专题——苜蓿耐盐碱抗旱基因挖掘与育种

紫花苜蓿育种历史、现状与展望

张帆, 杨青川

中国农业科学 2025,58(21 ):4471 -4481. DOI:10.3864/j.issn.0578-1752.2025.21.016

摘要（540）

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PDF （537KB）（136）

紫花苜蓿（Medicago sativa subsp. sativa L.）作为全球最重要的豆科牧草，因其高产、优质及良好的适应性，在现代畜牧业和生态系统中扮演着不可替代的角色。然而，我国的紫花苜蓿产业长期面临着“种业卡脖子”的困境，其核心在于种质资源创新能力不足、优良自主品种供给率不高等问题。这一挑战的根源，不仅在于我国苜蓿育种工作起步较晚，技术体系相对薄弱，更深层次的原因在于紫花苜蓿本身复杂的遗传特性——其同源四倍体的高度杂合性与自交不亲和机制。系统梳理紫花苜蓿的育种历史，剖析当前研究现状，并展望未来生物技术育种方向，对加速我国苜蓿遗传改良具有重要的借鉴意义。紫花苜蓿的驯化与传播历史悠久，起源于外高加索地区，经“丝绸之路”引入我国，并在全球范围内扩散。其遗传多样性的极大丰富，得益于历史上不同地理来源种质的引入与种间/亚种间杂交，特别是与抗逆性优良的亚种黄花苜蓿（M. sativa subsp. falcata）的遗传渗入，为培育适应不同生态区的品种奠定了坚实的遗传基础。以美国为代表的发达国家，在苜蓿育种领域已建立起一套涵盖种质资源搜集、评价及新品种选育的完整体系，其发展历程已逾百年。然而，即便是育种强国，在1990年后其苜蓿产量提升也进入了平台期，显示出传统育种策略的潜力瓶颈。我国的苜蓿育种工作虽取得了长足进步，成功培育出如“中苜系列”“甘农系列”等一批适应性良好的品种，但整体仍面临严峻挑战。首先，品种数量相对匮乏（截至2024年登记品种128个，远少于美国的1 738个），这在很大程度上限制了针对我国多样化生态环境筛选最优品种的能力。其次，传统育种策略本身也限制了杂种优势的有效利用。以往，育种家常将不同地理来源的品种进行群体混合与轮回选择，这虽然在一定程度上聚合了优良基因，但也导致不同育种群体间的遗传背景趋于相似，从而削弱了通过杂交产生强优势后代的潜力。因此，突破传统育种方法的局限，引入高效的现代生物技术手段，已成为当前苜蓿育种的必然选择。近年来，以基因组学为核心的现代生物技术为破解紫花苜蓿育种难题带来了前所未有的机遇。我国在苜蓿基因组学基础研究领域已取得显著成就，完成了种质资源遗传分析、基因组图谱绘制、关键分子标记鉴定、优质种质资源开发等工作。这些基因组资源为从分子层面解析产量、品质、抗逆性等复杂性状的遗传调控网络提供了可能。展望未来，我国紫花苜蓿的育种工作应采取传统育种与现代生物技术相结合的策略，从源头创新走向精准设计的育种4.0阶段。整合基因组学、分子标记辅助选择、基因编辑等现代生物技术，开展精准、高效的分子设计育种，是解决我国苜蓿种业“卡脖子”问题、实现跨越式发展的核心路径。

