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猪瘟病毒中等致病力毒株在体内的动态分布
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| 孙骏翔,张乾义,徐和敏,王团结,徐璐,邹兴启,朱元源,李翠,夏应菊,徐嫄,陈锴,张玉杰,赵启祖,王琴 |
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中国农业科学
2018,51(21
):4146
-4156. DOI:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.21.013
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摘要
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【目的】目前我国猪瘟的感染类型主要是亚急性感染及慢性感染,研究猪瘟亚急性感染后体内病毒RNA和蛋白的分布情况,有助于阐述亚急性病程猪瘟病毒的复制分布规律,为猪瘟的早期诊断和预防奠定重要基础。【方法】成功以中等致病力毒株（HeBHH1/95）构建了亚急性猪瘟感染动物模型,分别采集感染后第1、3、6、10、13、20、24、28 天感染猪的十二指肠、脾脏、肾脏、肺脏、胰、回盲瓣6种组织器官并进行连续切片。应用建立的猪瘟病毒可视化原位杂交技术（ViewRNA ISH ）研究感染组织中病毒RNA动态分布,同时采用免疫组化（IHC）、H.E染色分别检测感染组织中蛋白的分布情况及其组织损伤位置,从而在病毒核酸和蛋白水平系统性的观察病毒的分布情况。【结果】采用Mittelholzer方法进行临床计分发现感染后6—10 d感染猪猪瘟临床症状记分迅速增加,11—26 d感染猪临床记分一直维持在15分左右,直到28 d临床记分达到最高值20分。感染后8—10 d感染猪体温呈上升趋势;13—24 d感染猪体温呈现稽留热,持续在40℃左右;此后体温开始回落,至濒死前体温回落至39.5℃左右。应用CSFV ViewRNA ISH感染后第1 天在十二指肠绒毛杯状细胞及胰腺的腺泡、回盲瓣的固有层、肾脏的肾小管等这些具有分泌功能的结构组织周围检测到病毒RNA阳性信号;感染后第3天在肺脏的细支气管和脾脏的椭圆体周围检测到病毒RNA阳性信号;第13天阳性信号富集显著,至第28天病毒RNA广泛分布在脾脏动脉周围淋巴鞘及胰腺腺泡和肾小管等组织周围。采用IHC和H.E染色法在连续切片的相似视野下验证ViewRNA ISH检测结果,发现感染后第1天十二指肠、胰腺、肾脏亦可检测到病毒蛋白阳性信号和相应组织的病理变化,但回盲瓣在第3天检测到病毒蛋白阳性信号和组织的病理变化,在之后的病程中各组织中病毒RNA、蛋白定位情况趋于一致,第28天病毒蛋白集中在脾脏动脉周围淋巴鞘及胰腺腺泡等周围。【结论】采用ViewRNA ISH方法在回盲瓣中可以早于IHC发现猪瘟病毒,各个组织中ViewRNA ISH检测到病毒部位与IHC检测到病毒部位及H.E检测到的组织损伤部位相似,表明ViewRNA ISH具有良好的灵敏性可以应用于检测感染早期病毒在组织中的分布。前期病毒RNA通常在胰腺腺泡、肾小管及脾脏的椭圆体周围复制,在感染中期病毒在各组织结构中大量增殖,感染后期病毒不仅在淋巴细胞周围富集,还易在具有分泌功能的部位复制增殖。
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多维度评价
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PK-15细胞中与CSFV感染相关的microRNAs筛选及 miR-214的功能研究
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| 邓少锋,叶佐东,范双旗,陈金顶,张静远,朱梦娇,赵明秋 |
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中国农业科学
2018,51(21
):4157
-4168. DOI:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.21.014
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摘要
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【目的】利用制作的猪的miRNA表达谱芯片筛选猪瘟病毒（classical swine fever virus,CSFV）感染PK-15细胞后表达有差异的miRNA,并进一步探讨其中表达差异较明显的miRNA的作用和功能,从miRNA的角度探究CSFV的致病机制,为猪瘟（classical swine fever,CSF）的防控提供新依据。【方法】为了研究CSFV感染PK-15细胞后miRNA表达的变化情况,根据miRBase version 19.0数据库中326条猪的miRNA合成探针,采用原位合成技术制作表达谱芯片,筛选得到CSFV感染PK-15细胞后表达有差异的miRNA。挑选CSFV感染PK-15细胞后表达差异最明显的miR-214作为进一步研究对象,研究miR-214在CSFV感染过程中的功能和作用。CSFV感染PK-15细胞后,用荧光定量PCR检测miR-214的mRNA表达水平。为了进一步研究miR-214对CSFV感染的影响,合成miR-214模拟物及抑制物,并分别转染PK-15细胞,转染后24 h感染CSFV,感染后48h用荧光定量PCR检测CSFV的基因拷贝数,用间接免疫荧光方法检测CSFV的病毒滴度。为了进一步探究miR-214参与调控CSFV复制的机制,通过生物信息学软件预测miR-214参与调控CSFV复制的靶蛋白,并用荧光素酶报告基因系统进一步确证miR-214能够靶向作用于凋亡通路中重要分子TNFR1 相关的死亡区域蛋白（TNF Receptor-Associated Death Domain,TRADD）,因此猜测miR-214通过影响靶蛋白TRADD的表达水平从而影响PK-15细胞凋亡,将miR-214模拟物及抑制物分别转染PK-15细胞,转染后24 h感染CSFV,同步设立不感染CSFV的细胞对照,感染后48 h用荧光定量PCR和Western blot分别检测TRADD的mRNA和蛋白表达量的变化,同时用流式细胞术检测miR-214对CSFV感染的PK-15细胞凋亡的影响。【结果】CSFV感染PK-15细胞后,通过表达谱芯片技术筛选得到69条表达有差异的miRNA,其中miR-214表达量上调且差异最明显。qRT-PCR结果显示,CSFV感染PK-15细胞后miR-214的mRNA表达量上调,验证了表达谱芯片的结果。将miR-214模拟物转染PK-15细胞后再感染CSFV, CSFV的基因拷贝数及病毒滴度均显著下降;转染miR-214抑制物后再感染CSFV,CSFV的基因拷贝数及病毒滴度均显著上升,表明miR-214促进了CSFV的复制。为了进一步探究miR-214促进CSFV复制的机制,用生物信息学软件预测TRADD为miR-214的靶蛋白,荧光素酶报告基因系统验证了miR-214能够靶向作用于TRADD。转染miR-214模拟物后,PK-15细胞中TRADD的mRNA和蛋白表达量均显著上升,而转染miR-214抑制物后,PK-15细胞中TRADD的mRNA和蛋白表达量均显著下降,表明miR-214抑制TRADD的表达。通过流式细胞术,验证了CSFV感染PK-15抑制细胞凋亡,miR-214抑制CSFV感染的PK-15细胞凋亡。【结论】CSFV感染PK-15后,上调细胞内miR-214的表达。miR-214能通过靶向抑制TRADD蛋白的表达,从而抑制PK-15细胞凋亡,促进CSFV在细胞内的复制。
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中国猪瘟净化之路：离我们还有多远?
