中国农业科学 ›› 2023, Vol. 56 ›› Issue (11): 2223-2236.doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2023.11.015
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杜静雅1,2(), 陈凯园2, 普金2, 周会英3, 祝光涛3, 张春芝2, 杜慧2(
)
收稿日期:
2023-02-07
接受日期:
2023-04-07
出版日期:
2023-06-01
发布日期:
2023-06-19
通信作者:
杜慧,E-mail:duhui01@caas.cn
联系方式:
杜静雅,E-mail:DuJingyaa@outlook.com。
基金资助:
DU JingYa1,2(), CHEN KaiYuan2, PU Jin2, ZHOU HuiYing3, ZHU GuangTao3, ZHANG ChunZhi2, DU Hui2(
)
Received:
2023-02-07
Accepted:
2023-04-07
Published:
2023-06-01
Online:
2023-06-19
摘要:
【目的】转基因技术的发展离不开筛选标记的完善与创新,其中的可视化筛选标记在转基因中的应用越来越广泛。近年来,经过突变获得的增强型黄绿荧光蛋白(an enhanced Yellow Green Fluorescent like Protein (eYGFP) under ultraviolet (UV),eYGFPuv(GFPuv))在365 nm紫外光线下能够发出强烈且稳定的绿色荧光,便于观察。构建GFPuv荧光筛选的基因编辑载体,并在马铃薯遗传转化中进行应用验证,为GFPuv荧光筛选在马铃薯转化中广泛应用提供技术支持,同时为后期利用基因组编辑技术创制马铃薯雄性不育系奠定基础。【方法】利用同源重组技术将GFPuv表达框架和基因编辑元件Cas9_sgRNA依次与pCAMBIA2300载体连接,并进行农杆菌介导的烟草瞬时转化试验;通过发根农杆菌Ar qual和MSU440转化马铃薯茎段,在便携紫外灯下观察,并统计荧光根;利用改造载体构建了6个马铃薯花药发育保守基因的编辑载体,通过发根农杆菌体系转化2种马铃薯材料,验证转化效率和编辑效率;利用改造载体对马铃薯进行遗传转化。【结果】成功构建了GFPuv荧光筛选的基因编辑载体pCAMBIA2300MGFPuv-sgRNACas,瞬时转化烟草证实GFPuv表达框架能正常表达;2种发根农杆菌的转化均筛选到绿色荧光的毛状根,加入卡那霉素(kanamycin,Kan)显著提高阳性荧光根的比例,2种菌的转化效率差异不大,但MSU440的发根形成速度更快;6个马铃薯花药发育保守基因的编辑载体在2种马铃薯材料中的转化效率和编辑效率是一致的,但不同靶位点的编辑效率差异较大;改造载体遗传转化马铃薯证实GFPuv荧光可用于马铃薯愈伤组织和再生苗的筛选。【结论】发根农杆菌遗传转化体系是基因编辑效率验证的重要途径,GFPuv荧光可用于马铃薯转化的筛选。
杜静雅, 陈凯园, 普金, 周会英, 祝光涛, 张春芝, 杜慧. 高效GFPuv荧光筛选基因编辑载体的改造及其在马铃薯遗传转化中的应用[J]. 中国农业科学, 2023, 56(11): 2223-2236.
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表1
载体构建引物名称和序列"
引物名称 Primer name | 引物序列 Primer sequence (5′-3′) |
---|---|
CZ1F | aagcactctttcctgtggATAGCACGTACATTG |
CZ1R | ccacaggaaagagtgcttTTCGACCTTTTTCCCCTG |
CZ2F | cgagagtgtcgtgctccaccatgttggTGAGACTTTTCAACAAAGGGTAATATC |
CZ2R | ggctagagcagcttgccaacatggtggTGTGTACAGATATATGTTGAATTATTGAGC |
CZ3F | gagctcggtacccggggatccGATACCGTCGAATCTTGCTGAAA |
CZ3R | tgcctgcaggtcgactctagaGCTGCAAGGCGATTAAGTTGG |
StAMSCZF | tcgaagtagtgattgTGCTTGTGATTTACTGGCTCGTTTTAGAGCTAGAAATAGC |
StAMSCZR | ttctagctctaaaacACAGACAGTCTCCCCTGCAGCAATCTCTTAGTCGACTCTAC |
StDYT1CZF | tcgaagtagtgattgGGCGTCAAAAACTTAGCGAAGTTTTAGAGCTAGAAATAGC |
StDYT1CZR | ttctagctctaaaacAAGTGAGCAGCTTCTTGAAACAATCTCTTAGTCGACTCTAC |
StMS1aCZF | tcgaagtagtgattgATTGGAGCTTGTGTAGAAGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC |
StMS1aCZR | ttctagctctaaaacGGCAAGTCAGAAGAAGTAGGCAATCTCTTAGTCGACTCTAC |
StMS1bCZF | tcgaagtagtgattgTGTGATCACTGTCGATGTGCGTTTTAGAGCTAGAAATAGC |
StMS1bCZR | ttctagctctaaaacCCCTCAATTCCATTAAGTGACAATCTCTTAGTCGACTCTAC |
StMYB80CZF | tcgaagtagtgattgGTGATAGCTGCTCAACTTCCGTTTTAGAGCTAGAAATAGC |
StMYB80CZR | ttctagctctaaaacAGTGCTGCTTCAGCCAAATGCAATCTCTTAGTCGACTCTAC |
StTDF1CZF | tcgaagtagtgattgGAAAAAGCTGTAGGCTGAGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGC |
StTDF1CZR | ttctagctctaaaacTACTCAGCAAAGACCTGAGCCAATCTCTTAGTCGACTCTAC |
