目的: 流行性出血病(Epizootic Hemorrhagic Disease, EHD)是一种由流行性出血病病毒(EHDV)引起、经库蠓传播的虫媒传染病,感染野生及家养反刍动物,被世界动物卫生组织(WOAH)列为须通报动物疫病。近年来我国监测显示多个EHDV血清型在南方省份流行,且血清学阳性率极高,暴发风险严峻。然而,目前缺乏适用于现场、无需复杂仪器的快速检测技术。本研究旨在开发一种基于RT-ERA和CRISPR-Cas12a技术的EHDV核酸检测新方法,以实现对EHDV的高灵敏、高特异、快速且可视化的现场检测。
方法:本研究首先通过对EHDV不同血清型基因组序列进行比对分析,选定高度保守的S1基因片段作为检测靶标,并设计特异性crRNA。通过荧光检测法筛选并优化了CRISPR-Cas12a系统中的crRNA及Cas12a蛋白的最佳工作浓度。随后,针对该靶标设计了多对RT-ERA引物,通过筛选获得了最优扩增引物对(F6/R3)。将优化的RT-ERA扩增体系与CRISPR-Cas12a检测系统联用,构建了RT-ERA/CRISPR-Cas12a检测平台。通过使用梯度稀释的病毒RNA评估了该系统的检测灵敏度;通过检测蓝舌病病毒(BTV)、中山病毒(CHUV)等其他常见反刍动物病原体评估其特异性。最后,使用54份临床样本,分别经传统TRIzol提取法和HUDSON快速处理法处理样本后,将该检测系统与已建立的实时荧光RT-PCR方法进行比较,以评估其临床应用的灵敏度和特异性。
结果:本研究成功建立了EHDV的RT-ERA/CRISPR-Cas12a检测方法。优化的CRISPR-Cas12a系统在75 ng Cas12a蛋白和400 nM crRNA1条件下效果最佳。此外,最优RT-ERA引物对为F6/R3。该联用检测系统的灵敏度极高,荧光读值法和横向流动试纸条法的检测下限分别可达1.7 × 101拷贝/反应和1.7 × 102拷贝/反应。特异性试验表明,该系统能有效检测EHDV-1, 2, 4-8, 10共8种血清型,而对BTV等其他病原体无一交叉反应。在54份临床样本检测中,基于TRIzol提取RNA的方法与实时荧光RT-PCR结果完全一致(灵敏度与特异性均为100%);基于HUDSON快速处理的样本,其检测灵敏度为96%,特异性仍保持100%,可在无需核酸纯化的条件下实现快速检测。