和特异性状况,优化我国多花黑麦草DUS测试体系,进而更快速准确地鉴定多花黑麦草新品种(系)。【方法】 选择在成都平原种植的7个引自日本的多花黑麦草标准品种,在每个标准品种群体中选取15株长势一致的材料,基于其DUS测试用性状数据对标准品种进行聚类分析,鉴定标准品种在成都平原DUS性状表达情况。通过计算供试材料单株的18个DUS测试用性状的变异系数和方差值,并对测试用性状进行嵌套方差分析,筛选出品种内一致性较高、品种群体间特异性明显的性状。对筛选出来的性状进行概率分级,基于该等级划分为参试国审品种和新品系进行聚类分析和品种鉴定,并对参试品种的测试性状进行相关性分析。【结果】 根据标准品种的18个DUS测试用性状的具体数值可以明确地将标准品种聚为7类,且DUS性状表达充分,能较为清晰地相互区分,可以进行后续的相关分析。品种内的一致性分析结果表明,叶色程度、春化后生长习性、孕穗期株幅、孕穗期旗叶宽、孕穗期旗叶长宽比和外颖长在多个品种内部的一致性表现较差。在进行品种群体间特异性分析时发现,孕穗期株高、孕穗期旗叶长宽比和小穗密度在品种群体间的特异性较差,其中孕穗期旗叶长宽比的品种群体间方差分量为54.83%,群体内单株间方差分量为45.17%。对筛选出的10个数量性状进行K-S检验及χ2检验,仅有基部小穗长符合χ2检验。最终将10个数量性状划分为5个等级,基于此性状分级结果对参试的多花黑麦草国审品种及新品系进行鉴定,结果表明供试品种能聚类为8个与品种相互对应的分组,证明了此性状分级对于多花黑麦草品种鉴定的可靠性。此外,基于参试品种性状表达级别绘制的热图结果表明,品种“特高德”在营养生长期的叶长明显区别于其他参试品种,表现为叶长较短;品种“川农2号”表现为春化后株高较高;品种“钻石T×长江2号”的穗下茎节长度明显短于其他参试品种;“达伯瑞”品种群体内一致性表现较差;“川农1号”“川农2号”品种群体内一致性表现较好。同时,筛选出的10个性状之间相关性较低,独立性较强,仅有3组性状间的相关系数大于0.5,可以作为DUS测试用性状。【结论】 基于日本标准品种建立的DUS测试用性状分级体系可以应用于我国多花黑麦草的品种鉴定和区分,研究结果为多花黑麦草品种DUS测试方法体系的优化提供了重要的技术和理论参考。
【背景】 作为我国本土重要的资源昆虫,中华蜜蜂（Apis cerana cerana,简称中蜂）对我国初冬季低温开花植物的传粉具有重要的生态价值,其传粉习性与嗅觉系统密切相关。前期对中蜂采集蜂高、低温处理后的触角转录组数据分析发现,与昆虫嗅觉相关的尼曼匹克C2型蛋白（Niemann-Pick type C2 protein,NPC2）基因家族在低温时表达量上升。【目的】 以中蜂NPC2家族基因为研究对象,克隆并分析其结构特征和表达谱以及高、低温处理下表达量的差异,为深入研究中蜂NPC2基因家族在中蜂低温适应的嗅觉感受功能提供参考。【方法】 基于中蜂高、低温转录组测序结果,利用RT-PCR克隆获得中蜂NPC2基因ORF序列,进行系统进化树分析和三维结构预测,然后通过实时荧光定量PCR分析中蜂NPC2基因在不同发育时期、组织的时空表达谱,以及高、低温时的表达量变化。【结果】 获得4个中蜂NPC2基因——AcNPC2a、AcNPC2b、AcNPC2c、AcNPC2d的ORF全长,分别为447、480、459和465 bp,编码148、159、152和154个氨基酸,预测蛋白分子量为16.12—18.53 kD,等电点分别为7.98、7.57、6.56和6.34。进化树分析显示AcNPC2与意大利蜜蜂的NPC2同源序列亲缘关系最近,与其他膜翅目昆虫NPC2也有一定相似性。实时荧光定量PCR结果显示,AcNPC2a在新出房蜂的腹部表达量最高,其次是在哺育蜂的腹部以及幼虫期;AcNPC2b在新出房蜂的胸部表达最高,在采集蜂的头部、胸部和后足也有表达;AcNPC2c在哺育蜂和采集蜂的触角中呈高丰度表达;AcNPC2d在采集蜂的头部表达量最高。经低温处理后,4个AcNPC2基因在采集蜂触角中的表达量均有所上升,但差异不显著。【结论】 AcNPC2具有NPC2蛋白的保守结构,其基因家族成员在中蜂的时空表达谱中呈现多样性,其中AcNPC2c在触角中呈高丰度表达,表明其与中蜂嗅觉感受功能关系密切。AcNPC2基因家族在低温时采集蜂触角中表达量均有所上升,表明该基因家族有可能参与中蜂的低温适应性,或与初冬季访花行为有关。
【目的】 探讨ADIPOQ遗传变异对绵羊生长性状的影响,找到与宁夏优质肉羊培育中生长性状相关的分子遗传标记,为宁夏优质肉羊的分子辅助育种的研究提供依据。【方法】 首先利用液相捕获测序技术获得ADIPOQ在杜泊羊、滩羊和小尾寒羊中的变异位点,同时采集383只3个品种的不同杂交后代群体耳组织,采用飞行质谱技术对确定的SNPs位点进行基因分型检测,并使用Haploview软件对多态性位点进行连锁不平衡分析和构建单倍型,与绵羊初生和3月龄的生长性状进行关联分析。【结果】 共筛选到7个SNPs位点,且7个位点在杂交后代群体中均表现出多态性,SNP1—SNP7位点的优势基因型分别为CC、GG、GG、CT、AG、GG和AA,优势等位基因分别为C、G、G、C、G、G和A。X 2检验发现,所有位点均处于Hardy-Weinberg平衡状态（除SNP7位点在所有个体中偏离了平衡）。SNP1（F2代除外）、SNP4、SNP5和SNP6位点在各杂交后代及所有个体中均处于中度多态（0.25≤PIC<0.50）,SNP2和SNP3在F2代及SNP7在H1代群体中均处于中度多态（0.25≤PIC<0.50）,而在其他群体中处于低度多态（PIC<0.25）。连锁不平衡分析发现,SNP2-SNP3和SNP5-SNP6形成了两处强连锁,均构建出3种单倍型,组合后分别形成4和6种基因型,其中优势基因型分别为H1H1和H4H6。将SNP2-SNP3和SNP5-SNP6形成的单倍型再组合后产生13种基因型,其优势基因型为H1H1H4H6。单个位点关联分析表明：SNP1位点在F1代群体中,GG基因型的初生胸围显著高于CG基因型（P<0.05）,在H2代群体中,CC基因型的初生体斜长显著高于CG基因型（P<0.05）。SNP2位点在H1代群体中,CC基因型的初生体高显著低于CG和GG基因型（P<0.05）。SNP3位点在F1代群体中,AG基因型的3月龄体重显著高于GG基因型（P<0.05）,在H1代群体中,AA基因型的初生体高显著低于AG和GG基因型（P<0.05）。SNP4位点在F1代群体中,CC基因型的3月龄体重显著高于CT和TT基因型（P<0.05）,在F2代群体中,CT基因型的初生体重和初生胸围显著高于TT基因型（P<0.05）,在H1代群体中,TT基因型的初生体重显著低于CC和CT基因型（P<0.05）,在H2代群体中,TT基因型的初生体高和初生体斜长显著高于CT基因型（P<0.05）。SNP5位点在F2代群体中,AA基因型的初生体高和初生体斜长显著高于GG基因型（P<0.05）。SNP6位点的不同基因型在F2代、H1代和H2代的初生体重、体高、体斜长、3月龄体高和胸围上均有不同程度的显著差异（P<0.05）。SNP7位点在H2代群体中,AA基因型的初生体斜长显著高于GA基因型（P<0.05）。联合所有群体进行分析时发现,SNP2位点CG基因型的初生体重和体斜长显著高于GG基因型（P<0.05）,SNP4位点TT基因型的初生体重显著低于CC和CT基因型（P<0.05）,SNP6位点AA基因型的初生体重显著高于GG和GA基因型（P<0.05）、初生胸围显著高于GG基因型（P<0.05）,其他5个位点的基因型在生长性状上均无显著差异（P>0.05）。单倍型组合关联分析发现：H2H3基因型的初生体重和初生体斜长显著高于其他基因型（P<0.05）;而SNP5-SNP6单倍型组合中,H5H5基因型的初生体重显著高于H5H6和H6H6（P<0.05）、初生体高显著高于H5H6（P<0.05）、初生胸围显著高于H6H6（P<0.05）,H4H4基因型的3月龄体重显著高于H5H5基因型（P<0.05）、3月龄体高和体斜长显著高于H4H6基因型（P<0.05）、3月龄胸围显著高于H4H5、H5H6和H5H5基因型（P<0.05）。SNP2-SNP3和SNP5-SNP6形成的单倍型再组合后,H2H3H4H4基因型的初生体重、体高、体斜长和胸围最高,与其他基因型有不同程度的差异,H1H1H4H6的3月龄体斜长显著低于H1H2H4H4和H2H2H4H4基因型（P<0.05）。【结论】 ADIPOQ的遗传变异对绵羊的生长性状具有不同程度的影响,研究中的7个SNPs位点可以作为宁夏优质肉羊选育中生长性状的潜在分子标记。
【背景】 母体放牧历史可以改变羊草（Leymus chinensis）克隆后代的形态及光合生理性状,也可以改变其对干旱环境的响应,但是母体放牧历史是否影响了羊草克隆后代对家畜啃食的响应尚不清楚。【目的】 研究母体放牧历史是否增强了羊草克隆后代对模拟家畜啃食（刈割）的适应性。【方法】 利用不同放牧历史的羊草克隆后代（1983年围封 VS 长期自由放牧）进行室内盆栽试验,从个体性状、子株数、生物量及生物量分配等角度对比了其对模拟放牧处理（刈割）的响应。【结果】 （1）母体放牧历史与刈割处理对羊草单株株高、单株生物量交互作用极显著,放牧羊草克隆后代（GZ）单株株高、单株生物量对刈割处理的抵抗力较围封羊草克隆后代（NG）强;但是,母体放牧历史并没有明显改变羊草克隆后代子株数对刈割处理的响应。（2）母体放牧历史与刈割处理对羊草根茎生物量交互作用显著,对地上、根系及总生物量交互作用不显著,但是NG地上、根系及总生物量在刈割处理下的表型可塑性指数及绝对减少量均明显大于GZ。因此,母体放牧经历增强了羊草克隆后代对刈割处理的适应性。（3）NG在刈割处理下被刈割掉的地上部分生物量显著小于GZ,但是NG的被刈割程度（被刈割生物量/总生物量）显著高于GZ。（4）GZ生物量分配对刈割处理响应不显著,但是刈割处理显著降低了NG的根茎生物量分配。【结论】 羊草母体经历放牧干扰后,其克隆后代对家畜啃食的适应性增强;母体放牧历史并不通过改变生物量分配增强羊草克隆后代的适牧性,叶片光合生理的响应及避牧性可能是母体放牧历史增强羊草克隆后代的途径。本研究通过控制试验排除土壤等环境因子的干扰,从植物自身角度出发,研究其克隆后代表型性状对放牧的响应,这对充分认识草原生态系统放牧退化过程及退化修复过程提供了新的视角。
【背景】MicroRNAs（miRNA）是一类小RNA分子（18—23nt）,广泛参与了家畜乳腺发育和泌乳性能的调控。项目组前期在小尾寒羊上应用RNA-Seq研究发现,miR-221在空怀期乳腺组织中的表达量是泌乳期的3.6倍,但是尚不清楚miR-221对绵羊乳腺发育的调控机制。【目的】探讨miR-221是否通过靶向基因IRS1抑制绵羊乳腺上皮细胞的活力和增殖数量,为揭示miR-221对绵羊泌乳性能的分子调控机理提供理论参考。【方法】采集小尾寒羊乳腺、心脏、肝脏、肾脏、脾脏、肺脏、背最长肌和卵巢等8个组织样本,采用实时荧光定量PCR（reverse transcription-quantitative PCR, RT-qPCR）技术,构建miR-221在绵羊8个组织中的表达谱。采用细胞转染、CCK-8和Edu等方法,研究miR-221对绵羊乳腺上皮细胞活力和增殖的影响。利用miRDB和miRanda数据库,预测miR-221的靶基因,结合功能富集分析,确定目标靶基因,构建靶基因的野生型和突变型载体,进而用双荧光素酶报告实验,验证miR-221与预测靶基因间的靶向关系。分析过表达和沉默miR-221对靶基因及其信号通路下游功能基因的影响。【结果】RT-qPCR结果表明,miR-221在绵羊乳腺等8个组织中均表达,其中在肺脏和脾脏中的表达量最高,在背最长肌和肾脏中的表达量最低。CCK-8结果表明,miR-221模拟物抑制了绵羊乳腺上皮细胞的活力（P<0.01）,而miR-221抑制剂提高了乳腺上皮细胞的活力（P<0.05）。Edu试验发现,miR-221模拟物减少了Edu标记的阳性乳腺上皮细胞数量（P<0.01）,而miR-221抑制剂增加了Edu标记的阳性乳腺上皮细胞数量（P<0.01）。双荧光素酶报告实验结果表明,miR-221模拟物抑制了胰岛素受体底物1（insulin receptor substrate 1, IRS1）基因3′UTR区域的双荧光素酶活性（P<0.01）,而miR-221抑制剂提高了该基因的活性（P<0.05）,表明IRS1是miR-221的一个靶基因。RT-qPCR结果进一步发现,过表达miR-221降低了绵羊乳腺上皮细胞中IRS1和PIK3R1的表达量（P<0.05）,沉默miR-221则提高了这2个基因的表达量（P<0.05）。过表达或沉默miR-221对乳腺上皮细胞中IGF1R的表达量没有显著影响（P>0.05）。【结论】miR-221通过抑制靶基因IRS1的表达量,最终抑制了绵羊乳腺上皮细胞的活力和增殖数量。
