非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)引起的家猪和野猪的一种急性、烈性、高度接触性传染病,发病率和致死率可高达100%,是全球危害猪群最严重的传染病之一,严重威胁
着全球养猪业、食品安全和经济发展。
自2018年8月中国首次爆发ASF疫情至2021年,高毒力基因II型、低毒力基因II型和基因I型三种不同类型的ASFV陆续被报道。这使得ASFV感染的鉴别诊断更具挑战性。截止目前,仍无有效的预防疫苗和特效的治疗药物,因此,能够明确区分基因I型和II型ASFV的鉴别诊断方法对于ASF的有效预防和控制至关重要。在此,我们基于基因I型和II型ASFV编码P72蛋白B646L基因C端的两个单核苷酸多态性(SNP)位点,利用突变阻滞扩增系统(ARMS)和定量实时PCR(qPCR)技术开发了一种双重ARMS-qPCR方法。进一步研究显示,该方法标准曲线的R2值在0.992 - 0.999,线性关系良好;与PRRSV、CSFV、PRV、PCV2、PEDV、TGEV 和 PoRV 七种病原无交叉反应,具有较高的特异性;能够稳定的检测含有10个拷贝数的基因I型和II型ASFV B646L基因的标准品质粒,敏感性较好;组间和组内变异系数均小于2.2%,重复性良好。此外,我们用18个基因I型和18个基因II型ASFV感染样本,包括血液、口腔和直肠拭子、组织和细胞培养物对其进一步的验证,并与动物世界卫生组织(WOAH)推荐的qPCR方法进行比对。结果显示,ARMS-qPCR方法成功鉴别诊断出36个基因I型和II型ASFV感染样本,且与WOAH推荐的qPCR方法检测的结果一致。因此,我们建立的ARMS-qPCR方法可用于检测和区分基因I型和基因II型