防御素在植物的生长发育和抵御病原菌侵染过程中发挥重要的作用,然而苹果中防御素对苹果树腐烂病菌抗性的作用尚不清楚。本研究中,共鉴定出29个苹果防御素蛋白,它们具有保守的序列特征。基于表达分析,发现苹果防御素在苹果各组织中均有分布,5个防御素基因的表达受到苹果壳囊孢的显著诱导。构建5个防御素的转基因愈伤,过表达防御素基因均能增强对苹果壳囊孢的抗性。其中,MdDEF30表达受苹果壳囊孢菌强烈诱导并显著提高愈伤抗性。进一步的体外活性实验证实MdDEF30能抑制壳囊孢的生长。MdDEF30能够促进活性氧积累和激活防卫相关基因PR4,PR10,CML13及MPK3的表达。通过构建MdDEF30共表达网络,发现转录因子MdWRKY75可能调控MdDEF30的表达。利用酵母单杂、荧光酶素报告基因和染色质免疫共沉淀荧光定量实验证实MdWRKY75能够与MdDEF30启动子直接结合。接种实验表明MdWRKY75正调控对苹果树腐烂病抗性,并且激活MdDEF30的表达。这些结果阐明苹果树通过MdWRKY75正向调控具抗菌活性和诱导抗性的MdDEF30表达抵御壳囊孢菌侵染的分子机理。
茄科劳尔氏菌,简称青枯菌(Ralstonia solanacearum),是一种分布广泛的土传细菌病原菌,该病原菌从根部侵染植物,最终引发青枯病(Bacterial wilt disease)。青枯菌寄主范围广泛,可在200多种植物包括马铃薯、番茄、辣椒、烟草、花生等重要作物上引起毁灭性的植物病害,被列为世界上第二大细菌性植物病原菌,给全世界的农作物生产带来巨大威胁。研究并解析青枯菌与植物互作的分子机制可为青枯病防控策略的建立奠定基础。然而,目前科研中主要采用的青枯菌土壤灌根法接种方法存在实验周期长、所需植物培养空间大、且条件不容易控制等问题,限制了青枯菌与植物互作研究的开展。因此,亟需一种快速、操作简易、且结果稳定的青枯菌接种方法。为此,本文建立了一种培养皿内青枯菌接种方法(Petri-dish inoculation method),该方法具备接种后发病稳定、操作简易和实验周期短等特点,可广泛用于青枯菌与植物互作研究。为了证明该方法在青枯菌与植物互作研究中的有效性,本文利用引发植物防御作用的分子模式Pep1,拟南芥感病突变体npr1,以及具有不同毒力水平的青枯菌突变体ΔhrcV和ΔRipAC,研究了青枯菌皿内接种方法在评估植物抗病性和青枯菌致病性中的适用性和高效性。同时,我们利用皿内接种方法再现了前人对4个烟草品种的抗性评估结果,表明该方法可用于不同植物种质材料的抗性评估和筛选。鉴于此方法具有快速、操作简单、节省空间,人力和财力,以及所需接种量少的优点,该方法可用于快速大规模青枯菌突变体致病性分析以及植物对青枯菌抗性种质材料的筛选和鉴定。青枯菌皿内接种方法也可为其他土传病原菌的接种提供参考。
本研究利用Cre/loxP重组系统构建了辣椒轻型斑驳病毒 (Pepper mild mottle virus, PMMoV)的嵌合体病毒载体。然而,在验证本氏烟中Cre重组酶瞬时表达量的研究中发现Cre重组酶可诱导本氏烟叶片坏死。为了缓解Cre重组酶引起的坏死表型,对本氏烟中瞬时表达Cre重组酶的表达系统进行了优化,构建了Cre表达后自敲除的瞬时表达载体 (ploxP-Cre),有效缓解了Cre重组酶在本氏烟叶片上引起的坏死,可用于介导Cre/loxP重组系统侵染性克隆的重组。为了构建Cre/loxP重组系统的PMMoV侵染性克隆,将PMMoV基因组分段分别构建到独立的载体上获得了包含病毒基因组的载体pJM23 (1-5628 nt),pJG1024 (5629-6356 nt)通过手足口病毒 (foot-and-mouth disease virus, FMDV)2A蛋白在PMMoV外壳蛋白(coat protein, CP)氮端 (N)融合了一个绿色荧光蛋白(modified green fluorescent protein, mGFP),并分别在病毒基因组的重组区段插入2个同向的loxP位点和一半的内含子序列,在农杆菌介导下将pJM23、pJG1024和ploxP-Cre共转染本氏烟,转染8天后病毒发生了系统侵染,在系统侵染叶片中存在大小为300 nm×18 nm的杆状病毒粒子,实现了PMMoV病毒基因组在植物体内重组为功能性的病毒载体。