过表达miR-129-5p抑制AMPK的表达与糖酵解进程

lincRNA Cox2通过miR-129-5p/AMPK调控BCG感染的巨噬细胞糖酵解进程

徐蕾, 于嘉霖, 刘莉, 邓光存, 吴晓玲

中国农业科学 2024, 57 (8): 1606-1619. DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2024.08.014

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【目的】探究lincRNA Cox2对BCG（Bacillus Calmette-Guérin）感染的RAW264.7巨噬细胞糖酵解进程的调控作用，阐明Mtb与巨噬细胞之间的相互作用，为结核病的诊断和治疗提供新的靶点。【方法】利用小干扰RNA敲减lincRNA Cox2的表达，以及使用miR-129-5p mimics过表达载体，结合BCG感染，通过实时荧光定量PCR检测lincRNA Cox2、miR-129-5p和促炎因子IL-1β、TNF-α、IL-6的表达量；乳酸含量检测试剂盒检测乳酸（LD）的分泌情况；平板涂布法检测巨噬细胞菌载量情况；双荧光素酶报告基因系统验证lincRNA Cox2与miR-129-5p以及miR-129-5p与AMPK的互作关系；蛋白免疫印迹检测AMPK（AMP依赖蛋白激酶）及糖酵解途径中关键基因HK1（己糖激酶1）、PKM2（丙酮酸激酶2）和LDHA（乳酸脱氢酶）的表达变化。【结果】 BCG感染12 h能够极显著上调RAW264.7巨噬细胞中lincRNA Cox2的表达（P =0.000013），与BCG组相比，siRNA+BCG组中AMPK（P =0.000771）、HK1（P =0.00323）、PKM2（P =0.000135）和LDHA（P =0.002532）的表达量以及乳酸的分泌量（P =0.020802）发生显著上调，而促炎因子IL-1β（P=0.000451）、TNF-α（P=0.000147）、IL-6（P =0.0001）的表达发生显著下调，菌载量试验表明siRNA+BCG组中的巨噬细胞菌载量显著下调（P =0.000127）。双荧光素酶报告基因系统表明lincRNA Cox2和miR-129-5p存在相互作用关系并以AMPK为靶基因。BCG感染RAW264.7巨噬细胞12 h后极显著下调miR-129-5p的表达（P =0.000156），与BCG组相比，miR-129-5p mimics+BCG组中AMPK（P=0.000262）、HK1（P =0.019524）、PKM2（P=0.001658）和LDHA（P =0.000887）表达量以及乳酸分泌量（P =0.044952）发生显著下调。【结论】 lincRNA Cox2通过海绵吸附miR-129-5p并靶向AMPK，促进BCG感染的RAW264.7巨噬细胞糖酵解进程。

图7 过表达miR-129-5p抑制AMPK的表达与糖酵解进程

A：miR-129-5p和AMPK的结合位点；B：双荧光素酶报告基因证明miR-129-5p和AMPK能够发生相互作用；C：在RAW264.7巨噬细胞中转染miR-129-5p过表达载体24 h并感染BCG 12 h后，Western blot检测AMPK及糖酵解关键酶的表达情况；D：定量分析RAW264.7巨噬细胞中AMPK的表达情况；E：定量分析RAW264.7巨噬细胞中HK1的表达情况；F：定量分析RAW264.7巨噬细胞中PKM2的表达情况；G：定量分析RAW264.7巨噬细胞中LDHA的表达情况；H：过表达miR-129-5p对乳酸分泌情况的影响