【背景】产气荚膜梭菌Epsilon毒素(Clostridium perfringens Epsilon toxin,ETX)作为世界已知的第三强生物毒素,ETX中毒症对畜牧业造成严重的经济损失。因此,急需建立一种特异性强、灵敏度高、操作简便且适用于大规模样本筛查ETX诊断方法。【目的】制备小鼠抗ETX单克隆抗体(monoclonal antibody,mAb)且建立ETX的双抗体夹心ELISA(DAS-ELISA)法,从而为ETX的早期诊断、疫情监控及防控策略制定提供物质基础。【方法】采用灭活后的天然ETX(类毒素,简称iETX)和无毒性的重组ETX(rETXm1)作为免疫原免疫BALB/c小鼠,并利用rETXm1作为包被抗原建立的间接ELISA方法和间接免疫荧光试验进行mAb的筛选。对获得的mAb进行ETX中和活性的测定,并制备小鼠单克隆腹水。采用Protein A亲和层析方法对小鼠腹水进行纯化,并利用SDS-PAGE和Western Blot方法鉴定。采用兔抗产气荚膜梭菌ε毒素多克隆抗体(捕获抗体)和具有中和活性的单克隆抗体(检测抗体)建立检测ETX的DAS-ELISA,通过棋盘法优化捕获抗体的浓度和检测抗体浓度,确定最佳反应条件,对方法的临界值、特异性、灵敏度、重复性进行验证,最终进行临床应用。【结果】共筛选出3株能稳定传代并产生ETX特异性mAbs的杂交瘤细胞株,分别命名为ETX-CH、ETX-ZH及ETX-NH。毒素中和活性试验结果表明,ETX-ZH在细胞水平的毒素中和效价最高,而ETX-NH无中和活性。小鼠体内毒素中和试验进一步表明ETX-ZH在小鼠体内对ETX仍有中和活性。腹水纯化后ETX-ZH中蛋白含量为2.3 mg·mL-1。经棋盘法确定,捕获抗体最佳稀释度为1﹕100,检测抗体最佳稀释度为1﹕1 600;此方法优化的最佳条件为:捕获抗体4 ℃包被12 h、5%的脱脂乳37 ℃封闭2 h、抗原37 ℃孵育90 min、检测抗体37 ℃孵育30 min、酶标二抗IgG 37 ℃孵育1 h、37 ℃ TMB显色15 min。该方法测定阳性临界值为0.161,阴性临界值为0.143。特异性高且与产气荚膜梭菌其他毒素和纯化蛋白均无交叉反应。重复性好,批内变异系数≤4.69%,批间变异系数≤5.32%。测定rETXm1的最低检测限为31.25 ng·mL-1,ETX的最低检测限为0.5个MLD。对18份含有ETX类毒素的多联干粉疫苗进行检测,ETX的检出率为100%。【结论】采用制备的ETX mAb建立了DAS-ELISA检测方法,特异性高,重复性好,可用于ETX的检测。