进一步证实了Cre/loxP重组系统的PMMoV侵染性克隆与全长侵染性克隆的在转染4天后均可系统侵染,其系统叶病毒量无差别。同时该系统可用于研究不同病毒蛋白功能,通过构建番茄环纹斑点病毒 (Tomato zonate spot virus, TZSV)核壳体蛋白 (nucleocapsid, N) 基因的嵌合体病毒载体 (pJGTZSV),在本氏烟中表达了N蛋白,并实现了系统侵染。我们的研究提供了一个新的方法用于嵌合体病毒和较大基因组的病毒侵染性克隆的构建。
本研究从二倍体森林草莓基因组中鉴定出14个LOX基因。系统发育树将FvLOX基因分为9-LOX和13-LOX两个亚家族。基因重复事件分析表明,全基因组复制/片段复制和分散复制有效地促进了草莓LOX家族的扩展。QRT-PCR分析表明,FvLOX基因在不同组织中均有不同程度的表达。表达谱分析表明,FvLOX1和FvLOX8在低温胁迫下表达上调,FvLOX3和FvLOX7在干旱胁迫下表达上调,FvLOX6和FvLOX9在盐胁迫下表达上调,FvLOX2、FvLOX3和FvLOX6在SA处理下表达上调,FvLOX3、FvLOX11和FvLOX14在MeJA处理下表达上调,FvLOX4和FvLOX14在ABA处理下表达上调。启动子分析表明,FvLOX基因参与植物生长发育和胁迫响应。我们对草莓FvLOX家族进行了全基因组分析和鉴定,表征了多种参与非生物胁迫响应的FvLOX候选基因,该研究为草莓在非生物胁迫中的响应机制奠定了理论和经验基础。
DnaJ蛋白最初是在大肠杆菌中鉴定的一种大小约为41kDa的热休克蛋白,其蛋白家族是分子伴侣中最多样化的家族,在蛋白质折叠和各种生理活动的调节中扮演了重要角色,且在植物发育和胁迫应答中发挥重要作用。DnaJ家族蛋白已在许多物种中广泛研究,例如人类,果蝇,蘑菇,西红柿和拟南芥等,但其在小麦中的作用以及其与植物病毒之间的相互作用机制却鲜少有研究。在这篇文章中,我们鉴定了236个TaDnaJs,并对其保守结构域,基因结构、蛋白质基序、蛋白质结构、染色体定位和共线性以及顺式作用元件进行了全基因组分析。根据分析结果,我们将这些TaDnaJs按其结构域分成DJA、DJB和DJC三组,并从分组中随机选择了6个基因进行组织特异性分析和激素胁迫下的基因表达谱分析,结果表明TaDnaJ基因在不同组中存在组织差异表达,DJA组的基因表达集中在顶部叶片,对ABA和GA更为敏感;DJB组的基因表达水平在根和种子中最高,对ABA更为敏感;DJC组中的基因表达在小麦叶片中最高,其次是根和种子,对SA和GA最敏感。另外我们随机选择了17个基因分析植物病毒侵染后基因表达水平的变化,结果显示,在测试的17个TaDnaJ基因中,有16个基因在小麦黄花叶病毒(WYMV)侵染后呈现上调表达,这表明TaDnaJ家族可能参与了植物防御反应。随后我们通过酵母两杂交实验验证了WYMV NIa、NIb和7KD蛋白与WYMV侵染后表达水平变化最显著的TraesCS7A02G506000相互作用。在这篇文章中,我们探究了DnaJ蛋白介导的胁迫耐受性和敏感性的分子机制,DnaJ基因可能参与了植物对非生物和生物胁迫的抗性。本研究提高了对TaDnaJ基因表达谱的认识,并且为TaDnaJ家族与植物防御机制之间的研究提供了一定的研究基础。
据报道,兔戊型肝炎病毒 (HEV) 为潜在人畜共患性传染病。报道显示HEV 3型是造成兔HEV流行的主要原因。为调查戊型肝炎在肉兔中的流行情况,本研究从中国河北省的一个屠宰场收集了176份肝脏样本。RNA检测结果显示3份样本HEV-ORF2检测阳性,占样本量的1.7%。序列分析表明,3株分离株具有较高的同源性 (94.08%~98.85%),为HEV基因3型。此外,免疫组化 (IHC) 检测HEV ORF2蛋白显示,131份肝脏样本阳性,占样本量的74.4%。肝脏组织病理学观察结果显示,H.E染色的组织病理学变化主要有肝细胞变性、坏死、淋巴细胞浸润、胆管上皮细胞增生、含铁血黄素沉着等。这些结果表明,在家兔中存在戊型肝炎病毒,但兔戊肝病毒 (rHEV) 的传染性及人兔跨种传播的潜在风险有待进一步研究。