【背景】颗粒细胞类固醇激素的合成能力对卵泡发育及成熟具有重要作用,但其关键的调控因子尚不完全清楚。笔者前期的研究表明肝激酶B1（liver kinase B1,LKB1）基因参与细胞的脂类代谢,类固醇激素的合成与脂类代谢密切相关,并且有研究结果亦显示LKB1敲除可引起小鼠卵巢早衰,表明LKB1对维持卵巢的功能很关键,其在颗粒细胞的确切功能需要进一步研究。【目的】探究LKB1在牛卵泡中的表达模式及其对颗粒细胞类固醇激素生成相关基因的调控作用, 为母牛繁殖生理调控研究提供理论依据。【方法】采用免疫组织化学染色对LKB1蛋白在卵泡中进行定位研究;同时分离培养牛原代颗粒细胞,并以促卵泡素受体（follicle stimulating hormone receptor, FSHR）蛋白作为标记基因,细胞免疫荧光染色鉴定颗粒细胞及纯度;然后以原代颗粒细胞为模型,采用siRNA沉默LKB1的技术,利用qRT-PCR方法检测LKB1功能缺失对类固醇激素合成相关基因表达的影响,另一方面采用腺病毒过表达LKB1,qRT-PCR和ELISA技术验证LKB1对类固醇激素合成相关基因表达的调控作用及雌二醇分泌。【结果】 1) LKB1蛋白在卵泡中的细胞均表达,但颗粒细胞的染色信号强于膜细胞,进一步的定量分析显示颗粒细胞的表达量显著高于卵泡膜细胞。2) 分离培养的牛原代卵泡颗粒细胞贴壁生长、细胞形态多呈圆形,能被颗粒细胞标志基因FSHR抗体标记。3) RNAi技术能显著抑制LKB1的表达。与对照相比,siRNA1和siRNA2干扰LKB1的效率分别为48% (P<0.05)和52% (P<0.05);沉默LKB1显著降低颗粒细胞类固醇激素合成基因 STAR (P<0.01)、CYP11A1 (P<0.01)和CYP19A1 (P<0.05)的表达,分别下调了约为对照组的60%、80%和50%。4) LKB1过表达腺病毒及对照组对颗粒细胞均具有高的感染效率,LKB1过表达效率高达10倍（P<0.01）;过表达LKB1显著上调STAR (P<0.01)、CYP11A1 (P<0.01)和CYP19A1 (P<0.05)的表达,进一步研究显示LKB1基因功能获得促进颗粒细胞雌二醇的分泌（P<0.05）。【结论】LKB1在卵泡颗粒细胞中高表达,促进类固醇激素生成基因STAR 、CYP11A1和CYP19A1的表达和雌二醇的分泌。本研究将为LKB1调控牛颗粒细胞类固醇激素合成的功能提供直接的理论依据。
【目的】流感病毒是一种人兽共患病原,常引起大流行,给人类健康造成巨大威胁,且流感病毒易发生变异,能不断逃逸宿主细胞的免疫反应,对现有抗流感药物产生耐药性,因此寻找抵抗流感的新方法迫在眉睫。研究通过探索NMRAL1(NmrA-like family domain-containing protein 1)对流感病毒复制的影响,并揭示其发挥作用的分子机制,为抗流感药物研发提供潜在靶点。【方法】采用siRNA干扰技术在A549细胞中下调表达NMRAL1,并通过Western Blot检测siRNA干扰后NMRAL1的表达水平;在下调表达NMRAL1的细胞中,分别感染A/Anhui/2/2005 (AH05) (H5N1)和A/WSN/33 (H1N1) 两株不同亚型流感病毒,利用蚀斑试验检测感染病毒后24和48 h细胞上清中的病毒滴度。为确定NMRAL1影响流感病毒复制的具体阶段,在HEK293T细胞中瞬时转染NMRAL1-Myc-pCAGGS质粒过表达NMRAL1,通过双荧光素酶报告系统检测过表达NMRAL1对流感病毒聚合酶活性的影响;使用免疫荧光技术对流感病毒NP蛋白进行染色,通过激光共聚焦试验观察下调表达NMRAL1对感染病毒后3、4、5、6和8 h NP蛋白在被感染细胞中的定位情况的影响,判断下调表达NMRAL1是否影响流感病毒的入核和出核过程;利用Western Blot检测下调表达NMRAL1对流感病毒各病毒蛋白表达的影响和对流感病毒激活I型干扰素通路下游IFN刺激基因（ISGs）表达的影响,利用间接免疫荧光试验进一步研究NMRAL1对流感病毒复制的影响。【结果】Western Blot检测发现NMRAL1 siRNA能显著下调NMRAL1表达,在下调表达NMRAL1的A549细胞中分别感染H5N1和H1N1病毒,并通过蚀斑试验检测感染病毒后细胞上清中的病毒滴度,结果显示在下调表达NMRAL1的细胞中,感染流感病毒后24和48 h收取的细胞上清中病毒滴度显著下降,表明NMRAL1能促进不同亚型流感病毒的复制;为进一步探索NMRAL1调控流感病毒复制的具体机制,利用双荧光素酶报告系统检测流感病毒聚合酶活性,发现过表达NMRAL1对流感病毒聚合酶活性无明显影响;激光共聚焦试验结果显示下调NMRAL1表达不影响NP蛋白的入核和出核过程,同时Western Blot检测表明下调NMRAL1表达不影响各病毒蛋白的表达;但荧光定量PCR试验结果显示下调NMRAL1表达能够促进流感病毒感染诱导的IFN-β mRNA水平上升,且Western Blot检测发现下调表达NMRAL1促进I型干扰素通路下游的MxA和IFITM3抗病毒蛋白的表达,与此同时,间接免疫荧光试验结果显示下调NMRAL1表达可显著抑制流感病毒复制。【结论】在流感病毒感染过程中,NMRAL1不影响流感病毒的入侵以及转录翻译过程,而是通过抑制I型干扰素通路激活从而抑制MxA、IFITM3等抗病毒因子的表达,最终促进流感病毒复制。研究证实宿主因子NMRAL1正调控流感病毒的复制,丰富了参与流感病毒复制的宿主因子网络。
【目的】探讨南方夏季高温高湿气候条件下,横向交互送风系统对肉牛舍温热环境、肉牛生理生化指标及生产性能的影响,以期评价此肉牛防暑环境调控系统的技术经济效果。【方法】试验采用单因子完全随机设计,选择健康、体重相近（（290.05±7.60）kg）的8月龄西门塔尔公牛30头,随机区组饲养于2栋相邻且构造相同的钟楼式棚舍中,试验组所在牛舍加装横向交互送风系统,对照组所在牛舍采用自然通风。试验期为2019年6月30日至7月16日,共17 d,其中预试期为前3 d,正式期为后14 d。正式试验期内前7 d,于每日的5:00、10:00、14:00、18:00、22:00测定舍内风速、干球温度和湿球温度,计算温湿指数和体感温度,并同时测定肉牛的直肠温度和呼吸频率。在全部正式试验期间,每天记录每圈栏的投料量,并于次日上午6点对剩料进行清理和称重,计算采食量。于正式试验期内第1和14天的上午7：00—8：00,对所有试验牛进行空腹称重,记录始末体重,用于计算平均日增重和料重比等生产性能指标并进行经济效益评估;同时采集血液及粪便样本,用于测定血清中的无机离子、生化指标、激素水平及粪便中的皮质醇水平。【结果】（1）试验组的横向交互式送风系统处理可显著提高舍内风速（P < 0.01）,从而极显著的降低试验组肉牛的体感温度、肉牛在10：00、14：00、18：00、22：00的直肠温度以及肉牛在10：00、14：00、18：00的呼吸频率（P < 0.01）;与对照组肉牛相比,试验组肉牛直肠温度和呼吸频率随环境温度升高的增幅分别减少45%和42%;试验组与对照组的舍内干球温度、相对湿度及温湿指数差异不显著（P > 0.05）。（2）试验结束时,试验组肉牛血清中钙离子含量显著低于对照组（P < 0.05）,钾离子、钠离子、镁离子及氯离子含量均差异不显著（P > 0.05）;血清生化指标结果显示,试验组肉牛血清中的热应激蛋白70、总蛋白、甘油三酯、葡萄糖含量均显著高于对照组（P < 0.05）,血清白蛋白、球蛋白及总胆固醇含量差异不显著（P > 0.05）;激素水平测定结果显示,试验组肉牛的粪便及血清中皮质醇水平均显著低于对照组（P < 0.05）,三碘甲状腺原氨酸和甲状腺素在试验组和对照组间差异均不显著（P > 0.05）。（3）生产性能测定显示,试验组与对照组肉牛的初始体重及结束体重均差异不显著（P > 0.05）,但试验组肉牛的平均日增重（P < 0.01）及平均干物质采食量（P < 0.05）显著高于对照组,料重比显著低于对照组（P < 0.05）,利润可提高10.68%。【结论】横向交互送风可以显著增加舍内空气流速,降低体感温度,改善西门塔尔牛代谢,提高生产性能,增加高温高湿环境下肉牛生产的经济效益。
【目的】随着食品业与加工业的不断发展,产生了诸如西瓜皮,蚕豆荚以及啤酒糟等大量的农副产物,造成环境的污染。为提高农副产物和小麦秸秆的饲料化程度,减小环境压力,通过探究添加剂对农副产物（西瓜皮、蚕豆荚和啤酒糟）与小麦秸秆混合青贮发酵品质的影响,为提高农副产品利用率和青贮品质研究提供借鉴。【方法】以混合农副产物（西瓜皮﹕蚕豆荚﹕啤酒糟=1﹕3﹕4）和小麦秸秆为原材料,按鲜重比100%﹕0（MW）、25%﹕75%(X25)、50%﹕50%（X50）和75%﹕25%（X75）进行混合青贮,并对各混合青贮进行添加剂处理：添加1×106 cfu•g-1布氏乳杆菌（B）,0.2% FW纤维素酶（C）和1×106 cfu•g-1鼠李糖乳杆菌（R）,以无添加剂（CON）为对照,将不同处理的200g新鲜材料装入容积为250 mL的聚乙烯塑料瓶中。在室温下青贮60 d后,开窖分析发酵品质和营养成分。不同处理的青贮饲料与原料通过两层纱布和定性滤纸过滤,浸提液用于pH测定;将原材料和青贮饲料烘干至恒重后测定干物质含量（DM）;蛋白质（CP）采用凯氏定氮法进行测定;采用范氏纤维测定法测定中性洗涤纤维（NDF）和酸性洗涤纤维（ADF）;采用蒽酮-硫酸比色法测定水溶性碳水化合物含量（WSC）;培养基培养微生物后计数;利用高效液相色谱仪分析有机酸;氨态氮含量（NH3-N）采用苯酚-次氯酸钠比色法测定。【结果】与MW相比,X25中NH3-N含量显著降低（P < 0.05）;X50中pH和NH3-N含量显著下降（P<0.05）;X75中pH和NH3-N含量显著降低,乳酸与乙酸比（LA/AA）显著升高（P < 0.05）;此外,相比于MW,X25、X50和X75显著降低丁酸含量（P<0.05）。在MW中,与对照组相比,添加C显著降低pH和NH3-N含量（P < 0.05）,显著增加乳酸（LA）含量和LA/AA（P<0.05）。在X25中,与对照组相比,添加C显著降低pH（P<0.05),提高LA含量（P<0.05）;添加R显著降低NH3-N含量（P<0.05）。在X50中,与对照组相比,添加C显著降低pH和NH3-N含量（P < 0.05),添加B显著降低NH3-N含量（P<0.05)。在X75中,与对照组相比,添加C能够显著降低pH和NH3-N含量（P<0.05）。DM、NDF和ADF含量随小麦秸秆混合比例的增加而显著增加（P<0.05）;相比之下,CP随小麦秸秆混合比例的增加而显著降低（P<0.05）。与MW相比,X25、X50和X75显著提高了 WSC含量（P<0.05）。在X25中,与对照组相比,添加C显著降低了NDF和ADF含量（P<0.05）;在X50中,相比于对照组,添加B和C显著降低NDF含量（P<0.05）;在X75中,相比于对照组,添加B、C和R显著降低NDF和ADF含量（P<0.05）。【结论】混合农副产物（西瓜皮﹕蚕豆荚﹕啤酒糟=1﹕3﹕4）单独青贮发酵品质较差,农副产物和小麦秸秆混合青贮能够改善发酵品质,小麦秸秆和农副产物（西瓜皮﹕蚕豆荚﹕啤酒糟=1﹕3﹕4）比例为50%﹕50%和75%﹕25%时为最佳混合比例;从营养品质来看,小麦秸秆和农副产物（西瓜皮﹕蚕豆荚﹕啤酒糟=1﹕3﹕4）比例为25%﹕75%和50%﹕50%时为最佳混合比例;综合考虑发酵品质和营养价值,小麦秸秆和农副产物（西瓜皮﹕蚕豆荚﹕啤酒糟=1﹕3﹕4）最适宜的混合比为50%﹕50%,添加C能够进一步提高发酵品质,改善营养成分。