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盐碱胁迫下的紫花苜蓿幼苗蛋白组差异分析

杨永念, 曾祥翠, 刘青松, 李如月, 龙瑞才, 陈林, 王雪, 何飞, 康俊梅, 李明娜

中国农业科学 2025,58(21 ):4512 -4527. DOI:10.3864/j.issn.0578-1752.2025.21.019

摘要（331）

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【目的】土壤盐碱化是紫花苜蓿（Medicago sativa L.）生长和产量的重要限制因素。为解析紫花苜蓿幼苗响应盐碱胁迫的分子机理，通过蛋白质组学分析，揭示盐碱胁迫下关键差异蛋白及其参与的代谢通路，为其耐盐碱机制研究提供理论依据。【方法】以中苜4号紫花苜蓿为材料，对其种子分别进行盐（30 mmol·L^-1NaCl和30 mmol·L^-1 Na₂SO₄）和碱（10 mmol·L^-1 Na₂CO₃和10 mmol·L^-1 NaHCO₃）处理，利用TMT标记结合液相色谱-质谱联用技术，对胁迫后的幼苗进行了蛋白组差异分析。【结果】蛋白组共鉴定到6 829个蛋白，其中碱、盐胁迫下分别有489个（274个上调，215个下调）和376个差异蛋白（218个上调，158个下调）。GO注释分析发现，差异蛋白主要注释于细胞代谢、有机物代谢、胁迫响应等生物过程，以及细胞内细胞器、细胞质和膜等细胞组分。KEGG通路富集分析发现，碱胁迫下差异蛋白显著富集于光合作用、苯丙烷生物合成和异黄酮生物合成等通路，盐胁迫下差异蛋白主要富集于光合作用、异黄酮生物合成及谷胱甘肽代谢等通路。对富集到的蛋白进一步分析发现，紫花苜蓿幼苗通过上调异黄酮生物合成途径关键酶（HI4OMT和CYP81E），增强抗氧化能力和渗透调节能力，从而抵御盐碱胁迫。HI4OMT和CYP81E等关键酶的上调显著促进了异黄酮类化合物的积累，帮助植物清除活性氧并维持细胞稳态。此外，苯丙烷生物合成途径关键酶（PAL、CAD和COMT）在碱胁迫下显著上调，促进了木质素和类黄酮的合成，增强了细胞壁强度和抗氧化能力，帮助植物适应高pH环境，以应对碱胁迫。在盐胁迫下，紫花苜蓿幼苗通过上调谷胱甘肽代谢途径关键酶（PRDX6、GPX和GST），维持氧化还原稳态并清除活性氧，增强对盐胁迫的耐受性。【结论】通过蛋白组学分析，揭示了紫花苜蓿幼苗响应盐碱胁迫的关键蛋白及代谢通路，为解析紫花苜蓿耐盐碱分子机制提供了重要的理论依据，同时也为紫花苜蓿的耐盐碱育种提供了潜在的候选蛋白和代谢通路。后续可进一步验证这些关键蛋白的功能，并通过一系列生物育种的技术手段，培育具有更高耐盐碱性的紫花苜蓿新品种，以应对土壤盐碱化对苜蓿生产带来的挑战。

