中国农业科学 ›› 2023, Vol. 56 ›› Issue (21): 4304-4317.doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2023.21.013
颜培涵(), 罗健铭, 郝晨星, 孙紫青, 叶蓉春, 李益, 刘恋, 盛玲, 马先锋, 邓子牛(
)
收稿日期:
2023-04-06
接受日期:
2023-06-09
出版日期:
2023-11-01
发布日期:
2023-11-06
通信作者:
联系方式:
颜培涵,E-mail:yanpeihan7279@163.com。
基金资助:
YAN PeiHan(), LUO JianMing, HAO ChenXing, SUN ZiQing, YE RongChun, LI Yi, LIU Lian, SHENG Ling, MA XianFeng, DENG ZiNiu(
)
Received:
2023-04-06
Accepted:
2023-06-09
Published:
2023-11-01
Online:
2023-11-06
摘要:
【背景】柑橘溃疡病(Citrus canker)是由黄单胞杆菌柑橘致病变种(Xanthomonas citri subsp. citri,Xcc)引起的危害严重的柑橘病害之一,目前尚无根治方法,而现有栽培品种中很少有对柑橘溃疡病存在显著抗性的品种,因此,抗病品种的选育对根治该病害尤其重要,而抗性基因的发掘又非常利于抗病育种。【目的】以枸橼C-05的抗溃疡病相关基因CmPR4A为诱饵,筛选其上游转录因子,探究转录因子参与调控枸橼C-05抗溃疡病的功能作用,为选育柑橘抗病品种提供基因信息。【方法】基于前期冰糖橙和枸橼C-05叶片接种Xcc的转录组测序结果,结合实时荧光定量PCR分析PR4A在抗病和感病种质中的表达差异,使用PlantCARE对枸橼C-05(抗病)和冰糖橙(感病)PR4A启动子序列进行差异分析,利用酵母单杂交筛选PR4A上游转录因子,并使用酵母回转验证、双荧光素酶验证CmPR4A和候选转录因子的互作关系。在8种抗病和感病柑橘种质中,人工接种Xcc后,于0、2、4、6和8 d时取注射点附近的叶片,对转录因子的表达水平进行分析,验证其与抗病的关系。通过农杆菌介导瞬时转化法,将带有35S启动子的转录因子载体在枸橼C-05和冰糖橙叶片中瞬时过表达,使用qRT-PCR对转录因子和PR4A表达水平进行分析,并在瞬时过表达24 h后接种Xcc,进行Xcc菌定量和症状观察。【结果】接种Xcc的枸橼C-05和冰糖橙的转录组分析及定量PCR表达结果显示,在接种4、6和8 d时,抗病种质枸橼C-05中的PR4A表达量显著高于感病的冰糖橙。枸橼C-05和冰糖橙的PR4A启动子在-236 bp处存在顺式作用元件W-box的差异,以此为依据进行CmPR4A启动子短截并构建诱饵载体。依据自激活结果,在200 ng·mL-1的金担子素(AbA)浓度下,以proCmPR4A-2为诱饵,在枸橼C-05受Xcc诱导下的酵母文库中进行酵母单杂交筛选,表明CmWRKY75可以与proCmPR4A-2互作,双荧光素酶报告系统也证实二者的互作关系,且CmWRKY75正调控CmPR4A的表达。在8种柑橘种质叶片接种Xcc后进行WRKY75的表达模式分析表明,WRKY75表达量在抗病种质枸橼C-05、美国枸橼AV、矮果香橼中显著上调,在感病种质冰糖橙、沙田柚及柠檬、南川香橼和丹娜香橼中只出现微量上调。在枸橼C-05和冰糖橙叶片中瞬时过表达WRKY75,发现PR4A的表达量在接种4 d时显著上调且能增强叶片对Xcc的抗性。【结论】CmWRKY75可以结合到CmPR4A启动子的W-box上,并正调控CmPR4A的表达,增强叶片对Xcc的抗性。同时WRKY75的表达受Xcc诱导,在抗病种质中呈显著上调表达,与PR4A在抗病感种质中的表达变化趋势一致,可能是上游调控因子WRKY75在不同抗病和感病柑橘种质中表达差异导致,从而使其在枸橼C-05抗溃疡病过程中起作用。
颜培涵, 罗健铭, 郝晨星, 孙紫青, 叶蓉春, 李益, 刘恋, 盛玲, 马先锋, 邓子牛. 枸橼C-05 CmPR4A上游转录因子CmWRKY75的筛选及其抗溃疡病功能分析[J]. 中国农业科学, 2023, 56(21): 4304-4317.