【目的】 蛋氨酸羟基异丙酯（HMBi）作为饲料添加剂广泛用于补充反刍动物日粮中缺乏的蛋氨酸（Met）,尽管HMBi拥有过瘤胃特性,但仍有部分在瘤胃中降解。研究拟探究HMBi对犊牛瘤胃发酵和微生物区系的影响。【方法】 选取36头体重在（101±10）kg的84日龄断奶后荷斯坦母犊牛并随机分为两个处理组,分别为对照组（PC,0.40%Met）和蛋氨酸扣除组（PCMet,0.28%Met）,通过减少PCMet组日粮中HMBi的添加使Met含量较PC组少30%。试验期97 d,其中预饲期7 d,正式试验期90 d。于试验0、90 d测定犊牛体重,正试期每天记录采食量,在试验90 d收集血清样品和瘤胃液样品用于发酵参数和微生物区系的测定。【结果】 （1）与PC组相比,PCMet组犊牛生长性能无显著差异（P>0.05）,血清Met含量有降低的趋势（0.05<P<0.10）;（2）PCMet组瘤胃乙酸摩尔百分比和微生物蛋白浓度与PC组相比显著降低（P<0.05）,但两组间氨态氮和总挥发性脂肪酸浓度无显著差异（P>0.05）;（3）与PC组相比,PCMet组微生物菌群的Shannon指数显著降低（P<0.05）,PCoA和PREANOVA分析显示两组间显著分离（P<0.05）。PCMet组的后壁菌门（Firmicutes）相对丰度显著降低（P<0.05）,而拟杆菌门（Bacteroidetes）相对丰度显著升高（P<0.05）。属水平上,PCMet组莱克氏菌属（Olsenella）、瘤胃球菌属（[Ruminococcus] gauvreauii group）、聚乙酸菌属（Acetitomaculum）、真杆菌属（[Eubacterium] nodatum group）和粪球菌属（Coprococcus 1）的相对丰度显著降低。相关性分析揭示聚乙酸菌属和真杆菌属与乙酸摩尔百分比之间呈正相关关系,瘤胃球菌属与微生物蛋白浓度间呈正相关关系（P<0.05,r>0.7）。【结论】 研究说明扣除日粮中HMBi后犊牛瘤胃微生物多样性降低,微生物蛋白合成减少,其中,产乙酸菌属对HMBi扣除敏感,降低了乙酸的产生。总之,HMBi尽管作为过瘤胃产品,瘤胃中被降解部分仍对瘤胃发酵有调控作用。
【目的】探究大豆蛋白水解物（soy protein hydrolysate,SPH）对小鼠食欲的影响及其机制,以期从营养角度为猪采食调控技术的研究提供新思路。【方法】利用胃蛋白酶水解大豆蛋白产生SPH。首先探究灌胃不同浓度SPH对小鼠短期采食量及十二指肠肽钙敏感受体（Calcium sensing receptor,CaSR）、G蛋白偶联受体93（G protein-coupled receptor 93,GPR93）和肽转运受体（Oligopeptide transporter 1,PepT1）基因表达的影响;在此基础上,通过腹腔分别注射CaSR抑制剂NPS2143和外周CCK-1受体（Cholecystokinin-1 receptor,CCK-1R）抑制剂Devazepide,探究SPH是否通过CaSR-CCK- CCK-1R-下丘脑途径抑制机体采食。【结果】 灌胃1.5g·kg-1 SPH显著降低小鼠0—1 h采食量（P<0.05）、显著提高十二指肠CaSR的表达（P<0.05）;与SPH组相比,SPH+NPS2143组小鼠0—1 h采食量升高,血液CCK水平降低,且均与对照组无差异（0.05<P<0.5）。同时,SPH显著降低小鼠0-1 h胃排空速率,显著提高下丘脑厌食神经因子POMC的基因表达（P<0.05）,而SPH+Devazepide组这种作用消失。但灌胃SPH对小肠传输速率和下丘脑促食相关因子NPY（Neuropeptide Y）和AgRP（Agoutirelated peptide）的基因表达均无影响。【结论】十二指肠CaSR介导SPH促进CCK分泌,并通过外周CCK-1R延缓胃排空速率、提高下丘脑厌食神经因子POMC（Pro-opiomelanocortin）的基因表达来抑制食欲。
【目的】流感病毒的致病性是由多个基因共同决定的,笔者之前的研究结果发现当两株具有相似基因特征的H1N1亚型猪流感病毒进行HA基因替换以后,病毒对小鼠的致病性发生了改变。通过确定影响病毒致病性的关键氨基酸位点,为进一步揭示流感病毒致病力差异奠定了基础。【方法】 对ZD71和SY130的HA蛋白氨基酸序列进行比对,确认氨基酸差异位点并设计定点突变引物,构建单点突变的重组病毒并测定其鸡胚半数感染量（EID50）。将拯救的亲本病毒、HA单基因替换重组病毒及单点突变重组病毒以感染复数（MOI）为0.001和0.1的病毒量分别接种于MDCK和A549细胞,测定病毒的体外复制能力;将上述各株病毒以50 μL含106EID50的剂量经滴鼻途径接种BALB/c小鼠,分别采集小鼠的脑、鼻甲、肺、脾、肾等脏器,匀浆处理后接种鸡胚分析病毒在小鼠体内各脏器的复制情况;将病毒分别以50 μL含101-106EID50的剂量经鼻腔感染BALB/c小鼠,感染后每天称量小鼠体重,当小鼠体重下降比率超过25% 时判定为死亡,统计死亡情况,测定病毒的小鼠半数致死量（MLD50）,评估各突变病毒对小鼠的致病性,与亲本病毒进行分析比较后,获知决定病毒致病性的关键氨基酸位点。【结果】ZD71和SY130病毒HA蛋白共存在4个氨基酸差异位点,分别为4、138、144和225位（H3 Numbering）。经过定点突变、病毒拯救及序列测定确认,分别获得含有单个位点突变的重组病毒。通过测定病毒在MDCK和A549细胞上的复制情况,结果发现与亲本病毒rZD71相比较,突变病毒rZD71-HA/G225E在感染MDCK细胞的各检测时间点、及感染A549细胞24—48 h后,复制滴度均显著提高;与rSY130相比较,突变病毒rSY130-HA/E225G在感染MDCK细胞12—36 h后、及感染A549细胞36—72 h后,复制滴度均显著降低。而4、138、144位点的突变对病毒的复制影响较小。进一步的小鼠感染试验发现HA 225位氨基酸的改变显著影响了病毒对小鼠的致病性,与亲本病毒rZD71相比,225位氨基酸由G突变为E后,病毒rZD71-HA/G225E的MLD50由4.32 log10EID50降低至3.0 log10EID50;病毒不仅在小鼠鼻甲和肺脏内检测到,而且在脾脏和肾脏中也均有一定水平的复制。【结论】 HA蛋白225位氨基酸对两株H1N1 SIV对小鼠的致病性具有重要决定作用,提示在后续开展的病原学监测中要密切关注该位点氨基酸的变异情况,为更好地防控动物流感乃至人流感的大流行提供科学依据。
【目的】探究荷斯坦牛泌乳早期（6—35 d）体细胞数（SCCel）的群体特征及其与不同泌乳阶段体细胞数（SCC）及产奶量（MY）之间的关系,并对荷斯坦牛泌乳早期体细胞评分（SCSel）进行遗传参数估计,以期为我国荷斯坦牛乳房炎抗性选育提供新的思路。【方法】收集了141个牧场2008—2018年182 378头牛的2 783 046条生产性能测定记录。质控后,共得到150 864头牛的1 869 976条测定日记录。将有表型的母牛至少向上追溯三代（父母、祖父母、外祖父母）,通过追溯,获得用于遗传分析的系谱文件,共包含6 451头公牛和103 452头母牛。利用SAS软件的GLM过程分析了牧场测定规模、测定季节、测定年份、泌乳天数、胎次等因素对SCSel的影响;利用SAS软件的REG过程分别分析了SCSel与不同泌乳阶段的SCS和日产奶量之间的回归关系;基于DMU软件,使用单性状重复力动物模型、单性状动物模型和双性状动物模型分别估计了SCSel的遗传参数。【结果】荷斯坦牛产后前2周SCCel变化幅度较大,荷斯坦牛SCCel随着泌乳天数的增加呈逐渐下降的趋势;牧场规模、测定季节、胎次和泌乳天数均对SCSel有显著影响（P<0.05）,泌乳早期年均测定规模1 000头以上牧场的奶牛SCSel显著（P<0.05）低于年均测定规模1 000头以下的牧场。SCSel随胎次的增加呈先下降后上升的趋势,奶牛在夏季SCSel最高,在冬季最低。SCSel与泌乳期各测定日SCS之间均存在极显著的回归关系（P<0.01）,回归系数范围为0.06 —0.19;SCSel与泌乳期各测定日产奶量之间均存在极显著的回归关系（P<0.01）,回归系数范围为-0.46 — -0.16,泌乳早期SCSel对泌乳期乳房健康状况及生产性能均有影响。荷斯坦牛1胎、2胎、3胎及各胎次SCSel的遗传力分别为0.05 ± 0.005、0.07 ± 0.01、0.04 ± 0.01和0.03 ± 0.01,SCSel为低遗传力性状;不同胎次的SCSel性状之间存在中高遗传相关,遗传相关估计范围为0.54—0.87。【结论】荷斯坦牛泌乳早期（6 —35 d）SCC受胎次、季节等影响,泌乳早期SCC具有不同于泌乳期测定日SCC的群体特征;泌乳早期SCC处于较高水平会影响荷斯坦牛在随后整个泌乳期内的健康状态和生产性能。本研究为牧场在母牛产后利用SCCel进行差异化管理提供了理论依据,为探究荷斯坦牛在泌乳早期体细胞数差异的遗传机制奠定了基础,通过开发泌乳早期SCS新性状有助于完善我国荷斯坦牛乳房炎抗性选育。
【目的】阐明牛体表寄生草原革蜱与牛羊布鲁氏菌病的相关性,为内蒙古地区布鲁氏菌溯源调查及防控提供基础数据。【方法】通过传统形态学及分子生物学相结合的方法,对呼伦贝尔地区采集的191只蜱虫进行种型鉴定;以牛体表采集的寄生蜱为材料,应用布鲁氏菌选择性培养基从蜱体内分离可疑细菌;将可疑细菌进行分离培养,菌落的形态学观察,以及革兰氏染色和柯氏染色镜检初步鉴定可疑细菌的种属;经PCR方法扩增布鲁氏菌的Bcsp31和Omp22基因序列,并应用MEGA 7.0软件构建系统遗传进化树;运用AMOS-PCR、单项特异性血清凝集试验、染料抑菌和噬菌体裂解试验对分离的可疑菌进行分型鉴定。【结果】该地区优势蜱种被鉴定为草原革蜱,并成功在其体内分离到4株可疑细菌;经革兰氏染色镜检发现该菌属于革兰氏阴性短杆菌,柯氏染色后菌体呈红色短杆菌,并通过PCR方法成功克隆出布鲁氏菌的Bcsp31和Omp22基因序列,经过基因序列测序及BLAST比对分析,发现与布鲁氏菌参考序列相似度均在99.0%以上。应用MEGA 7.0软件成功构建遗传进化树,分离菌株序列与布鲁氏菌属的已知序列聚类在同一分支;运用AMOS-PCR和布鲁氏菌常规分型鉴定试验,确定4株分离菌均属于羊种布鲁氏菌。【结论】成功在呼伦贝尔地区牛体表采集的草原革蜱体内分离到4株羊种布鲁氏菌,表明草原革蜱作为吸血节肢动物,可能在不同宿主之间的布病传播过程中发挥重要作用。本论文为内蒙古地区布鲁氏菌溯源调查和防控提供基础数据。
【目的】通过分析成熟卵泡液外泌体（mature follicular fiuid Exosomes, mffEXs）和闭锁卵泡液外泌体（atretic follicular fiuid Exosomes, affEXs）miRNA的表达差异,探索卵泡液外泌体（EXs）miRNA在卵泡发育和闭锁过程中的调控作用。【方法】本研究通过抽提4—6 mm猪成熟发育和闭锁卵泡的卵泡液分离外泌体,进行粒径分析及Western Blot检测对EXs进行鉴定,接下来对特征性EXs携带的miRNA测序和功能富集分析,筛选关键信号通路和差异基因。最后,将mffEXs和affEXs作为添加剂进行颗粒细胞培养,利用Q-PCR检测技术分析关键基因的表达,验证两类卵泡液内EXs miRNA在卵泡发育中的调控功能。【结果】成功分离了mffEXs和affEXs,对比mffEXs测序结果,affEXs中有90个miRNA上调表达,220个miRNA下调表达,表明了卵泡液中的miRNA表达水平与调控卵泡发育有关;KEGG富集分析结果显示两类卵泡的差异信号通路主要集中在Ras、cAMP、P53和MAPK等信号通路,涉及调控卵母细胞发育、减数分裂以及颗粒细胞细胞周期等生物学功能。在闭锁卵泡中,上调表达的ssc-let-7a和ssc-miR-133a-3p分别潜在靶向调控细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK1）和胰岛素生长因子（IGF1）,抑制了G1和G2/M期的运转和类固醇激素代谢,促使颗粒细胞周期运转受阻和颗粒细胞凋亡,引起卵泡闭锁的发生;下调的ssc-miR-21-5p潜在靶向肿瘤抑癌基因（P53）,抑制细胞周期运转,促使颗粒细胞凋亡。在体外培养的颗粒细胞中分别添加mffEXs和affEXs,Q-PCR结果显示CDK1在mffEXs中显著上调表达,而P53显著下调表达,表明了测序分析结果的可靠性。这些结果均显示了affEXs中miRNA表达水平的变化促使颗粒细胞凋亡和细胞周期阻滞,引起卵泡闭锁。【结论】猪affEXs携带miRNA增加了对CDK1、IGF1和P53的表达调控,抑制颗粒细胞细胞周期运转和类固醇激素代谢等信号通路,引起颗粒细胞凋亡,导致卵泡闭锁。
