对于某些性成熟昆虫(包括褐飞虱)而言,腹部振动(abdominal vibration,AV)是交配过程的启动信号,对成功交配至关重要。目前,关于调控AV的遗传和分子机制的研究很少。我们以往与AV相关的转录组学研究表明,肌抑制肽(myoinhibitory peptide,NlMIP)是调控雌性褐飞虱AV的潜在基因,但其对AV的调控机制尚未报道。本文证实了NlMIP参与调控雌性褐飞虱的AV和交配行为。当NlMIP的敲低效率为59.00%时,雌性褐飞虱在1小时内产生AV的频率和交配成功率分别下降了38.89%和61.11%。此外,6条NlMIP成熟肽也能够调控雌性褐飞虱AV的产生及其交配行为,其中NlMIP2的作用最强。基于系统发育树分析和NlMIP成熟肽能有效激活A家族神经肽G蛋白偶联受体10(A-family neuropeptide GPCR 10,NlA10)的结果表明NlA10是NlMIP的潜在受体。NlA10被敲低后,雌性褐飞虱1小时内产生AV的频率和交配成功率分别下降了28.89%和43.33%。当NlA10被NlMIP2激活时,NlA10偶联到Gαi/q信号通路,从而抑制下游AC/cAMP/PKA,并激活PLC/Ca2+/PKC信号通路,进而级联激活MEK1/2介导ERK1/2的磷酸化,最终调控雌性褐飞虱的AV。这些结果为通过干扰雌性褐飞虱的AV进行害虫防治提供了依据。
蔗糖非发酵相关蛋白激酶1(SnRK1)是一类重要的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,广泛参与了植物的生长发育,并通过代谢及生理过程参与植物对生物与非生物胁迫的应答,同时在植物的碳水化合物分布及糖信号转导中也发挥着重要作用。本研究通过序列比对,从高粱基因组中鉴定到8个SnRK1亚基编码基因,其中3个编码α亚基(SnRK1α1 - SnRK1α3)、3个编码β亚基(SnRK1β1 - SnRK1β3),以及编码γ (SnRK1γ)和βγ(SnRK1βγ)亚基的编码基因各1个。这8个高粱SnRK1基因分布于第1-3、第7、第9等5条染色体,与来自玉米、水稻的SnRK1基因存在共线性,并且这些基因的编码产物在相同亚基上表现出了高度的同源性。基于qRT-PCR的分析结果显示,在8个高粱SnRK1基因中,除SnRK1α3在籽粒中低表达以及SnRK1β2在穗中高表达外,其他基因在其他组织中均表现出相似的表达特性。基于高粱叶片原生质体的亚细胞定位结果表明,α1、α2、α3、γ这4个亚基主要定位于细胞器,而在细胞膜和部分细胞器上则可以检测到β1、β2、β3、及βγ这4个亚基的定位信号。此外,酵母双杂交分析发现,8个高粱SnRK1亚基存在α1-β2-βγ、α2-β3-γ、α3-β3-γ等3种不同的组合模式。这些研究结果,为后续高粱SnRK1亚基的功能解析等研究奠定了良好基础。
由核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)引起的豌豆菌核病是我国常见的豌豆病害。然而,我们近期在重庆和四川调查中发现,引起豌豆菌核病的病原菌可有多个核盘菌种。为此,我们对引起重庆和四川豌豆菌核病的病原菌种进行鉴定,以期为病害防控及抗病育种奠定基础。利用常规组织分离方法对采自重庆永川与合川、四川仪陇的病株及菌核进行病原菌分离,对获得的类似核盘菌的真菌分离物用PDA(potato dextrose agar)培养基培养,观察并测量菌落形态、生长速率与菌核大小。利用核糖体基因内转录区(rDNA-ITS)序列和种特异性分子标记进行分离物的分子鉴定。