专题——棉花基因功能研究与育种
【目的】棉花纤维是棉花的主要经济产品，是由胚珠外珠被表皮细胞经极性伸长和次生壁加厚而成的单细胞。棉花纤维细胞是最长的植物细胞之一，是研究植物细胞生长发育的理想材料。鉴定纤维细胞特异或优势表达启动子可为纤维发育的基础研究提供控制目标基因表达的调控序列，为改良纤维性状的分子育种提供依据。【方法】克隆纤维细胞优势表达基因GhSLD1的启动子，通过启动子序列分析网站PlantCARE分析克隆序列中包含的重要顺式调控元件。根据部分重要顺式调控元件的分布，对克隆启动子片段进行5′-端删除，共获得4个启动子片段，并构建了相应的植物表达载体。利用构建的植物表达载体进行烟草和棉花的遗传转化，通过转基因烟草和棉花的分子鉴定明确转基因植株。并检测转基因植株不同组织器官、纤维细胞不同发育时期的GUS活性。【结果】克隆获得最长启动子片段为2 900 bp，除了包含多个启动子必备转录调控元件外，还包含多个脱落酸响应元件、厌氧诱导元件、茉莉酸甲酯响应元件、油菜素内酯响应元件、种子特异调控元件、胁迫响应元件和MYB转录因子结合位点。通过5′-端删除获得长度分别为2 900（GhSLD-P1）、2 178（GhSLD1-P2）、1 657（GhSLD1-P3）和1 232 bp（GhSLD-P4）4个启动子片段，经分子鉴定，获得4个片段的转基因烟草，在转基因烟草中，GhSLD-P1、GhSLD1-P2和GhSLD1-P3不表达，而GhSLD-P4广泛表达，表达强度与CaMV 35S启动子相似。GhSLD1-P3和GhSLD-P4差异序列中包含4个脱落酸响应元件、2个油菜素内酯响应元件和3个MYB结合位点，这些顺式调控元件可能与GhSLD1-P1、GhSLD1-P2和GhSLD1-P3在转基因烟草中不表达有一定关系。经分子鉴定，获得GhSLD1-P2转基因棉花。GhSLD1-P2在转基因棉花纤维中优势表达，在转基因花粉中有较低的表达，在其他组织器官中几乎不表达。在纤维细胞的生长发育过程中，GhSLD1-P2在纤维细胞早期生长阶段（5 DPA）表达较低，在纤维细胞伸长期（10—15 DPA）表达水平相对较高，在纤维细胞次生壁合成期（20—30 DPA）表达水平有所降低。【结论】GhSLD1-P4启动子是一个广泛表达启动子，GhSLD1-P2启动子是一个纤维细胞优势表达启动子，在纤维细胞伸长期表达量相对较高。可应用于棉花纤维发育相关基因的功能研究和改良纤维性状的分子育种。
【目的】全基因组范围内探究棉花NLP转录因子的结构特点及进化特征，深入了解棉花NLP转录因子表达模式，为后续NLP的功能研究和利用奠定基础。【方法】采用BLASTP和HMMsearch 2种策略进行搜索，鉴定亚洲棉、雷蒙德氏棉、海岛棉、陆地棉4种棉花全基因组范围内的NLP转录因子家族成员。对确认后的棉花NLP家族成员进一步展开生物信息学分析，利用在线软件Expasy对分子量、理论等电点等理化性质进行预测；使用MEGA 7软件构建系统进化树；通过网站MEME进行蛋白保守基序分析；运用在线软件GSDS 2.0分析基因结构；TBtools进行染色体定位绘制；McscanX进行棉花NLP家族复制基因分析；利用PlantCARE网站预测棉花NLP基因家族启动子元件；通过TBtools绘制不同组织及非生物胁迫下棉花NLP基因表达热图，分析组织表达特性和响应非生物胁迫的特征。通过RT-qPCR分析缺氮和复氮处理后棉花NLP基因的表达情况。【结果】从亚洲棉、雷蒙德氏棉、海岛棉、陆地棉蛋白数据库中分别筛选出11、11、21和22个NLP转录因子成员，家族蛋白序列长度为693—996个氨基酸，相对分子质量为76.92—110.02 kDa，理论等电点为5.13—7.77，亚细胞定位几乎均定位于细胞核中，NLP基因启动子区发现大量激素响应和逆境响应顺式作用元件。系统进化分析将棉花NLP蛋白分为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ组，基因复制分析发现片段复制是NLP基因在棉花中扩张的主要方式。Ka/Ks均小于1显示棉花中NLP基因进化主要经历纯化选择。表达分析结果也证实棉花GHNLPs响应氮饥饿和复氮过程。【结论】从亚洲棉、雷蒙德氏棉、海岛棉、陆地棉中分别鉴定获得11、11、21和22个NLP转录因子成员，它们之间具有较高的保守性，又有一定程度的差异。陆地棉GHNLPs在缺氮及复氮处理过程中表达量发生显著变化，可能在棉花响应硝酸盐过程中具有一定作用。