【背景】基因组选择育种自2001年被MEUWISSEN等提出以来,已广泛应用在奶牛、猪等重要家畜的育种中,并显著加快了其重要经济性状的遗传改良速度。2017年,在全国畜牧总站的组织协调下,在全国生猪遗传改良计划框架内,猪全基因组选择育种平台项目正式启动。【目的】尽管基因组选择在种猪选育中取得了良好的效果,基因分型技术的不断升级也带来了成本的持续下降,但对于我国多数核心育种场依然面临着基因芯片分型个体数量不足、基因组选择实施流程不完善等问题,限制了该技术的大规模推广应用。结合我国生猪育种的实际情况,研究提出了一种“终测选择-早期选择”的“两步走”基因组选择策略。“终测选择”指在终测结束后利用一步法基因组BLUP对后备猪进行遗传评估,当群体中芯片分型个体数量达到一定规模后进行“早期选择”。【方法】以杜洛克、长白和大白三个种猪品种真实的50K基因芯片数据作为基础群体对不同品种分别进行大群模拟,共模拟4个世代,前3个世代作为基础群体,第4个世代作为测试群体,每个个体模拟两个性状（中等遗传力性状和低遗传力性状）,利用猪基因组选择育种平台基于HIBLUP软件计算不同品种、不同性状的育种值,比较一步法基因组BLUP和常规BLUP两种方法的预测准确性。根据测试群个体有无终测成绩对其基因组育种值影响大小来评估早期选择效果。【结果】分析表明在3个品种内中等遗传力性状的终测选择效果和早期选择效果均好于低遗传力性状。一步法基因组BLUP的选择准确性均优于常规BLUP的选择准确性,并且随着测试群中芯片分型个体数量的增加、群体规模的扩大,预测准确性越来越高。一步法基因组BLUP的早期选择效果好于常规BLUP,当群体中芯片数量达到2 000张时就可以开展早期选择,阉割排名后30%的个体,可以保证前1%的优秀个体不会被错误淘汰,并且随着芯片数量的增加、早期选择的效果会越来越好。【结论】基因组选择“两步走”的策略符合我国国情、容易在生猪育种中推广实施。当芯片数量较少时,可以开展“终测选择”,一定程度上提高选择的准确性,提高育种效率;当芯片数量较多时,可以开展“早期选择”,对排名靠后的猪只个体进行早期阉割,增加优秀个体的测定量,增大选择强度、加快遗传进展。“两步走”策略符合我国生猪产业基因组选择育种的实际需求,该策略的实施将有利于推动我国猪基因组选择的应用、加快种猪改良进程。
【背景】肌肉可以维持哺乳动物运动功能并调节机体代谢,它的数量和分布对肉质有重要影响,骨骼肌的生长发育及其遗传特性在很大程度上影响甚至决定家畜的产肉量和肉品质,研究骨骼肌的生长发育具有重要意义。TP53INP2对自噬的调控作用以及对前体脂肪细胞分化的调控机制已有研究,而对于牛成肌细胞分化的影响尚未报道。【目的】探究TP53INP2对秦川牛成肌细胞分化的影响,为肉牛肉用性状分子育种工作提供理论依据。【方法】利用实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR,RT-qPCR）技术检测了TP53INP2在24月龄秦川牛不同组织中的表达特性,同时分析了其在体外培养的牛骨骼肌成肌细胞不同分化时期的表达规律;合成TP53INP2基因siRNA并转染秦川牛成肌细胞,转染后12h进行诱导分化,观察成肌细胞表型变化,并利用RT-qPCR技术和Western Blot技术分别检测其在诱导分化第四天时分化标志基因和蛋白的表达情况。【结果】1.RT-qPCR结果显示,TP53INP2在成年秦川牛背最长肌组织中表达量最高,在小肠组织中表达量最低。TP53INP2在成年牛心脏、肝脏、肾脏、网胃、瘤胃中表达量较高,在其余组织中表达量较低（与背最长肌相比）。2.随着成肌细胞的分化,该基因在第0—4天表达量呈上升趋势且在第4天达到峰值,随后表达量呈下降趋势。3.在成肌细胞中干扰TP53INP2后,试验组肌管的数量和长度均显著低于对照组。4.干扰TP53INP2并提取细胞总RNA,RT-qPCR结果显示,成肌细胞分化标志基因肌细胞生成素（MYOG）和肌球重链蛋白3（MYH3）相对于对照组表达量显著降低。5.干扰TP53INP2并提取细胞总蛋白,Western Blot结果显示,试验组MYOG、MYH3、MYOD的蛋白表达量均降低且与对照组相比差异极显著。【结论】干扰TP53INP2对牛成肌细胞的分化具有抑制作用,提示该基因可能对秦川牛肌肉组织的生长发育具有重要的调控作用,可对其进行深入的功能研究以期用于肉牛的分子育种实践中。
【背景】众所周知TEA结构域转录因子4（TEA domain transcription factor 4,TEAD4)是TEAD转录因子家族中的一员,在决定啮齿类动物着床前胚胎的特性中发挥关键作用。在小鼠胚胎中发现,可以通过促进Cdx2表达来参与调控着床前胚胎滋养层细胞的谱系分化。若当小鼠胚胎中缺乏TEAD4时可导致小鼠囊胚形成失败。然而,TEAD4在猪早期胚胎发育中的作用尚不清楚。【目的】通过初步阐明TEAD4对猪早期胚胎发育的影响,以期为进一步探索转录因子对猪早期胚胎发育的分子机制奠定理论基础。【方法】利用网页版工具对猪TEAD4进行生物信息学分析,主要包括对猪TEAD4序列的分析,猪与人、小鼠之间同源性的比较,以及TEAD4在不同物种之间进化关系的比较。再通过试验检测TEAD4在猪早期胚胎发育中的作用。首先采用荧光定量PCR技术检测TEAD4在猪卵母细胞和早期胚胎中mRNA表达水平,再通过设计靶向TEAD4的siRNA,采用显微注射技术注入成熟卵母细胞中,降低卵胞质内源性的TEAD4水平,并确定TEAD4 siRNA仅作用于TEAD4,以期确定TEAD4在猪早期胚胎发育中的作用。【结果】 序列分析结果显示：猪TEAD4包含11个外显子,定位于5号染色体上,跨越长度37.188 kb,mRNA全长1 473 bp,编码区全长1 305 bp,编码434个氨基酸;与人、小鼠的同源性分析揭示TEAD4在不同物种中的保守性较高;且在猪和牛上的亲缘关系最近。荧光定量PCR检测基因表达水平结果显示：TEAD4 mRNA在猪卵母细胞和早期胚胎中均有表达,且以GV期卵母细胞为参照时比较发现,MII期卵母细胞表达量最低,并保持较低水平直至4-细胞时期,但到8-细胞时期表达量达到最高,而到桑椹胚和囊胚时期又逐渐下降。通过显微注射靶向TEAD4的siRNA发现：TEAD4 siRNA仅作用于卵母细胞中内源性的TEAD4,而对TEAD1和TEAD3不发挥作用;并与对照组和阴性对照siRNA组相比,注射TEAD4 siRNA显著降低8-细胞和桑椹胚时期TEAD4 mRNA表达量,敲低效率达到80%。当敲低TEAD4表达时观察猪孤雌激活和体外受精胚胎的发育效率表明,与对照组和阴性对照siRNA组相比,显著降低TEAD4 siRNA敲低组从8-细胞至囊胚阶段的发育效率。【结论】TEAD4在各物种间保守性高,在猪和牛上的亲缘性最近,TEDA4可参与调控猪早期胚胎的发育。
【目的】快速骨骼肌肌钙蛋白T（fast skeletal troponin T3,TNNT3）作为肌钙蛋白(troponin, Tn)家族成员,调节横纹肌收缩、参与骨骼肌的生长发育并影响家畜肉质性状。通过获得山羊TNNT3基因的可变剪切体,分析山羊TNNT3基因可变剪切的表达模式及其在肌细胞分化中的作用,深入解析TNNT3基因在山羊骨骼肌生长发育过程中的作用机制。【方法】基于NCBI已公布山羊TNNT3基因（NM_001314210.1）和牛TNNT3基因（XM_010821200）mRNA序列,使用软件Primer Premier 6.0设计引物,以简州大耳羊胚胎期和出生后7个阶段骨骼肌为试验材料,克隆测序获得山羊TNNT3基因的CDS区可变剪切体,利用软件ORF Finder、EditSeq、DNAMAN、ClustalW和MEGA_X_10.1.8等对序列进行生物信息学分析;进一步设计实时荧光定量（real-time PCR,RT-qPCR）及半定量引物,研究TNNT3基因剪切体在7个不同组织（背最长肌（longissimus dorsi muscle,LD）、半膜肌（semimembranosus muscle,SM）、心、肝、脾、肺、肾）和7个发育阶段（胚胎期E75、E90、E105和出生后B3、B45、B150、B300）肌肉组织（背最长肌和半膜肌）中表达模式;此外,对转录本TNNT3_3进行体外编码能力检测确定其具有编码蛋白的能力,并在山羊骨骼肌卫星细胞（skeletal muscle satellite cells,MuSCs）中过表达,观察细胞形态变化以及检测标志基因的表达变化,研究其对山羊MuSCs分化的作用。【结果】①TNNT3（NM_001314210.1）CDS区全序列主要含有18个外显子,其中外显子16/17相互排斥,转录后单一表达。克隆发现山羊TNNT3基因 5个新转录本（TNNT3_1—5）,其外显子数分别是15、15、20、16、14。②生物信息学分析结果显示山羊TNNT3基因核苷酸序列和氨基酸序列与绵羊、牛、猪等哺乳动物具有很高的一致性,而与鱼类和爬行类动物的一致性较低,说明TNNT3基因序列在哺乳动物高度保守。③TNNT3 mRNA在背最长肌、半膜肌、心、肝、脾、肺、肾7个组织中都有表达,其中在骨骼肌中高度富集(P < 0.01),心脏及肺次之,其余组织中较低;TNNT3 mRNA在背最长肌和半膜肌中的表达始终处于一个动态变化中,胚胎期TNNT3在半膜肌的表达量高于背最长肌（P<0.05）;出生后则背最长肌中高于半膜肌（P<0.05）。④山羊TNNT3基因转录本TNNT3_3重复出现保守的外显子9—11（138bp）,体外翻译实验显示其可编码蛋白且蛋白大小与预期基本相符（37 kD）;相较于对照组,在山羊MuSCs中过表达该转录本使肌分化标志基因Myomaker、MyoG和MyH4 mRNA极显著升高(P < 0.01)。【结论】获得了山羊TNNT3基因具有完整CDS区5个新可变剪切体,TNNT3主要在肌肉组织（背最长肌和半膜肌）中高表达,在哺乳动物中高度保守且促进成肌分化。初步表明TNNT3基因在动物肌肉生长发育中具有重要的生物学功能。
【目的】胞内劳森菌（Lawsonia intracellularis,LI）是引起猪增生性肠炎（porcine proliferative enteritis, PPE）的肠道病原菌,主要表现为动物福利下降,给世界养猪业造成严重的经济损失。研究通过制备鼠抗LI SodC的单克隆抗体,建立一种针对LI的免疫过氧化物酶细胞单层试验（IPMA）抗原检测方法,检验其在临床上的应用性,从而为LI的病原诊断提供一种科学有效的手段。【方法】选取胞内劳森菌弱毒疫苗为研究对象,通过PCR扩增其sodc片段,将其克隆至原核表达载体pGex-6p-1上,成功构建出pGex-6p-1-sodc重组质粒,诱导表达重组蛋白SodC。Western Blot分析重组蛋白的反应原性,一抗使用鼠抗GST标签的抗体。以该重组蛋白为免疫原,免疫4—6周龄BALB/c小鼠,利用常规细胞融合技术、有限稀释法和间接ELISA技术筛选阳性杂交瘤细胞,并制备腹水。通过间接免疫荧光（IFA）鉴定该单抗的特异性。以该单抗为一抗,摸索并建立了LI IPMA抗原检测方法,并评价该方法的特异性、敏感性和重复性。用优化后的IPMA方法对来自江苏周边地区猪场回肠组织样品进行检测,评价该方法的临床价值。【结果】纯化后SodC蛋白浓度较高,与鼠抗GST标签的抗体发生特异性结合,表明该蛋白反应原性较好。经3次亚克隆后最终共筛选获得2株阳性杂交瘤细胞,分别命名为1D6和1F7。单抗亚型鉴定结果显示：1D6亚型为IgA,1F7亚型为IgG3;ELISA检测1D6单抗效价为1﹕1 024 000;1F7单抗效价为1﹕1 024 000;间接免疫荧光（IFA）结果表明2株单抗均与LI菌株发生特异性反应,与猪霍乱沙门氏菌（Salmonella Cholerasuis,S. Cholerasuis）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）和猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）等猪常见病原无交叉反应。优化后IPMA反应条件为：一抗稀释倍数为1﹕800,作用45min;二抗稀释倍数为1﹕2 500,作用1h,此时IPMA检测效果最佳。用该方法检测S. Cholerasuis、PEDV、TGEV、伪狂犬病毒（PRV）、猪圆环病毒2（PCV2）均为阴性;最低检测限为103个/mL,说明该方法特异性强、敏感性高。临床样品检测结果显示146份病料中共检测出92份阳性样品,3个不同猪场的阳性样品检出率分别为65.6%、68.2%和53.7%,总体阳性率为63.0%。普通PCR方法检测出82份阳性样品,两种方法的阳性符合率为94.6%。【结论】成功制备了鼠抗LI SodC蛋白的单克隆抗体,建立了针对LI抗原的IPMA检测方法,并对临床样品进行了检测。该方法具有良好的特异性和敏感性,并具有一定的临床价值,为实验室LI的分离鉴定、在感染细胞中的定位以及流行病学调查和相关检疫提供一种有效的技术手段。