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基于转录组和WGCNA的直立型花苜蓿抗旱关键基因识别

穆赢通, 路景诗, 张雨桐, 石凤翎

中国农业科学 2025,58(21 ):4528 -4543. DOI:10.3864/j.issn.0578-1752.2025.21.020

摘要（318）

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【背景】干旱胁迫是限制全球农业生产力的主要非生物因子之一。系统解析植物在干旱及复水过程中的转录调控机制，对于提升作物抗旱性及实现分子育种具有重要理论与实践意义。花苜蓿作为多年生豆科牧草，具有优良的生态适应能力和抗旱潜力。【目的】通过基于转录组分析与共表达网络构建，识别直立型花苜蓿对干旱胁迫及复水响应的关键调控模块及核心功能基因，解析其潜在分子机制。【方法】设置4个处理阶段，包括正常水分处理（A组）、干旱胁迫中期（B组）、干旱胁迫后期（C组）和复水处理阶段（D组），以模拟花苜蓿在干旱-复水过程中的生理响应状态。利用高通量转录组测序获取基因表达数据，结合加权基因共表达网络分析（weighted gene co-expression network analysis，WGCNA）构建基因共表达模块。通过主成分分析（principal component analysis， PCA）和KEGG通路富集分析揭示基因表达的变异趋势与功能富集规律，进一步筛选与抗旱性密切相关的模块及核心基因。最终选取MEmagenta与MEdarkgreen模块中的6个核心基因进行qRT-PCR验证，以评估转录组数据的表达一致性与模块的生物学可信度。【结果】PCA分析显示，不同处理组样本在PC1与PC2维度上明显分离，表明干旱及复水处理对花苜蓿基因表达具有阶段性影响。差异表达分析结果显示，干旱中期（B组）诱导的上调与下调基因数量最多，反映出植物在早期迅速激活应答机制；干旱后期（C组）差异表达数量有所下降，但脂肪酸降解、糖代谢等代谢路径显著富集，提示植物向稳态调控方向转变；复水阶段（D组）大部分基因表达水平趋于恢复，部分信号转导和防御通路仍保持活跃状态，反映其持续的调节能力。WGCNA分析识别出4个与处理条件显著相关的模块（|r| > 0.6），其中MEdarkgreen模块（r = 0.93）在干旱后期高表达，富集于MAPK信号通路、内质网应激、脂质代谢与黄酮类合成等路径。模块核心基因BZIP17与IRE1B分别调控蛋白质折叠、转录重编程及内质网稳态，可能在长期胁迫适应中发挥重要作用。MEmagenta模块（r = 0.82）在正常水分状态下高度表达，富集于ABA与JA信号通路、黄酮代谢等路径，核心基因ABF4与MYC2分别参与气孔调控与次生代谢调节，是干旱应答启动阶段的重要调控因子。此外，NAC072、CLPD等基因亦参与叶绿体蛋白稳态与活性氧清除等过程，进一步增强植物的胁迫缓冲能力。KEGG功能富集结果与模块功能保持高度一致性，验证了模块生物学注释的可靠性。qRT-PCR验证结果表明，所选6个核心基因在干旱中后期（B、C组）显著上调，复水后（D组）表达普遍下降，整体表达趋势与转录组数据一致，进一步支持模块识别与功能预测的准确性。【结论】本研究揭示了花苜蓿在干旱胁迫及复水过程中转录水平的动态调控特征。通过共表达网络分析，识别出两个与抗旱适应性密切相关的关键模块MEmagenta与MEdarkgreen，筛选得到ABF4、MYC2、BZIP17和IRE1B等关键调控因子。这些基因在信号转导、代谢调控与胁迫适应中发挥核心作用，代表了花苜蓿在应对干旱过程中的潜在分子机制。研究为进一步解析牧草的抗旱分子基础及其分子育种提供了理论支撑与候选靶标。

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紫花苜蓿MsKTI3基因克隆及耐盐功能分析

吕缓缓, 李如月, 刘青松, 许蕾, 徐嫣然, 于浩洁, 郭长虹, 龙瑞才

中国农业科学 2025,58(21 ):4497 -4511. DOI:10.3864/j.issn.0578-1752.2025.21.018

摘要（285）

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PDF （4343KB）（57）

【目的】盐胁迫会对植物细胞造成严重损害，抑制植物生长发育，从而导致产量大幅下降。Kunitz型胰蛋白酶抑制剂（kunitz trypsin inhibitor，KTI）是一类具有代表性的丝氨酸蛋白酶抑制剂，在植物中主要参与调控生长发育、抵抗病虫害和非生物胁迫等生理过程。挖掘并解析紫花苜蓿KTI调控盐胁迫响应的分子机制，有助于为紫花苜蓿耐盐分子育种提供新的候选基因。【方法】从紫花苜蓿‘中苜4号’中克隆一个盐诱导KTI，命名为MsKTI3；利用生物信息学方法，深入分析MsKTI3及其编码蛋白的结构特征，并与其他物种的同源基因开展序列比对与进化分析；采用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）方法分析MsKTI3在不同组织和胁迫下的表达模式；利用烟草瞬时表达系统对MsKTI3蛋白亚细胞定位进行分析；构建MsKTI3过表达载体，利用根癌农杆菌介导方法，成功获得过表达的转基因拟南芥株系；利用发根农杆菌介导法，获得根中过表达的紫花苜蓿植株，对相关株系进行盐胁迫条件下的表型分析和生理指标测定。【结果】生物信息学分析发现MsKTI3编码区序列（CDS）全长为627 bp，编码208个氨基酸，相对分子量为23 220.81Da，理论等电点为8.57。系统进化树分析表明MsKTI3与蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）MtKTI3的氨基酸序列具有较高的同源性，达到97%。表达模式进行分析结果表明MsKTI3在根中表达量最高，在NaCl（200 mmol·L^-1）和ABA（150 μmol·L^-1）胁迫初期表达量总体呈现上调趋势。亚细胞定位结果表明MsKTI3蛋白定位于质膜中。利用农杆菌介导的方法获得12个过表达拟南芥株系。盐胁迫条件下，过表达MsKTI3拟南芥株系发芽率高于野生型，幼苗损伤程度低于野生型，过表达植株相对电导率（relative electrolyte leakage，REL）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量显著低于野生型（P<0.05），叶绿素（chlorophyll，Chl）含量和过氧化氢酶（catalase，CAT）活性显著高于野生型（P<0.05）。通过发根农杆菌将MsKTI3转入紫花苜蓿根中，表型分析发现根中过表达MsKTI3能增强紫花苜蓿耐盐性，根系过表达植株的CAT活性高于对照植株。【结论】MsKTI3在盐胁迫过程中发挥正向调控作用，过表达MsKTI3可提高植物耐盐性。