【目的】肉桂醇脱氢酶（CAD）是木质素合成途径中的关键酶，在增强植物机械强度、抵御病原菌入侵等方面发挥重要作用。鉴定海岛棉GbCAD、GbCAD-LIKE（GbCADL）基因家族成员，并对其表达特征及其在黄萎病抗性中的作用进行分析，为棉花抗黄萎病机制的解析及抗病育种提供参考。【方法】利用生物信息学方法对海岛棉GbCAD、GbCADL基因家族成员进行鉴定，并对其染色体定位、系统发育关系、基因结构、启动子顺式元件的预测进行系统分析。通过获得公开释放的转录组数据和实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）分析GbCAD基因及GbCADL基因的表达特征。利用病毒诱导的基因沉默（VIGS）技术对GbCAD基因及GbCADL基因进行功能分析。【结果】从海岛棉中鉴定到25个GbCAD基因（分布在10条染色体）和34个GbCADL基因（分布在17条染色体）。GbCAD基因分为3个亚组，GbCADL基因分为4个亚组，同一个组内基因含有相似的外显子-内含子结构和保守结构域。GbCAD基因和GbCADL基因具有不同的转录表达特征，其启动子中含有多种激素和胁迫响应元件。转录组数据和qRT-PCR显示，GbCAD10A/D、GbCADL4A/D、GbCADL5A/D、GbCADL6A/D、GbCADL7A/D的表达受大丽轮枝菌诱导，尤其是GbCAD10A/D、GbCADL4A/D、GbCADL6A/D、GbCADL7A/D的表达在大丽轮枝菌处理后显著增加。利用VIGS技术，将显著受大丽轮枝菌诱导表达的GbCAD10A/D、GbCADL4A/D、GbCADL6A/D、GbCADL7A/D分别在棉花中沉默，分析VIGS株系对大丽轮枝菌抗性的变化。结果显示，与对照植株相比，VIGS株系对大丽轮枝菌的抗性显著降低。二氨基联苯胺（DAB）染色结果显示，在未受到黄萎病侵染时，VIGS植株和对照植株的染色程度无显著差异；在大丽轮枝菌处理6 h后，与对照植株相比，沉默株系GbCAD10A/D、GbCADL4A/D、GbCADL6A/D、GbCADL7A/D均表现出较深的着色，表明在沉默株系中有较高的活性氧累积。茎的切片结果显示，大丽轮枝菌处理后，TRV:GbCAD10A/D、TRV:GbCADL4A/D、TRV:GbCADL6A/D、TRV:GbCADL7A/D沉默株系的茎维管组织表现出明显的深褐色，表明其对大丽轮枝菌的抗性显著降低。【结论】抑制GbCAD10A/D、GbCADL4A/D、GbCADL6A/D、GbCADL7A/D的表达可以显著降低棉花对大丽轮枝菌的抗性。
【目的】通过克隆陆地棉GhCPR5，分析其蛋白结构、表达模式和生物学功能，探究其在棉花响应黄萎病菌与灰霉病菌侵染中的功能和作用机制，为棉花抗病机制研究和育种提供理论基础和候选基因。【方法】根据棉花响应黄萎病菌侵染的转录组数据筛选到GhCPR5，并从陆地棉TM-1中克隆获得GhCPR5的全长编码序列。利用生物信息学技术分析GhCPR5的保守结构域、蛋白结构特征和同源基因的系统进化关系；利用实时荧光定量PCR（qPCR）分析GhCPR5在棉花根、茎、叶、胚珠、纤维、花瓣中的表达模式和黄萎病菌诱导的表达模式；构建病毒诱导的GhCPR5沉默载体TRV:CPR5，利用农杆菌介导的瞬时转化方法创建GhCPR5抑制表达植株，并借助RT-PCR和qPCR技术检测GhCPR5的干涉效率。对TRV:00和TRV:CPR5植株进行黄萎病菌和灰霉病菌接种，观察比较TRV:00和TRV:CPR5植株对病原菌的抗性差异；利用qPCR检测TRV:00和TRV:CPR5植株中防御相关基因的表达量，分析GhCPR5的作用机制。【结果】从陆地棉TM-1中克隆获得GhCPR5，其CDS全长1 683 bp，编码560个氨基酸，蛋白质相对分子量为62.883 kDa，等电点为9.01。多重序列比对和进化树分析显示，GhCPR5与榴莲、可可等物种CPR5同源性较高。此外，GhCPR5与不同物种CPR5的C端蛋白结构高度保守，含有4—5个跨膜结构域。GhCPR5在棉花幼苗真叶中的表达量最高，茎中表达量最低，且其表达受黄萎病菌诱导。在正常条件下，GhCPR5抑制表达植株TRV:CPR5和对照植株TRV:00在发育上无明显差异。但是，接种黄萎病菌后，TRV:CPR5植株对黄萎病菌表现敏感，发病率和病情指数显著高于TRV:00植株。黄萎病菌和灰霉病菌的离体叶片接种和台盼蓝染色结果显示，TRV:CPR5叶片上的病斑面积显著高于TRV:00叶片，说明下调GhCPR5表达降低了棉花对黄萎病菌和灰霉病菌的抗性。此外，GhCPR5抑制植株体内JAZ1表达量显著上升，而PR3、PR4和PR5的表达量显著下降。【结论】GhCPR5正调控棉花抗病性，下调GhCPR5表达可显著降低棉花对黄萎病菌和灰霉病菌的抗性。