【目的】探究全株构树青贮（whole Broussonetia papyrifera silage, WBPS）对务川黑牛的饲用价值,以期为构树饲料化的合理利用提供参考依据。【方法】试验采用完全随机试验设计,将50头体重（（108.06±14.51）kg）和年龄（约9月龄）相近的务川黑牛随机分为5个处理组（A组、B组、C组、D组和E组）,每组10头牛。按处理组分别饲喂精粗比一致,含不同比例WBPS的日粮（0%、17%、41%、66%和83%）,试验期288 d。在试验开始、试验中期（第175天,第220天）和试验末期（第288天）分别测定各组采食量（DMI）、日增重（ADG）和料重比（DMI/ADG）,试验末期测定体尺、瘤胃发酵参数和胴体品质。【结果】C组和D组的ADG分别在试验第0—175、175—220、220—288天和全期均高于其他各组（P<0.05）,而DMI/ADG值较低（P<0.05）,此外,日粮因子影响了各组参试牛的ADG时间梯度变化规律：随试验期延长,A组和B组的ADG呈现显著下降趋势,而C组、D组和E组的ADG呈先上升后下降的趋势;D组的体高和体斜长增量较高,其次为C组（P<0.05）;A组和B组的瘤胃乙酸、丙酸和总挥发性脂肪酸浓度高于其余各组,但瘤胃微生物蛋白产量以D组最高,是A组的5.27倍;试验因子对务川黑牛屠宰率和净肉率无显著影响（P>0.05）,但增加日粮中WBPS的比例降低了胴体脂肪率和肌肉剪切力（P<0.05）;对各处理组务川黑牛肌肉氨基酸组成和含量无显著差异（P>0.05）,但降低了饱和脂肪酸含量,提高了多不饱和脂肪酸含量（P<0.05）。【结论】WBPS替代全株玉米青贮作为务川黑牛日粮组成部分,具有提高务川黑牛日增重、降低料重比、提高瘤胃微生物蛋白产量、降低胴体脂肪率、改善肌肉脂肪酸组成的饲用价值。
【目的】探究静原鸡肌肉组织肌苷酸沉积过程中关键调控因子的调节作用,利用lncRNA-miRNA-mRNA关联分析鉴定与肌苷酸特异性沉积相关的LNC_003828、gga-miR-107-3p和MINPP1,其作为肉质研究的候选基因,为分子辅助育种提高肌肉品质提供理论基础。【方法】测定15只静原鸡胸肌和腿肌的肌苷酸含量,筛选高肌苷酸含量的胸肌和低肌苷酸含量的腿肌各3个样本提取总RNA,质量检测合格后构建cDNA文库、PCR扩增,利用Agilent 2100对文库质量进行评价,库检合格后送Illumina-Hiseq平台进行转录组测序。利用生物信息学方法筛选出静原鸡肌肉组织不同部位差异表达的MINPP1、gga-miR-107-3p和LNC_003828,进行GO注释和蛋白互作网络分析MINPP1的功能。采用qRT-PCR方法检测LNC_003828、gga-miR-107-3p和MINPP1在静原鸡胸肌和腿肌组织中的表达情况,并分析其与肌苷酸含量的相关性。【结果】测序样品间基因表达水平相关性R2>0.9,即试验样本之间基因表达可用于后续的差异基因分析。参与肌苷酸合成和代谢的糖酵解/糖异生途径中检测出3个差异表达基因MINPP1、PKM和ALDH9A1。互作分析发现lncRNA-miRNA-mRNA网络图中共有17个miRNA（9个上调,8个下调）、44个mRNA（16个上调,28个下调）和155个lncRNA（68个上调、87个下调）,核心节点gga-miR-107-3p互作的靶基因有MINPP1、靶lncRNA有LNC_003828。GO富集分析发现MINPP1基因具有磷酸酶活性、双磷酸甘油酸酯磷酸酶活性等功能;蛋白互作网络中MINPP1基因与参与糖酵解/糖异生和氨基酸生物合成通路中的PGAM1、ENO1、BPGM基因均有互作关系。qRT-PCR结果表明,静原鸡胸肌LNC_003828和gga-miR-107-3p的相对表达量低于腿肌,但差异不显著;胸肌MINPP1的相对表达量显著低于腿肌（P<0.05）。静原鸡胸肌和腿肌组织中gga-miR-107-3p的表达量与LNC_003828表达量均呈正相关,与MINPP1的表达量均呈负相关。胸肌和腿肌组织中LNC_003828、gga-miR-107-3p的表达量与肌苷酸含量均呈正相关,且差异均不显著;胸肌MINPP1表达量与肌苷酸含量呈负相关,腿肌MINPP1表达量与肌苷酸含量呈显著负相关（P<0.05）。综上所述,推测静原鸡肌肉组织中gga-miR-107-3p作为核心调节因子吸附LNC_003828,影响MINPP1基因调控肌肉肌苷酸特异性沉积,从而改善肉质。【结论】筛选出LNC_003828、gga-miR-107-3p和MINPP1为影响肌苷酸特异性沉积的候选调控因子。
【目的】检测猪红细胞类补体受体I型（Complement receptor 1-like,CR1-like）与C3b活性片段能否发生结合,以期为阐明猪红细胞发挥免疫粘附功能的分子机理提供科学数据。【方法】利用前期已构建的CR1-like(3-6)、CR1-like(8-11)功能域片段的重组质粒建立酵母双杂交检测体系,运用酵母共转化的方法将诱饵质粒（重组pGBKT7-CR1-like）与捕获质粒（重组pGADT7-C3b）共同转入Y2HGold酵母细胞中,分别利用一缺平板SD/-Leu、SD/-Trp和二缺平板SD/-Leu/-Trp（DDO）严格筛选共转化成功的酵母细胞,再根据报告因子是否表达来鉴别转化子在SD/-Leu/-Trp/X-α-Gal（DDO/X）、SD/-Leu/-Trp/X-α-Gal/Aba（DDO/X/A）二缺培养板上的生长情况,并结合菌落的颜色变化现象综合判定CR1-like活性片段与补体C3b在酵母细胞中是否发生相互结合;然后运用免疫沉淀技术分离酵母细胞中CR1-like与C3b结合复合物,并对该复合物的特异性进行Western blot鉴定。【结果】试验成功将pGBKT7-CR1-like与pGADT7-C3b基因共转入Y2HGold酵母细胞。共转化的酵母克隆在SD/-Leu、SD/-Trp、DDO平板上能够正常生长,在DDO/X、DDO/X/A平板上正常生长且菌落呈现蓝色,由此表明,试验中酵母双杂交系统建立成功,并通过试验获得了阳性酵母克隆。共同转化了pGBKT7-CR1-like和pGADT7-C3b质粒的酵母菌落PCR反向鉴定结果显示,在共转化的酵母菌中含有目的基因CR1-like(3-6)和CR1-like(8-11),共转化组的质粒酶切后出现C3b基因片段,与设计大小一致,说明重组质粒成功共转化入酵母细胞中。免疫沉淀试验中应用pGBKT7载体的标签抗体c-Myc沉淀酵母细胞中的融合蛋白,以c-Myc为一抗进行Western blot检测发现,单独转化了pGBKT7-CR1-like(3-6)和pGBKT7-CR1-like(8-11)的融合蛋白在50 kD处出现特异性条带;共转化pGBKT7-CR1-like(3-6) + pGADT7-C3b和共转化pGBKT7-CR1-like(8-11) + pGADT7-C3b的酵母融合蛋白在83 kD处出现特异性条带;以HA单克隆抗体为一抗进行Western blot检测时,在pGBKT7-CR1-like(3-6)和pGBKT7-CR1-like(8-11)融合蛋白中没有出现特异性条带,只有3、4泳道中共转化的酵母融合蛋白在83 kD处出现特异性条带,表明在Y2HGold酵母细胞中存在CR1-like与C3b识别结合的复合物。使用CR1-like单克隆抗体沉淀酵母细胞中的融合蛋白,以CR1-like单克隆抗体为一抗进行Western blot检测发现,单独转化了pGBKT7-CR1-like(3-6)和pGBKT7-CR1-like(8-11)的融合蛋白在50 kD处出现特异性条带;共转化pGBKT7-CR1-like(3-6) + pGADT7-C3b和共转化pGBKT7-CR1-like(8-11) + pGADT7-C3b的酵母融合蛋白在83 kD处出现特异性条带;以C3单克隆抗体为一抗进行Western blot检测发现,在pGBKT7-CR1-like(3-6)和pGBKT7-CR1-like(8-11)融合蛋白中没有出现特异性条带,泳道3、4所示只有共转化的酵母融合蛋白在83 kD处出现特异性条带,表明在Y2HGold酵母细胞中存在具有生物活性的CR1-like与C3b识别结合的复合物。通过多个单克隆抗体杂交结果,可看出诱饵质粒的表达产物CR1-like(3-6)、CR1-like(8-11)片段与捕获质粒的表达产物C3b片段可在酵母细胞内发生结合。【结论】猪红细胞CR1-like发挥免疫粘附功能的识别配体为C3b,为猪红细胞CR1-like功能域分子结构的进一步解析提供了重要数据依据。
【背景】 内蒙古草原是我国北方重要的天然生态屏障,其中草甸草原处于森林向草原过渡地带,在我国温性草甸草原是一种非常宝贵的自然再生资源。且内蒙古草原在我国温性草甸草原所占比例最大,其中大部分是放牧场。放牧是人类影响草地生态系统最主要的方式之一,过度的放牧会导致草原群落发生逆行演替,草地的生产性能不断降低,从而限制了草地畜牧业的稳定发展。【目的】 全面准确及时地评估放牧场退化状况,为维护和促进草地可持续利用提供支持。【方法】 通过总结草地放牧场退化演替规律及驱动机制,采用层次分析、专家调查以及比较矩阵分析方法,构建了内蒙古草甸草原放牧场退化指标体系,包括地上生物量、盖度、平均高度、植物种数、枯落物量、退化指示植物比例、土壤有机碳含量、土壤容重共8个指标。基于评估综合指数模型的建立,提出对照基准指标的参数,利用定量评估的综合指数反映草甸草原放牧场退化的整体状况。同时,探讨和研究了内蒙古草甸草原放牧场退化定量评估指标体系构建及其技术方法,以呼伦贝尔谢尔塔拉控制放牧试验为基础,对该方法进行了评估验证。【结果】 研究得出内蒙古草甸草原放牧场评价指标体系的8项指标权重由大到小依次为地上生物量、盖度、平均高度、退化指示植物比例、植物种数、枯落物量、土壤有机碳含量、土壤容重增加比例。草甸草原退化分级可以分为未退化、轻度退化、中度退化、重度退化4个等级,当放牧等于零或很轻的放牧状态时草地属于未退化草地范围。当放牧为90%以上时草原属于重度退化草地范围。【结论】 基于上述研究,建议在今后的研究中进行更长时期的探讨,对基准参考值做进一步的完善和更新,对放牧场退化评估指标体系更加完善和成熟有利,可以为放牧场退化定量评估提供依据。
蜡样芽孢杆菌是一类兼性厌氧的革兰氏阳性杆菌,可以产生芽孢抵抗不良环境,并广泛存在于土壤、水、空气和多种食物中。致病性蜡样芽孢杆菌是常见的食源性条件致病菌之一,其引发的食物中毒主要是由其产生的毒素导致的。致吐毒素cereulide是致病性蜡样芽孢杆菌产生的重要毒素之一,是一种小分子亲脂性十二环肽,结构性质十分稳定。Cereulide能够引起恶心、呕吐等轻微的食物中毒症状,也可导致如肝性脑病、急性肝脏衰竭等严重致死的疾病。当前对于cereulide的毒性作用机制研究局限于其刺激传入迷走神经引起呕吐症状,以及作为钾离子载体,诱导线粒体膜电位丧失,并最终导致细胞死亡,而对于其导致的严重肝脏和脑部病变的毒性作用机制研究仍十分不足。Cereulide是由cereulide合成酶基因簇(ces)编码,非核糖体肽合成酶(nonribosomal peptide-synthetase, NRPS)系统控制合成的。Cereulide由两个羟基酸和两个氨基酸残基[-D-HIC-D-Ala-L-HIV-L-Val-]经3次迭代组成三聚体缩酚酞,其结构特殊并有很强的代表性,但因NRPS合成系统的灵活性会产生许多变体,因此cereulide的毒性与其生物合成过程息息相关。文章在现有文献报道和研究数据的基础上,总结并提出了cereulide的生物合成机理：首先,cereulide合成基因簇的CesA和CesB结构域分别识别D-α-酮羧酸、L-丙氨酸、L-α-酮异戊酸和L-缬氨酸,通过共价结合形成cereulide的主要合成单元二肽;其次,依照上述过程重复合成四肽;再通过重复反应合成第二个四肽,两个四肽通过酯化形成八肽;再次重复上述反应,形成三元络合的产物肽;最后,由于ces-NRPS的硫酯酶结构域活性中心表面结构阻止外部水分子进入,并诱导内部亲核攻击反应,最终释放出环状cereulide。目前,由产cereulide的蜡样芽孢杆菌引起的食物中毒风险被低估。并且,本团队前期研究发现部分芽孢杆菌微生态制剂中混有产cereulide的蜡样芽孢杆菌菌株。因此,产cereulide蜡样芽孢杆菌的存在对食品安全和公共健康均构成了潜在风险。文章综述了cereulide的毒性作用及机制,为进一步研发cereulide防控措施提供科学依据;总结并提出了cereulide的生物合成机理,强调了催化酮酸形成酯的酮还原酶域(KR),及形成重复单元和环肽的硫酯酶域(TE)在其合成中的重要作用,为阐明类似结构的非核糖体肽合成提供新的思路。
