中国农业科学 ›› 2008, Vol. ›› Issue (9): 2902-2908 .doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2008.09.045

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小鼠胚胎诱导型Hsp70基因的RNA干扰有效序列筛选

  

  1. 青岛农业大学动物科技学院
  • 收稿日期:2007-01-31 修回日期:2008-02-03 出版日期:2008-09-01 发布日期:2008-09-01
  • 通讯作者: 田文儒

  1. 青岛农业大学动物科技学院
  • Received:2007-01-31 Revised:2008-02-03 Online:2008-09-01 Published:2008-09-01

摘要: 【目的】应用RNA干扰技术沉默小鼠胚胎成纤维细胞(Mouse embryonic fibroblast,MEF)中诱导型热休克蛋白70(Hsp72)基因的表达,从而筛选出对Hsp72基因具有确实干扰作用的siRNA。【方法】设计并合成4对特异性针对Hsp72基因的siRNA,借助LipofectamineTM 2000瞬时转染MEF,41℃热应激处理后,采用RT-PCR和Western blot检测Hsp70 mRNA和Hsp70蛋白表达量。【结果】在热应激组中,siRNA1、siRNA2两组及阳性、阴性和空白3个对照组的Hsp70 mRNA和Hsp70蛋白表达量均极显著高于常温对照组(P<0.01),siRNA3和siRNA4两组的Hsp70 mRNA的表达量极显著低于常温对照组(P<0.01);siRNA3组Hsp70蛋白表达量极显著低于常温对照组(P<0.01),而siRNA 4组与常温对照组差异不显著(P>0.05)。与空白对照相比,4对siRNA中siRNA3和siRNA4对MEF中Hsp72 mRNA有极显著(P<0.01)的抑制作用,其对Hsp72 mRNA的抑制率分别为86.2%和75.4%(P<0.01),对Hsp72蛋白表达的抑制率分别为77.3%和57.0%(P<0.01)。【结论】体外合成的四对特异性针对Hsp72基因的siRNA中,靶位点在Hsp72 mRNA二级结构表面位置的siRNA3和siRNA4对Hsp72基因具有显著的抑制作用,靶位点在Hsp72 mRNA二级结构复杂处的siRNA1和siRNA2对Hsp72基因的抑制作用不明显。

关键词: RNA干扰, 小鼠胚胎成纤维细胞, 小干扰RNA