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5‑AzaC缓解紫花苜蓿盐碱胁迫的生理效应及其对DNA甲基化酶基因表达的影响

高荣, 李恒宇, 陈丽娟, 马晖玲

中国农业科学 2025,58(21 ):4482 -4496. DOI:10.3864/j.issn.0578-1752.2025.21.017

摘要（260）

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【背景】土壤盐碱化是全球农业生产面临的主要生态问题之一，严重限制了作物的正常生长、产量形成及品质提升。紫花苜蓿（Medicago sativa）作为重要的多年生豆科牧草，生产力受到盐碱胁迫的严重制约，其应对盐碱胁迫的表观遗传学调控机制尚不清楚。DNA甲基化作为一种关键的表观遗传修饰，在植物适应非生物胁迫中发挥重要作用。【目的】在系统鉴定紫花苜蓿中DNA甲基化相关基因家族成员，解析其在盐碱胁迫下表达特征的基础上，通过施用DNA甲基化抑制剂5-氮杂胞苷（5-AzaC），探讨DNA甲基化在苜蓿耐盐碱性形成过程中的作用机制，以期为耐盐碱苜蓿种质改良提供理论依据。【方法】基于紫花苜蓿参考基因组，对DNA甲基转移酶和去甲基酶基因进行全基因组鉴定，并结合系统发育分析与保守结构域注释推测其功能。采用RT-qPCR检测这些基因在盐碱胁迫下的表达模式。以甘农3号为材料，在水培条件下设置不同浓度的5-AzaC预处理，筛选最佳浓度后，进一步测定植株的生长、生理和光合相关指标，以评价5-AzaC对紫花苜蓿耐盐碱性的调控作用。【结果】共鉴定出紫花苜蓿中13个DNA甲基转移酶基因和4个DNA去甲基酶基因，相关蛋白均定位于细胞核，且保守结构域完整。表达分析表明，MsCMT4、MsCMT6、MsCMT8和MsDML2在盐碱胁迫下显著上调，表明DNA甲基化与去甲基化过程均参与胁迫响应。生理测定结果显示，100 μmol·L^-1 5-AzaC显著缓解了盐碱胁迫造成的植株生长抑制，株高、鲜重和干重分别较对照提高12.62%、23.50%和18.67%。在光合色素代谢方面，5-AzaC有效抑制了叶绿素降解相关基因PAO、CAO和NYC的表达，减缓了色素降解。光合参数分析表明，5-AzaC处理显著提升了净光合速率（Pn）、气孔导度（Gs）、蒸腾速率（Tr），并增强了光系统II的量子效率（YII）和光化学猝灭系数（qP），表明其有助于维持光系统稳定性和高效性。在渗透调节方面，5-AzaC促进了可溶性糖的积累（增加37.21%），而对可溶性蛋白无显著影响。活性氧（ROS）分析显示，5-AzaC处理显著降低了H₂O₂和O₂^-·含量（分别下降22.8%和35.8%），同时超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）活性分别提高13.58%和21.82%，表明其能够通过增强抗氧化系统缓解氧化损伤。【结论】本研究系统解析了紫花苜蓿中DNA甲基化相关基因的家族组成及其在盐碱胁迫下的响应特征，揭示了DNA甲基化在紫花苜蓿耐盐碱性形成中的关键作用。外源施用5-AzaC可通过维持光合系统稳定、提升光合效率、促进渗透调节物质积累并增强ROS清除能力，从而有效改善紫花苜蓿的盐碱耐性。为阐释牧草应对非生物胁迫的表观遗传学机制提供了新的试验证据，并为耐盐碱苜蓿种质改良与利用提供了理论参考。