【背景】奶牛乳腺炎是一种常见、多发的奶牛疾病,不仅危害奶牛健康,同时也造成重大经济损失。传统治疗奶牛乳腺炎的药物主要是抗生素,极易造成抗生素耐药与滥用。开发替代抗生素的方法用于奶牛乳腺炎的防治具有现实意义。蜂胶是西方蜜蜂采集植物树脂,混合自身上颚腺、蜡腺的分泌物形成的具有良好抗炎、抗菌活性的天然产物,对防治奶牛乳腺炎具有潜在开发利用价值。尽管近年来国内外有一些有关蜂胶防治乳腺炎方面的报道,但蜂胶如何影响乳血屏障功能,目前国内外尚无相关研究报道。【目的】利用细菌脂多糖（lipopolysaccharides, LPS）诱导的小鼠急性乳腺炎模型,评估中国蜂胶乙醇提取物对小鼠急性乳腺炎的保护作用及其对乳腺细胞紧密连接蛋白表达的影响,为后续利用蜂胶防治奶牛乳腺炎的深入研究奠定理论基础。【方法】采用超高效液相色谱串联三重四级杆质谱（UHPLC-QqQ-MS/MS）对中国蜂胶乙醇提取物中主要的多酚类化合物进行种类和含量测定。试验分为空白对照组、LPS模型组、中国蜂胶提取物试验组以及地塞米松阳性对照组。ICR雌性小鼠连续灌胃中国蜂胶提取物或阳性对照药物7d后,模型组、试验组和阳性对照组经第四、五对乳头管注射1 mg·kg-1体重 LPS,建立小鼠急性乳腺炎模型,24 h后处死,收集乳腺组织样本。以苏木精-伊红（H.E）染色法、天狼星红染色法评估小鼠乳腺组织病理变化;利用酶联免疫吸附法（ELISA）测定炎症因子释放量;利用荧光定量PCR测定小鼠乳腺组织中紧密连接蛋白（Occludin、Cluadin-1、ZO-1） mRNA的表达情况;最后利用免疫组化技术研究小鼠乳腺紧密连接蛋白（Occludin和ZO-1）表达和分布情况,利用以上指标综合评判中国蜂胶乙醇提取物的抗乳腺炎活性及其对乳腺紧密连接蛋白的影响。【结果】基于UHPLC-QqQ-MS/MS,建立了中国蜂胶乙醇提取物中主要的17种多酚类化合物的精确定量方法,检测结果表明含量最高的5种化合物及其含量分别为：高良姜素（12.88±0.57 μg·mg-1）、短叶松素3-乙酸酯（12.93±0.59 μg·mg-1）、松属素（8.56±0.27 μg·mg-1）和短叶松素（8.52±0.25 μg·mg-1）。动物试验结果表明,灌胃中国蜂胶提取物能够显著缓解LPS注射导致的乳腺组织中炎性细胞浸润、缓解乳腺腺泡结构损伤;同LPS组相比,中国蜂胶提取物灌胃处理可有效抑制LPS导致的小鼠乳腺组织中炎症因子（IL-1β,IL-6和IL-10）的释放,并可提高小鼠乳腺中紧密连接蛋白的mRNA表达,缓解LPS注射所导致的乳腺上皮细胞紧密连接的破坏。【结论】中国蜂胶提取物对脂多糖诱导小鼠乳腺炎具有良好的预防效果,并可有效促进乳腺紧密连接蛋白的表达,维持乳腺中紧密连接结构完整性,保护血乳屏障,但蜂胶对紧密连接影响调控的分子机理还需进一步深入研究。
【目的】氟氯苯氰菊酯（flumethrin）属于第二代拟除虫菊酯类杀虫、杀螨剂,应用于蜂群除螨。由于杀螨剂具有一定的毒性,在杀死螨虫的同时也会威胁到蜜蜂的健康。本研究采用液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）检测氟氯苯氰菊酯处理后的西方蜜蜂工蜂幼虫代谢物,筛选差异代谢物,并分析涉及到的代谢通路,研究氟氯苯氰菊酯对蜜蜂的毒理作用,为蜜蜂饲养提供参考。【方法】控制蜂王在空的工蜂巢脾上产卵12 h,并将产卵区域分为4组,从第5天开始分别给各组小幼虫饲喂含氟氯苯氰菊酯的糖水（0、0.5、5、50 mg·kg-1）,剂量从第5天至第8天逐日递增（1.5、2、2.5、3 μL）,第9天采集幼虫的淋巴液。运用代谢组学中的LC-MS技术分析蜜蜂幼虫的代谢物,结合主成分分析（PCA）、偏最小二乘法-判别分析（PLS-DA）,筛选差异显著的代谢物,并对氟氯苯氰菊酯处理组和对照组间共同差异代谢物进行代谢通路分析。【结果】0.5 mg·kg-1组与对照组相比,共有差异代谢物190种,共鉴定87种;5 mg·kg-1组与对照组相比,共有差异代谢物275种,共鉴定97种;50 mg·kg-1组与对照组相比,共有差异代谢物275种,共鉴定131种。从鉴定的差异代谢物中筛选到29种氟氯苯氰菊酯处理组共同差异代谢物,其中16种代谢物上调,12种代谢物下调,1种代谢物在0.5和50 mg·kg-1组中下调,在5 mg·kg-1组中上调。这些差异代谢物包括核糖、嘌呤及其衍生物、脂肪酸及其偶联物等。经代谢通路富集分析,发现差异显著（P＜0.05）的代谢通路包括氨基糖和核苷酸糖代谢、药物代谢-其他酶类、α-亚麻酸代谢等途径。【结论】LC-MS技术能够有效地分析氟氯苯氰菊酯影响下蜜蜂幼虫代谢物的变化,氟氯苯氰菊酯会引起蜜蜂幼虫体内尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺、硫唑嘌呤、愈伤酸、9-羟基壬酸、氢过氧化亚油酸等物质含量异常,这些差异代谢物的变化证实了氟氯苯氰菊酯引起蜜蜂体内各种物质代谢紊乱,对这些代谢过程分析可进一步阐释蜜蜂代谢有毒化合物的机制,并为杀螨剂及其他有毒化合物对蜜蜂的胁迫提供理论依据。
畜牧业是我国农业的重要组成部分,目前我国畜牧业向着规模化、集约化发展,同时也增加了畜禽疾病诊断的难度。为提高畜禽养殖中的动物福利水平,并降低畜牧养殖中因动物疫病与健康异常带来的经济损失与公共卫生安全风险,近年出现了一批通过数字化、智能化手段实现畜禽疫病诊疗的自动化方法,如机器视觉分析、动物音频分析、红外温度感知、深度学习分类等,这些方法可以有效提高对患病或异常畜禽动物的诊断效率、缩短诊断周期、降低畜牧养殖中人工巡检劳动力。畜禽疫病自动诊疗方法不同于常规的基于病理学知识的诊断方法,其主要通过各类传感器自动获取畜禽在养殖过程中的图像、声音、体温、心率、排泄物等各类特征信息,而后通过梅尔倒谱系数、Logistics回归分析等数学模型和支持向量机、深度学习等智能算法对采集的信息进行综合分析与处理,并对动物的健康状态做出评价与预测。文章分别从畜禽形态诊断技术、行为诊断技术、声音诊断技术、体温诊断技术、其他生理参数诊断技术等几个方面总结阐述了目前动物疫病智能诊断技术研究的进展和一些基础的方法原理,这些方法基于动物外型与体尺、行为与动作、鸣叫与声音、体温、排泄物、呼吸与心率等数字化特征,通过数学模型对传感器采集到的特征进行实时分析与分归类,基本实现了对理想环境下动物健康状态的评价。目前的畜禽动物疾病自动诊疗技术研究成果丰富,但相关诊断方法大多是在理想环境下进行,而实际的生产养殖环境中干扰因素很大,目前的诊断方法大多无法很好地排除干扰并精确提取出所需特征信息;并且目前的数字化禽畜疾病诊断方法多是基于禽畜的一种特征信息进行分析诊断,这使得诊断系统的诊断准确度受到影响,诊断结果说服力不足。同时目前的大多数数字化禽畜疾病诊断方法还存在诊断泛化能力差、抗干扰能力差等问题,这些问题制约了其推广与应用。未来畜禽疾病自动诊断的研究重点是提高其传感算法的精度和数学模型的适用性与鲁棒性,并进一步发展基于多种特征耦合与数据融合的智能化畜禽疾病诊疗专家系统,争取实现实时、高效、智能、精准的畜禽健康诊断。
【目的】在蜜蜂中,甲基棕榈酸酯（MP）、甲基油酸酯（MO）、甲基亚油酸酯（ML）和甲基亚麻酸酯（MLN）是重要的封盖信息素成分,它们触发成年工蜂对幼虫的封盖行为。本研究旨在比较封盖信息素化学成分在不同封盖时期的东方蜜蜂（Apis cernana）工蜂与雄蜂幼虫体内的含量,并分析其在幼虫体内的生物合成通路,进一步探索蜜蜂幼虫与成年工蜂之间的信息素交流机制。【方法】以中华蜜蜂（Apis cernana cernana）为实验材料,分别取未封盖、正在封盖和已封盖的工蜂与雄蜂幼虫,利用GC/MS分析技术,比较4种封盖信息素成分在不同封盖时期的工蜂与雄蜂幼虫体内的含量;同时利用RNA-seq技术对不同封盖时期的工蜂与雄蜂幼虫进行转录组测序,分析其基因表达差异,并根据差异表达基因KEGG富集分析推测封盖信息素的生物合成通路。【结果】在工蜂幼虫中,4种封盖信息素成分在正在封盖和已封盖幼虫体内的含量均显著高于未封盖幼虫,其中MP和MO的含量均随幼虫日龄增长而显著增加,而ML和MLN的含量在正在封盖和已封盖幼虫体内差异不显著;在雄蜂幼虫中,4种信息素成分含量均随日龄增长而增加,且已封盖幼虫的信息素含量显著高于未封盖和正在封盖的幼虫。对工蜂与雄蜂3个封盖时期幼虫的基因表达量进行组间比较分析,分别从3个比较组中获得4 299和3 926个差异表达基因,并且在差异表达基因KEGG注释分析中分别获得152和130个KEGG通路。根据差异表达基因KEGG富集结果,推测出东方蜜蜂工蜂与雄蜂幼虫可能利用乙酰辅酶A合成MP、MO、ML和MLN的生物合成通路以及11个调控候选基因,并发现该生物合成通路与西方蜜蜂相同。【结论】东方蜜蜂工蜂幼虫与雄蜂幼虫在被封蜡盖的关键阶段增加了MP、MO、ML和MLN的释放量,进一步验证了它们是与蜜蜂封盖行为相关的信息素,并且推测这些信息素可能是在相关基因的调控下由乙酰辅酶A从头合成,而东方蜜蜂幼虫与西方蜜蜂幼虫可能利用相同的生物合成通路进行信息素的生物合成。
【目的】研究粒细胞集落刺激因子（granule cell stimulating factor,GCSF）在羊成纤维细胞体外培养中对其增殖、周期和凋亡的影响,为今后基于羊GCSF为靶标诱导全能干细胞进行分子遗传育种研究提供理论依据。【方法】将羊GCSF真核表达质粒pRTL1-GCSF和对照载体质粒pRTL1分别转染到1×105个细胞/mL的羊成纤维细胞中,培养48 h后,利用Trizol法分别提取总RNA并反转录为cDNA,通过实时荧光定量PCR检测羊GCSF在羊成纤维细胞中的瞬时表达水平。通过GCSF依赖型细胞系NFS-60,利用细胞活力检测试剂alamarBlue测定转染48 h后羊成纤维细胞培养上清中分泌表达的GCSF的生物学活性。通过HEK 293F悬浮培养细胞系真核表达分泌型羊GCSF蛋白后,用Ni-NTA凝胶对细胞表达至细胞培养基中的GCSF蛋白进行纯化,并SDS-PAGE检测。加入纯化的30 ng·mL-1 GCSF蛋白后在24和48 h时,通过alamarBlue测定羊成纤维细胞的增殖状态,利用流式细胞术检测羊成纤维细胞的细胞周期和凋亡变化。【结果】羊GCSF真核表达质粒转染羊成纤维细胞48 h,检测发现在羊成纤维细胞中GCSF表达量得到显著提高。在羊成纤维细胞中,转染了pRTL1-GCSF质粒的羊GCSF表达量是转染了pRTL1空载对照组的（50 615.92±4 738.83）倍（P<0.01）;羊成纤维细胞瞬时分泌表达的含有GCSF蛋白的培养基上清加入到GCSF依赖型细胞系NFS-60后,试验组和阳性对照组中的NFS-60的荧光强度与阴性对照组和空白对照组相比显著升高（P<0.01）,试验组中的NFS-60的荧光强度与阳性对照组相比均差异不显著（P>0.05）,结果显示羊GCSF能显著刺激NFS-60细胞的增殖,表明在羊成纤维细胞中表达的羊GCSF具有生物学活性。用HEK 293F悬浮培养细胞系真核表达分泌型羊GCSF蛋白后,纯化得到羊GCSF蛋白。在羊成纤维细胞中添加30 ng·mL-1的羊GCSF后,体外培养24和48 h,GCSF试验组与培养基稀释液对照组相比,细胞活力变化差异不显著,而细胞周期的分布出现显著改变。24 h时,与对照组相比试验组的G1期细胞比例由(55.29±1.68)%增加到(69.37±0.24)%,差异极显著（P<0.01）;S期细胞比例由(15.99±0.38)%变为(15.39±0.60)%,差异不显著（P>0.05）;G2/M期细胞显著增多（P<0.05）,比例由(22.88±1.00)%增大到(26.76±0.82)%。表明在羊成纤维细胞中加入羊GCSF的24 h后,处于分裂状态和间期的细胞显著增多。48 h时,与对照组相比试验组G1期细胞比例由(65.96±0.37)%减少为(45.69±0.26)%,差异极显著（P<0.01）;S期细胞比例由(13.45±1.33)%增加为(37.87±2.43)%,差异极显著（P<0.01）;G2/M期细胞比例由(16.42±1.29)%变为(21.80±1.86)%,差异不显著（P>0.05）。表明加入GCSF的羊成纤维细胞在48 h时,处于间期的细胞显著减少,同时DNA复制状态的细胞显著增多。试验组凋亡率和对照组相比,培养24 h时对照组（Ctr）和试验组（GCSF）的凋亡率分别是(7.51±0.38)%和(9.16±0.46)%。48 h时对照组和试验组的凋亡率分别是(5.73±0.29)%和(5.39±0.27)%。72 h时对照组（Ctr）和试验组（GCSF）的凋亡率分别是(8.88±0.45)%和(5.41±0.27)%,24 h和72 h凋亡率差异极显著（P<0.01）,48 h检测时凋亡率差异不显著（P>0.05）,表明在GCSF添加的24 h内促进了细胞凋亡,随着时间的延长,细胞的凋亡受到抑制。【结论】羊成纤维细胞中可以瞬时过量表达羊GCSF,并具有生物学活性。GCSF不影响羊成纤维细胞的增殖,但可调控其周期,影响细胞凋亡。该结果为今后通过羊成纤维细胞介导GCSF培育具有高免疫力、高抗病性的羊进行分子遗传育种奠定了基础。