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| 孙元,仇华吉 |
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中国农业科学
2018,51(21
):4169
-4176. DOI:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.21.015
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猪瘟是由猪瘟病毒引起猪的一种以高热、出血和高死亡率为主要特征的接触性传染病,给疫区国家的养猪业造成严重的经济损失。该病被世界动物卫生组织（OIE）列入须申报的动物疫病目录,我国将其列为一类动物疫病。《国家中长期动物疫病防治规划（2012-2020年）》将猪瘟列为5种优先防治和重点防范的动物疫病之一。我国老一辈科学家于上世纪50年代研制出闻名于世的猪瘟兔化弱毒疫苗（C株）,该疫苗安全、有效,对我国及世界范围内猪瘟的防控和根除发挥了关键作用。截止目前,全球共有30多个国家和地区根除了猪瘟。养猪业在我国畜牧业中占有主导地位,猪瘟对我国生猪及猪肉产品贸易具有重大影响。因此,我国必须走猪瘟净化之路。自上世纪中期我国提出了猪瘟根除战略,时至今日猪瘟仍未净化,主要原因有,我国地域辽阔、养猪环境复杂、养殖模式多样、动物疫病种类繁多、养猪从业人员素质和意识水平参差不齐、生物安全防控水平低等。目前我国已进入新时代,综合国力稳步提升,养殖业也朝着科学化、规模化、绿色环保化方向发展,科研支撑能力日益增强,已完全具备净化猪瘟条件：当前猪瘟的流行率较低;猪瘟疫苗生产工艺不断改进,质量也不断提升;新型猪瘟标记疫苗的研制取得突破性进展;相应的猪瘟检测、监测方法及与标记疫苗配套的鉴别诊断技术也已趋于成熟。更关键的是,我国养猪企业和养殖户也意识到了猪瘟净化的必要性,政府部门也在积极采取行动,制定相应的法规和政策,联合企业、养殖户、各级兽医部门等实施区域性净化。本文详细介绍了猪瘟在全球及我国的流行现状,探讨了我国猪瘟净化的重大意义及有利与不利条件,深入分析了我国猪瘟净化的成本及效益,全面总结了欧盟等国家净化猪瘟的成功经验,并对我国猪瘟净化思路和方案进行了探讨。笔者认为,中国猪瘟净化具有历史必然性、战略必要性、现实可能性、技术可行性,这一天的到来并非遥不可及。
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非洲猪瘟——我国养猪业的重大威胁
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| 罗玉子,孙元,王涛,仇华吉 |
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中国农业科学
2018,51(21
):4177
-4187. DOI:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.21.016
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非洲猪瘟（African swine fever, ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus, ASFV）感染家猪和野猪引起的一种烈性传染病,急性型临床上表现为高热、沉郁、厌食、皮肤发绀、各脏器出血,发病率和病死率可高达100%。世界动物卫生组织（OIE）将其列为法定报告动物疫病,我国将其列为一类动物疫病,是我国重点防范的外来动物疫病之一。ASF在撒哈拉以南的非洲地区、意大利撒丁岛、高加索地区以及俄罗斯和东欧部分国家流行,给疫区国家的养猪业造成巨大的经济损失,并严重冲击畜产品的国际贸易。2018年8月,ASF首次传入我国,随后迅速大范围蔓延,对我国养猪业构成重大威胁,防控形势异常严峻。随着经济全球化发展,ASF呈全球流行态势,持续传入我国的风险极高。鉴于目前无商业化的ASF疫苗,亟需研发可实现现场快速检测的早期诊断技术,做到对疫情早发现、早控制。由于ASFV具有庞大的基因组结构和复杂的免疫逃逸机制,使得研制有效的疫苗十分困难。目前研制的灭活疫苗、亚单位疫苗和核酸疫苗不能提供免疫保护或仅能提供部分保护,而减毒活疫苗和基因缺失疫苗可以诱导完全的同源保护和部分的交叉保护。未来需要深入解析病毒毒力相关基因和免疫保护性相关抗原,并着力研制基因缺失疫苗和弱毒疫苗,解决其安全性、稳定性和免疫效力等难题。本文就ASF的流行病学、诊断技术和疫苗研发等方面的最新研究进展及防控面临的挑战进行综述,并提出防控策略及建议,以期为我国ASF的防控提供参考。
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