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表1
本研究所用引物"
用途 Use | 引物名称 Primer name | 引物序列 Primer sequence (5′-3′) |
---|---|---|
酵母单杂交 Yeast one hybrid | proCmPR4A-P1-AbAi-F-Sac I | CTTGAATTCGAGCTCGGGTTGCTCAAGAGCCAGATG |
proCmPR4A-P2-AbAi -F-Sac I | CTTGAATTCGAGCTCCCCTTAGCAGCCCCCGC | |
proCmPR4A-AbAi -R-Xho I | AGCACATGCCTCGAGATTTTTCTCTTAATTTTTTTTAGCTTAACTTACC | |
CmWRKY75-pGADT7-F-EcoR I | GGAGGCCAGTGAATTCATGGAAAATTGCCAAATGTTTTTC | |
CmWRKY75-pGADT7-R-Bam HI | CGAGCTCGATGGATCCTCAAAATGGAGTGTAAATTTGCAACT | |
双荧光素酶 Dual-luciferase | proCmPR4A-pGreen-F-Hind III | GACGGTATCGATAAGCTTCCCTTAGCAGCCCCCGC |
proCmPR4A-pGreen-R-Bam HI | AGAACTAGTGGATCCATTTTTCTCTTAATTTTTTTTAGCTTAACTTACC | |
瞬时过表达 Over-expression | CmWRKY75-P1300-F-Sac I | ACGGGGGACGAGCTCATGGAAAATTGCCAAATGTTTTTC |
CmWRKY75-P1300-R-Kpn I | GCTCACCATGGTACCTCAAAATGGAGTGTAAATTTGCAACT | |
实时荧光 定量PCR Quantitative Real-time PCR | Actin-qPCR -F | CATCCCTCAGCACCTTCC |
Actin-qPCR -R | CCAACCTTAGCACTTCTCC | |
PR4A-qPCR-F | TATGGCTGGACCGCTTTCTG | |
PR4A-qPCR-R | TCTAAGCCTCCATTGGCACA | |
WRKY75-qPCR-F | TGCTTTCCAAACAAGAAGCCAA | |
WRKY75-qPCR-R | CAACGGTAGTAGCTTCTGGGG |
表2
CmPR4A上游转录因子在Xcc诱导的枸橼C-05酵母文库中的筛库结果"
基因名称 Gene name | 基因ID Gene ID | 转录因子家族 Transcription factor family | 功能 Function |
---|---|---|---|
HDG1 | Cme072170 | HD-ZIP | 茉莉酸代谢;角质层发育;花器官特性的维持 Jasmonate metabolism; Development of cuticle; Maintenance of floral organ characteristics |
MADA4 | Cme017590 | ZF-HD | 细胞分化、防御反应、调节代谢 Cell differentiation, defense response, regulation of metabolism |
RMA3 | Cme174580 | ZF-HD | 解旋酶和E3泛素连接酶活性 Activity of helicase and E3 ubiquitin ligase |
WRKY33 | Cme018250 | WRKY family | SUMO化修饰调控植物免疫反应 SUMO modification regulates plant immune response |
bHLH122 | Cme111260 | bHLH | 表皮发育;光周期;调节气孔运动 Epidermal development; Photoperiod; Regulate stomatal movement |
TGA10 | Cme058810 | bZIP | 调节植物信号分子水杨酸和茉莉酸甲酯 Regulate plant signal molecules salicylic acid and methyl jasmonate |
bZIP 60 | Cme155220 | bZIP | 调控种子萌发;增强耐热性 Regulating seed germination; Enhanced heat resistance |
WRKY75 | Cme125500 | WRKY | 参与叶片与花瓣的衰老与脱落;参与抗病反应 Participate in the senescence and shedding of leaves and petals; Participate in disease resistance response |
图6
不同柑橘种质叶片接种柑橘溃疡病菌后WRKY75的表达模式 Citron C-05:枸橼C-05;MGJY:美国枸橼American citron;AGXY:矮果香橼Aiguo citron;Bingtang Sweet orange:冰糖橙;STY:沙田柚 Shatian Yu pummelo;NM:柠檬Lemon;NCXY:南川香橼Nanchuan citron;DNXY:丹娜香橼Danna citron。红色系为抗病种质;蓝色系为感病种质 The red series represents resistant genotypes, while the blue series represents susceptible genotypes"
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