【目的】IGF1-PI3K-Akt信号通路是调控生长发育的关键通路,选择慢速型的广西麻鸡和中速型的花山麻鸡作为研究对象,探究IGF1-PI3K-AKT信号通路相关基因胰岛素样生长因子1( Insulin-like growth factors, IGF1)、胰岛素样生长因子1受体( Insulin- like growth factor receptor, IGF1R)和胰岛素受体底物1 (Insulin receptor substrate1, IRS1)在骨骼肌和肝脏中的发育性表达规律,为阐明黄羽肉鸡生长发育调控机理提供参考。【方法】采用SPSS20.0比较广西麻鸡和花山麻鸡在胚胎期至出生后早期的生长发育差异,采用实时荧光定量PCR方法检测上述3个基因在两个品种鸡胚胎期（9、12、16胚龄）和出生后（0、7、21、35、49和63日龄）胸肌、腿肌和肝脏中的表达差异,并将其与体重和组织重进行相关性分析。【结果】鸡生长发育早期体重、骨骼肌重和肝脏重变化呈现显著的品种和时间特异性,经过选育的花山麻鸡体重和组织重的增长在胚胎发育后期已经远远超过广西麻鸡。IGF1、IGF1R和IRS1基因表达存在显著的品种、组织和发育时段特异性,总体上,在胚胎期肌肉中的表达量高于肝脏组织,出生后则为肝脏中的表达量高于肌肉组织,广西麻鸡肌肉中的表达量高于花山麻鸡,而花山麻鸡肝脏中的表达量要高于广西麻鸡。IGF1基因在两个品种胸腿肌中均在9胚龄即可检测到表达,腿肌中表达量均是9胚龄时最高,除与12胚龄差异不显著外,与其他各阶段差异显著,表达量最低点出现在出雏0日龄时;胸肌中则是12胚龄时表达量最高,63日龄时最低;肝脏中则出现品种差异,广西麻鸡胚胎期未检测到表达,从出雏0日龄开始表达,表达高峰出现在21日龄时,而在花山麻鸡中虽然胚胎期检测到表达但表达量极低,49日龄时达到表达高峰。两品种鸡肌肉和肝脏各个阶段均检测到IGF1R mRNA的表达,在胸肌和腿肌中的表达量均表现为9胚龄最高,广西麻鸡9胚龄与其他各阶段差异显著,花山麻鸡9胚龄除与12胚龄差异不显著外,与其他各阶段均差异显著;肝脏中,广西麻鸡表达高峰出现在21日龄,且与9、12、16胚龄和0日龄差异显著,花山麻鸡则是63日龄时最高,与其他各阶段差异显著。两品种鸡肌肉和肝脏各个阶段均能检测到IRS1 mRNA的表达,在两品种肌肉中的表达量均表现为9胚龄或者12胚龄最高,与其他各阶段差异显著,随后下降,并在出雏后维持在较低水平;肝脏中IRS1的表达模式与IGF1R一致。IGF1、IGF1R和IRS1基因的表达两两之间均表现出显著或极显著的正相关关系,同时,肌肉中3个基因的表达与体重、胸（腿）肌重存在显著的负相关,而肝脏中3个基因的表达与体重、胸（腿）肌重、肝脏重均存在显著的正相关。【结论】IGF1-PI3K-AKT信号通路相关基因之间存在一致性趋势,品种间和组织间表达量的差异可能正是不同类型黄羽肉鸡生长发育差异的主要原因之一。
【目的】探讨影响琅琊鸡及其配套系蛋壳质量和钙代谢的差异因素,为琅琊鸡品种资源保护及开发提供理论依据。【方法】选取240日龄琅琊鸡及其浅麻羽色、深麻羽色配套系各180只,各品系随机分为6个重复,每个重复30只,在相同饲养条件下饲养至300日龄时各重复随机收集鸡蛋30枚,各重复随机选取6只,翅下静脉采集血样、屠宰后收集左腿胫骨及十二指肠、蛋壳腺、肾脏等组织样,用于检测蛋壳质量、钙、磷相关指标及钙结合蛋白CaBP-D28k mRNA的表达量。【结果】浅麻羽色配套系的蛋重显著低于深麻羽色配套系（P<0.05）,而蛋壳重低于其他品系（P>0.05）;另外,蛋壳厚度和蛋壳比率显著高于深麻羽色配套系（P<0.05）,蛋壳强度显著高于其他品系（P<0.05）;浅麻羽色配套系的蛋黄、蛋壳、胫骨中钙含量显著高于深麻羽色配套系（P<0.05）,蛋壳、胫骨中磷含量显著高于其他品系（P<0.05）;蛋壳中灰分含量浅麻羽色配套系最高,其次为琅琊鸡、深麻羽色配套系,而胫骨中灰分含量和胫骨重浅麻羽色配套系最高,其次为琅琊鸡、深麻羽色配套系,品系间均差异显著（P<0.05）;浅麻羽色配套系的体重、胫骨长度显著低于深麻羽色配套系（P<0.05）;浅麻羽色配套系的血钙、降钙素含量显著低于其他品系,而浅麻羽色配套系的血磷、碱性磷酸酶、甲状旁腺素含量显著高于其他品系,且品系间均差异显著（P<0.05）;浅麻羽色配套系的钙结合蛋白含量显著低于深麻羽色配套系（P<0.05）,而两个配套系的骨钙素显著高于琅琊鸡（P<0.05）;浅麻羽色配套系的十二指肠部位钙结合蛋白CaBP-D28k mRNA表达量显著高于其他品系（P<0.05）,而蛋壳腺部位表达量显著高于深麻羽色配套系（P<0.05）,肾脏部位钙结合蛋白表达量显著高于琅琊鸡（P<0.05）。【结论】在240—300日龄产蛋期,浅麻羽色配套系的血磷、碱性磷酸酶、甲状旁腺素、骨钙素等相关活性物质及十二指肠、肾脏、蛋壳腺部位钙结合蛋白CaBP-D28k mRNA表达水平高于其他品系,可能促进其小肠上段对钙磷的吸收和骨钙的释放、转运能力,影响蛋黄、蛋壳中矿物质的沉积和改善蛋壳、胫骨质量。
【目的】验证姜黄素是否能够通过转录因子E2相关因子2（Nuclear factor E2-related factor 2,Nrf2）信号通路减轻H2O2诱导的奶牛乳腺上皮细胞的氧化应激,为防治围产期奶牛代谢紊乱导致的氧化损伤提供理论依据。【方法】培养奶牛乳腺上皮细胞（MAC-T）,用500 μmol·L-1H2O2处理MAC-T细胞24 h后加入不同浓度的姜黄素（0、5、15或30 μmol·L-1）处理3 h;MAC-T细胞转染Nrf2 siRNA 48 h后,用500 μmol·L -1 H2O2处理奶牛乳腺上皮细胞系MAC-T细胞24 h后加入不同浓度的姜黄素（0、5、15或30 μmol·L-1）处理3 h。采用实时定量PCR（Quantitative real-time PCR,qPCR）、蛋白免疫印迹（Western blot,WB）和试剂盒等方法,检测Nrf2的蛋白表达量及下游靶基因NAD（P）H醌氧化还原酶1（NAD(P)H quinone oxidoreductase 1,NQO1）和血红素加氧酶1（Heme oxygenase 1,HO-1）的mRNA及蛋白表达量和超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione peroxidase,GSH-Px）、过氧化氢酶（Catalase,CAT）和丙二醛（Malondialdehyde,MDA）等氧化应激相关指标的活性及含量。【结果】（1）H2O2处理组MAC-T细胞中MDA含量显著高于对照组（P<0.01）,而CAT、SOD和GSH-Px的活性显著低于对照组（P<0.01）。15 μmol·L-1姜黄素+H2O2共同处理组和30 μmol·L-1姜黄素+H2O2共同处理组MAC-T细胞中MDA的含量显著低于H2O2处理组（P<0.01）,而CAT、SOD和GSH-Px的活性显著高于H2O2处理组（P<0.05,P<0.01）。（2）H2O2处理组总Nrf2蛋白水平显著低于对照组（P<0.01）,H2O2处理组Nrf2下游基因HO-1和NQO1的mRNA及蛋白表达量也显著低于对照组（P<0.01）。姜黄素处理组总Nrf2蛋白表达水平显著高于对照组（P<0.01）,姜黄素处理组HO-1和NQO1的mRNA及蛋白表达量也显著高于对照组（P<0.01）。姜黄素+H2O2处理组总Nrf2蛋白表达水平显著高于H2O2处理组（P<0.01）,姜黄素+H2O2处理组HO-1和NQO1的mRNA及蛋白表达量也显著高于H2O2处理组（P<0.01）。（3）si-Nrf2组与对照组相比,Nrf2的mRNA表达水平显著降低（P<0.01）。si-Control+H2O2+姜黄素组与si-Control+H2O2组相比,MDA的含量显著降低（P<0.01）,而CAT、SOD和GSH-Px的活性显著升高（P<0.01）。si-Nrf2+H2O2+姜黄素处理组与si-Control+H2O2+姜黄素组相比,MDA的含量显著升高（P<0.01）,而CAT、SOD和GSH-Px活性显著降低（P<0.01）。【结论】姜黄素可以通过增加Nrf2的表达,诱导下游抗氧化分子的转录从而缓解H2O2诱导奶牛乳腺上皮细胞的氧化应激。本研究为防治围产期奶牛代谢紊乱导致的奶牛乳腺上皮细胞氧化损伤提供理论依据。
【目的】已有研究表明捻转血矛线虫（Haemonchus contortus）Hc-hrg-2属于血红素应答基因,高浓度血红素的刺激可导致该基因的转录水平上调,但其在血红素调控中的功能尚缺乏研究。研究通过同源重组技术构建血红素合成缺陷型酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）hem1敲除株,通过异源表达Hc-hrg-2对该敲除株进行表型拯救试验,以期验证Hc-hrg-2参与细胞内血红素转运的功能。 【方法】以S. cerevisiae BY4741基因组为模板,设计引物,扩增获得hem1（SGD:S000002640）基因序列5' 和3' 侧翼区同源臂;同时以pYES2-CT质粒为模板设计引物,扩增获得筛选标记URA3序列;利用两次重叠PCR技术依次将测序正确的上游同源臂、URA3、下游同源臂序列串联成基因敲除组件,并通过醇沉法对敲除组件进行纯化。采用醋酸锂转化法将纯化的敲除组件转化至BY4741感受态细胞中, 经SD/- URA（含250 μmol·L-1 5-氨基乙酰丙酸（ALA））培养基筛选,并利用多对引物进行PCR鉴定,以验证Δhem1敲除株的正确性。同时以含有H. contortus 浙江株Hc-hrg-2 序列（GenBank：MK371241）及其功能域缺失序列Hc-hrg-2(Δgst-n) 和Hc-hrg-2(Δgst-c) 的质粒为模板,利用特异性引物分别进行PCR扩增,通过无缝克隆将扩增得到的目的片段插入酵母pESC-LEU表达载体,经PCR鉴定以及测序验证后,采用醋酸锂转化法将正确的表达载体转化至Δhem1感受态细胞中,通过SD/- URA/- LEU（含250 μmol·L-1 ALA）培养基筛选以及PCR鉴定验证阳性异源表达株的正确性。通过比较Δhem1敲除株及其各异源表达株在含有或不含有250 μmol·L-1 ALA的SD/- URA/- LEU液体培养基中的生长情况,进一步验证敲除株的表型同时排除表达载体对表型的影响。用2%半乳糖对含有阳性表达质粒的敲除株进行诱导,取部分菌液进行超裂破碎,收集蛋白,通过Western Blot鉴定目的蛋白的表达;剩余菌体用去离子水重悬至OD600 = 0.2,用去离子水进行5倍比稀释,取4 μL稀释后的菌液点至含有250 μmol·L-1 ALA或者不同浓度血红素的诱导平板上,28℃培养2—3 d后比较敲除株的生长情况。【结果】成功获得hem1基因敲除株Δhem1,与野生株相比,Δhem1不能合成血红素,需外源添加ALA（250 μmol·L-1）或血红素（≥ 10 μmol·L-1）才能生长,且异源表达株和敲除株的表型一致。Western Blot结果表明2%半乳糖能诱导Hc-hrg-2及其功能域缺失基因在敲除株中成功表达,且表达Hc-hrg-2能够在低血红素浓度下（≤ 1 μmol·L-1）促进酵母对血红素的摄取,拯救敲除株的生长缺陷,其硫氧还蛋白样结构域（GST-N）和谷胱甘肽S-转移酶C末端结构域（GST-C）的缺失会降低拯救的效果。【结论】捻转血矛线虫血红素应答基因Hc-hrg-2可促进细胞对血红素的摄取,其GST-N和GST-C功能域在该过程中发挥着重要作用,研究成果为后续深入研究捻转血矛线虫的血红素转运机制奠定基础。