rDNA-ITS序列采用真菌通用引物ITS4/ITS5对分离物基因组DNA进行PCR扩增,种特异性分子标记鉴定分别利用核盘菌、小核盘菌(S. minor)和三叶草核盘菌(S. trifoliorum)特异性引物SMLcc2F/R、SSasprF/R与STCadF/ R对分离物基因组DNA进行PCR扩增,系统发育分析选取10个代表分离物进行ITS序列测序和采用Mega X软件中非加权组平均法(UPGMA)构建系统发育树。致病性测定采用菌丝块接种豌豆植株茎秆方法进行。菌落生长速率和菌核大小差异可将30个分离物区分为“快速生长-中菌核”、“中速生长-小菌核”和“慢速生长-大菌核”3中类型,分别有6个、7个和17个分离物,与已报道的核盘菌属中的核盘菌、小核盘菌和三叶草核盘菌的类似。ITS序列扩增片段将30个分离物分为2个带型,10个代表分离物进一步的系统发育分析表明,2个分离物与小核盘菌(KY550019、MN421822)聚在同一分支,2个分离物与核盘菌(MN216247、MK734068和MF776031)聚在同一分支,6个分离物与三叶草核盘菌(AY187070、AY547267)聚在同一分支。核盘菌种特异性引物扩增结果表明,30个分离物中分别有6、7和17个分离物扩增出小核盘菌、核盘菌和三叶草核盘菌的目标条带。综合形态和分子特征结果,我们确定30个分离物中有6为小核盘菌、7个为核盘菌和17为三叶草核盘菌。致病性测定结果表明,30个分离物对2个豌豆品种均具有致病性,病害症状与田间自然发病症状相似,且从感病植物中分离出病原菌分离物与接种分离物相同。本研究证明重庆市和四川省部分地区的豌豆菌核病有小核盘菌、核盘菌和三叶草核盘菌3种病原菌,其中小核盘菌和三叶草核盘菌引起豌豆菌核病是在我国西南地区首次报道。
由寄生疫霉(Phytophthora parasitica)引起的柑橘根腐病是柑橘生产上普遍发生、对柑橘危害较为严重的一种病害。本研究的目的是建立一种简易快速的结合侧流层析技术判定结果的重组酶聚合酶扩增(lateral flow strip-based recombinase polymerase amplification, LF-RPA)方法检测寄生疫霉,为诊断和防治寄生疫霉引起的柑橘根腐病提供技术支撑。以Ypt1基因为检测的靶标序列,通过多序列比对分析,设计寄生疫霉的特异性引物和探针,建立并优化LF-RPA检测方法,并与简易核酸提取技术相结合,对该检测方法的特异性、灵敏度和实际应用效果进行评估。对LF-RPA体系中的温度、引物和探针比例、时间进行了优化,使得LF-RPA在40°C孵育温度下反应20分钟后即可肉眼判断检测结果。特异性试验中,LF-RPA能特异性地检测出不同来源的寄生疫霉,而其它亲缘关系相近的卵菌病原菌均未检测出。灵敏度试验结果显示,LF-RPA的最低检测灵敏度为1 pg。为了使LF-RPA检测方法更适宜基层使用,对四种不同的简易核酸提取技术进行了比较评估,发现基于PEG-NaOH的简易核酸提取技术更适合本研究。将LF-RPA与PEG-NaOH核酸提取技术相结合,不需要特定的仪器设备,只需要能维持40°C的保温杯,即可在30分钟内完成从发病植株的核酸提取到结果判定的整个检测过程。利用该方法,成功地从接种寄生疫霉的柑橘叶片、枝条和果实上检测出寄生疫霉;此外也从田间采集的10份柑橘发病样品中检测出其中3份样品含有寄生疫霉本研究成功建立了一种针对寄生疫霉的LF-RPA快速检测方法,该方法与简易核酸提取技术相结合,非常适宜于基层使用,为柑橘根腐病的快速诊断奠定了技术基础。