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磷转运蛋白MsPT5调控紫花苜蓿磷吸收利用

黄红梅, 王思琦, 杨青川, 郭长虹, 王雪

中国农业科学 2025,58(21 ):4544 -4556. DOI:10.3864/j.issn.0578-1752.2025.21.021

摘要（230）

HTML （19）

PDF （3235KB）（46）

【目的】探究紫花苜蓿磷转运体MsPT5的功能，为解析苜蓿响应低磷胁迫及培育磷营养高效紫花苜蓿提供理论依据和基因资源。【方法】以紫花苜蓿为材料分别进行足磷和低磷胁迫处理,选取根系进行转录组测序，利用加权基因相关性网络分析筛选苜蓿低磷胁迫响应关键基因MsPT5；克隆获得MsPT5的CDS序列，利用DNAMAN和TMHMM在线网站对MsPT5蛋白跨膜结构域进行分析；以Super1300:GFP植物表达载体为骨架，通过同源重组法构建过表达载体Super1300:MsPT5-GFP；采用冻融法将重组载体Super1300:MsPT5-GFP转化至农杆菌GV3101，将农杆菌注射到烟草中进行亚细胞定位观察；通过农杆菌介导的花序侵染法将Super1300:MsPT5-GFP转入拟南芥，筛选纯合株系进行无机磷含量测定、生物量统计和砷酸盐表型检测；利用组织培养的方法获得MsPT5转基因紫花苜蓿，筛选阳性植株进行生物量统计、磷含量和蛋白质含量测定。【结果】MsPT5为PHT1家族成员，具有12个跨膜结构域，定位于细胞质膜；拟南芥生理指标测定显示，MsPT5过量表达株系无机磷含量分别为23.02和22.30 nmol·mg^-1，野生型对照无机磷含量为19.97 nmol·mg^-1。MsPT5过量表达株系生物量分别为0.047 和0.054 g/plant，野生型对照生物量为0.026 g/plant。MsPT5过量表达能够提高拟南芥无机磷含量和生物量；砷酸盐表型检测结果显示，MsPT5过表达材料具有明显砷毒害表型；紫花苜蓿生理指标测定显示，MsPT5转基因紫花苜蓿生物量分别为19.39 g/plant、18.62 g/plant、16.65 g/plant，野生型对照生物量为15.14 g/plant。MsPT5转基因紫花苜蓿磷含量分别为0.37%、0.39%、0.38%，野生型对照磷含量为0.30%。MsPT5转基因紫花苜蓿蛋白质含量分别为21.37%、21.54%、19.91%，野生型对照蛋白质含量为18.04%。MsPT5转基因紫花苜蓿生物量显著提高，同时磷含量和蛋白质含量显著高于对照。【结论】MsPT5是苜蓿应对低磷胁迫过程中的重要基因，过量表达MsPT5可提高植物磷吸收能力和磷含量，提高苜蓿产量和品质，MsPT5在培育高产优质苜蓿品种中具有重要应用价值。

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苜蓿耐盐碱抗旱基因挖掘与育种

李明娜, 龙瑞才, 杨青川

中国农业科学 2025,58(21 ):4467 -4470. DOI:10.3864/j.issn.0578-1752.2025.21.015

摘要（203）

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PDF （260KB）（63）

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