【目的】东方蜜蜂微孢子虫（Nosema ceranae）感染意大利蜜蜂（Apis mellifera ligustica,简称意蜂）导致蜜蜂微孢子虫病。本研究结合前期已获得的miRNA和mRNA组学数据,通过生物信息学方法对意蜂工蜂中肠的差异表达miRNA（differentially expressed miRNA,DEmiRNA）靶向结合的东方蜜蜂微孢子虫的mRNA和差异表达mRNA（DEmRNA）进行预测、数据库注释和调控网络分析,以期在组学水平解析miRNA介导意蜂工蜂对东方蜜蜂微孢子虫的跨界调控机制。【方法】通过比较东方蜜蜂微孢子虫侵染7 d和10 d的意蜂工蜂中肠（AmT1、AmT2）和未受侵染的工蜂中肠（AmCK1、AmCK2）的miRNA组学数据筛选出宿主的显著性DEmiRNA,通过比较侵染意蜂工蜂中肠的东方蜜蜂微孢子虫（NcT1、NcT2）和东方蜜蜂微孢子虫纯净孢子（NcCK）的mRNA数据筛选出病原的DEmRNA。利用TargetFinder软件预测宿主显著性DEmiRNA靶向结合的病原mRNA和DEmRNA。利用相关生物信息学工具对上述靶DEmRNA进行GO和KEGG数据库注释。结合前期研究结果筛选出孢壁蛋白、极管蛋白、蓖麻毒素B凝集素、ABC转运蛋白、ATP/ADP移位酶和糖酵解/糖异生途径等毒力因子和能量代谢通路相关的病原DEmRNA及与其存在靶向结合关系的宿主显著性DEmiRNA,并构建和分析二者的调控网络。【结果】AmCK1 vs AmT1比较组中宿主的48条显著上调miRNA和36条显著下调miRNA分别靶向病原的1 345和1 046条mRNA;进一步分析发现,宿主的47条显著上调miRNA和34条显著下调miRNA可分别靶向NcCK vs NcT1比较组中病原的584条显著下调mRNA和265条显著上调mRNA,它们可分别注释到19和22个功能条目以及66和64条通路。AmCK2 vs AmT2比较组中宿主的56条显著上调miRNA和51条显著下调miRNA分别靶向病原的1 260和1 317条mRNA;进一步分析发现,宿主的52条显著上调miRNA和49条显著下调miRNA可分别靶向NcCK vs NcT2比较组中病原的587条显著下调mRNA和336条显著上调mRNA,它们可分别注释到20和23个功能条目以及64和65条通路。AmCK1 vs AmT1和AmCK2 vs AmT2比较组的8条共同显著上调miRNA和1条共同显著下调miRNA分别靶向NcCK vs NcT1和NcCK vs NcT2比较组中的144条共同显著下调和10条共同显著上调mRNA,可分别注释到18和13个功能条目以及38和7条通路。此外,AmCK1 vs AmT1和AmCK2 vs AmT2比较组中宿主的显著上调miRNA可靶向结合NcCK vs NcT1和NcCK vs NcT2比较组中与RNAi途径,孢壁蛋白和蓖麻毒素B凝集素等毒力因子,糖酵解/糖异生途径以及MAPK信号通路相关的病原下调表达mRNA。【结论】在东方蜜蜂微孢子虫的侵染过程中,意蜂工蜂中肠的DEmiRNA与病原的DEmRNA之间存在复杂的靶向结合关系以及潜在的跨界调控关系;宿主的DEmiRNA可能通过抑制或降解病原的RNAi途径、毒力因子、糖酵解/糖异生通路、ATP/ADP移位酶、ABC转运蛋白及MAPK信号通路相关靶DEmRNA影响病原的侵染和增殖。
【目的】通过分析不同温度、湿度环境下肉鸡体表温度的变化,构建不同日龄肉鸡温湿指数（THI）模型。【方法】分别在28、35、42和49日龄时,选择30只AA肉公鸡,饲养于2个人工环境控制舱内。舱内相对温度分别设定为50%和80%,舱内温度均由18℃开始,每0.5h升高1℃,至33℃并维持0.5h。一共设定2个湿度和16个温度梯度。利用微型温度记录仪连续监测肉鸡体表温度、体核温度和环境温度,每2 min记录1次,同时每10 min检测一次环境湿度。【结果】在24—33℃的范围内,肉鸡体表温度随环境温度升高而线性升高,且受到环境湿度的影响,因此选择环境温度≥24℃后的数据进行分析。通过计算THI与肉鸡体表温度最大相关时干球和湿球温度的权重值,得到不同日龄肉鸡的THI模型,分别为THI28日龄=0.82×T干球+0.18×T湿球;THI35日龄=0.69×T干球+0.31×T湿球;THI42日龄=0.67×T干球+0.33×T湿球;THI49日龄=0.61×T干球+0.39×T湿球。根据干湿球温度的权重值计算出的THI与体表温度之间的线性相关系数达到0.96以上。经2个独立试验验证,THI计算值与体表温度仍存在较强的线性关系,线性相关系数达到0.94以上,且THI模型预测的体表温度与实际测定结果基本一致。【结论】本研究得出的THI模型与体表温度存在良好的线性关系,适用24—33℃范围内温热环境的评价;不同日龄肉鸡THI模型存在差异,随肉鸡日龄增加,湿球温度的权重逐渐增大。
【目的】筛选1株适合PCV2病毒生产的悬浮细胞株,摸索PCV2悬浮生产工艺（病毒种毒来源、MOI及收获时间）,为大规模悬浮培养技术制备疫苗提供试验依据。【方法】使用有限稀释法对PK15原细胞稀释后接种于96孔板,每2 d观察细胞生长和形态,待细胞90%长满后,将细胞从96孔板陆续扩至24孔板、12孔板、6孔板,最后到方瓶,筛选3株可贴壁生长的、形态较好的PK15克隆。3株克隆（PK15-1C8、2F11、1E5）按照1×106细胞/mL的密度,直接接种在PK15的无血清培养基中,并置于37℃,5%二氧化碳,120 r/min的摇床培养箱中继续培养,每天监测细胞密度和活率,每3 d传代,使细胞逐渐适应悬浮环境,驯化为可全悬浮、无血清培养的悬浮细胞株;细胞传代稳定并建库后,接种PCV2病毒,通过对比3株悬浮克隆细胞培养PCV2病毒含量的差异,筛选1株克隆细胞,用于生产PCV2;针对不同种毒（来源于贴壁细胞或悬浮细胞）,摸索感染MOI（0.1、0.2、0.5）及收获时间（48、72、96、120h）,确定PCV2最佳生产工艺。【结果】（1）贴壁细胞置于无血清培养基中,适应至第2代时细胞即可呈悬浮生长,连续传至11代,细胞生长稳定,按照1×106/mL接种细胞,细胞生长72h时细胞密度可达到10×106/mL,活率在95%以上,倍增时间为20h左右;（2）3株悬浮细胞使用相同条件,分别接种PCV2病毒后,PK15-1C8克隆细胞的病毒含量可达到106.4TCID50/mL,克隆PK15-2F11（105.5TCID50/mL）、PK15-1E5（105.6TCID50/mL）,3株克隆细胞病毒含量均高于原克隆（104.7TCID50/mL）,但PK15-1C8克隆细胞的病毒含量更高且更稳定,确定为后续研究用细胞;（3）使用贴壁细胞来源的种毒（106.4TCID50/mL）感染PK15-1C8克隆细胞后,最优工艺为接毒时细胞密度1×106/mL,以0.1MOI接毒,接毒后72h收获,最高病毒含量为106.5TCID50/mL。以来源于悬浮细胞的种毒（106.3TCID50/mL）感染细胞后,病毒含量较贴壁细胞来源种毒更高,最高可达107.3TCID50/mL,其最优工艺为接毒时细胞密度1×106/mL,以0.2MOI接毒,接毒后72h收获。【结论】通过对PK15细胞进行单克隆筛选,驯化悬浮、3株悬浮细胞接种PCV2后病毒含量的对比,确定一株病毒含量最高的悬浮细胞,并以此悬浮细胞为基础进行PCV2生产工艺摸索,建立了全悬浮无血清培养的PK15-1C8细胞增殖PCV2工艺,该工艺首次使用悬浮细胞扩增PCV2病毒为种毒进行接毒,最高病毒含量可达107.3TCID50/mL,可用于工厂化疫苗生产。
【目的】利用已获得的纳米孔全长转录组数据对现有的东方蜜蜂微孢子虫（Nosema ceranae）参考基因组的基因序列和功能注释进行完善。【方法】采用TransDecoder软件预测东方蜜蜂微孢子虫基因的开放阅读框（open reading frame,ORF）及相应的氨基酸。利用gffcompare软件将全长转录本与参考基因组注释的转录本进行比较,对基因组注释基因的非编码区向上游或下游延伸,修正基因的边界。利用MISA软件鉴定长度在500 bp以上的全长转录本的简单重复序列（simple sequence repeat,SSR）位点,包括单核苷酸重复、双核苷酸重复、三核苷酸重复、四核苷酸重复、五核苷酸重复、六核苷酸重复、混合SSR等类型。通过Blast工具将鉴定到的新基因和新转录本比对Nr、KOG、eggNOG、GO和KEGG数据库,从而获得功能注释。【结果】共预测出2 353个完整ORF,其中长度分布在0—100个氨基酸的ORF最多,占总ORF数的72.12%。共对东方蜜蜂微孢子虫的2 340个基因进行了结构优化,其中5′端延长的基因有1 182个,3′端延长的基因有1 158个。共鉴定到1 658个SSR,其中单核苷酸重复、双核苷酸重复、三核苷酸重复、四核苷酸重复的数量分别为1 622、23、7和6个;单核苷酸重复类型的SSR密度最大,达到182.32个/Mb,其次为混合SSR、双核苷酸重复和三核苷酸重复,分别达到6.90、2.78和0.73个/Mb。共鉴定出954个新基因,其中分别有951、333、371、422和321个新基因可注释到Nr、KOG、eggNOG、GO和KEGG数据库。此外,还鉴定出6 164条新转录本,其中分别有6 141、2 808、2 932、3 196和2 585条新转录本可注释到Nr、KOG、eggNOG、GO和KEGG数据库。新基因和新转录本注释数量最多的物种均为东方蜜蜂微孢子虫,其次是蜜蜂微孢子虫（Nosema apis）。【结论】研究结果较好地完善了现有的东方蜜蜂微孢子虫参考基因组已注释基因的序列和功能注释,并补充和注释了大量参考基因组未注释的新基因和新转录本。
【目的】通过对四川地区规模化猪场A群轮状病毒（RVA）的分子检测,从而了解RVA流行情况及分子特征,为猪RVA疫苗研制提供理论基础。【方法】2017—2019年从四川省14个地区40个猪场采集303份仔猪腹泻样本,用荧光定量RT-PCR方法调查RVA的分子流行率,用RT-PCR方法对RVA阳性样本进行分型和VP4和VP7全基因组的扩增,用RotaC2.0软件确定相应毒株的基因型,用MegAlign软件进行同源性分析,通过MEGA 7.0软件用邻近法构建系统进化树,用SimPlot和RDP4软件进行重组分析。【结果】303份仔猪腹泻样本检出RVA阳性样本98份,阳性率为32.34%（98/303,95%CI=27.1%—37.9%）。从98份RVA阳性样本中扩增出39个VP7片段,G9为优势基因型（41%）,G4、G5、G26和G3各占23%、28.2%、5.1%和2.7%。扩增出的59个P型中以P[13]型为主,占40.7%,其次为P[6]、P[23]和P[1]型,分别占30.5%、23.7%和5.1%。30株毒株成功鉴定出G/P基因型,G9P[23]（23.3%）为优势组合基因型。其他基因型为G4P[6](16.7%)、G9P[13](13.3%)、G5P[23](10%)、G5P[13](10%)、G9P[6](6.7%)、G26P[13](6.7%)、G4P[13](6.7%)、G4P[23](3.3%)和G3P[13](3.3%)。基因型G5P[23]、G4P[13]、G9P[6]、G26P[13]和G4P[23]为国内首次鉴定。此外,重组分析表明4株毒株在VP7或VP4基因上存在重组现象。【结论】四川地区腹泻仔猪粪便中RVA的流行率高且基因型复杂,优势组合基因型为G9P[23]。该结果丰富了四川地区RVA的流行病学资料,对四川地区猪RVA的防控提供了重要参考。