表2
靶点检测引物"
用途 Purposes | 引物名称 Primer names | 引物序列 Primer sequences (5′-3′) |
---|---|---|
StAMS靶位点扩增 Amplification of StAMS target site | AMSsiteCeF | CTCATGGAGAGGCTTAGGCC |
AMSsiteCeR | GCATCCATCTCACTCATGTACC | |
StDYT1靶位点扩增 Amplification of StDYT1 target site | DYT1siteCeF | ATGGTAGTAATTAGGTGTGC |
DYT1siteCeR | AGCTTAGTTGGGCCAATGTG | |
StMS1a靶位点扩增 Amplification of StMS1a target site | MS1asiteCeF | TCGTCAATAGTGATGGAGCC |
MS1asiteCeR | CAATTGCGGCACTCTAACTCC | |
StMS1b靶位点扩增 Amplification of StMS1b target site | MS1bsiteCeF | AGAGAAGAAGAAGGGAGTGTCG |
MS1bsiteCeR | GCTTCCTGGATACATCTTCC | |
StMYB80靶位点扩增 Amplification of StMYB80 target site | MYB80siteCeF | GTATGTTGCTCAGACTCTCTG |
MYB80siteCeR | TACTAGATGTTGCTCCTACAC | |
StTDF1靶位点扩增 Amplification of StTDF1 target site | TDF1siteCeF | GCATTCATTACATCCGTCTTGTG |
TDF1siteCeR | CCCTTGTGTAGATTTGAGTGGAG | |
StAMS靶位点1的Hi-TOM测序扩增 Hi-TOM sequencing amplification of StAMS target site1 | TomAMSsite1F | ggagtgagtacggtgtgcGCTGCTGTGGTGGAGCTGAG |
TomAMSsite1R | gagttggatgctggatggACATGTACCCGCAGTCTAGC | |
StAMS靶位点2的Hi-TOM测序扩增 Hi-TOM sequencing amplification of StAMS target site2 | TomAMSsite2F | ggagtgagtacggtgtgcCTAGCAGAAGATGAGAAAGTC |
TomAMSsite2R | gagttggatgctggatggTGAATGGAGGAAGGAAGTTC | |
StDYT1靶位点的Hi-TOM测序扩增 Hi-TOM sequencing amplification of StDYT1 target site | TomDYT1siteF | ggagtgagtacggtgtgcGGAAGCAAATTGATGGTGAA |
TomDYT1siteR | gagttggatgctggatggGTCTCCGGTTCCTCCCCATG | |
StMS1a靶位点的Hi-TOM测序扩增 Hi-TOM sequencing amplification of StMS1a target site | TomMS1asiteF | ggagtgagtacggtgtgcGGGGCAACAATTTGATGTGC |
TomMS1asiteR | gagttggatgctggatggGTCCAATGCAAAGTCGATCCC | |
StMS1b靶位点1的Hi-TOM测序扩增 Hi-TOM sequencing amplification of StMS1b target site1 | TomMS1bsite1F | ggagtgagtacggtgtgcGCATAAGAGTAAAGGTGTGC |
TomMS1bsite1R | gagttggatgctggatggCCGACAAATCCCCAAAACCC | |
StMS1b靶位点2的Hi-TOM测序扩增 Hi-TOM sequencing amplification of StMS1b target site2 | TomMS1bsite2F | ggagtgagtacggtgtgcTACCAGCTGATAGTGAATGG |
TomMS1bsite2R | gagttggatgctggatggGTGCAAATACGATCCCAGAG | |
StMYB80靶位点的Hi-TOM测序扩增 Hi-TOM sequencing amplification of StMYB80 target site | TomMYB80siteF | ggagtgagtacggtgtgcTATGATTTACGCGTAATTGAACAG |
TomMYB80siteR | gagttggatgctggatggGATGAAGCATTTCATCTTTG | |
StTDF1靶位点的Hi-TOM测序扩增 Hi-TOM sequencing amplification of StTDF1 target site | TomTDF1siteF | ggagtgagtacggtgtgcCTAACATCATTCATGTGCAGG |
TomTDF1siteR | gagttggatgctggatggGCATTTTGAATTGGGAGACC |
表3
荧光根的基因编辑位点PCR鉴定的统计分析"
基因 Gene | 材料 Materials | 荧光根数 No. of fluorescent root | 带型 Band type | ||
---|---|---|---|---|---|
野生型 Wild type | 杂合型 Heterozygous type | 纯合突变型 Homozygous type | |||
StAMS | A056 | 48 | 43 | 3 | 1 |
PG6359 | 48 | 44 | 4 | 0 | |
StDYT1 | A056 | 48 | 37 | 8 | 3 |
PG6359 | 48 | 45 | 3 | 0 | |
StMS1a | A056 | 48 | 38 | 5 | 5 |
PG6359 | 48 | 40 | 5 | 3 | |
StMS1b | A056 | 48 | 37 | 9 | 2 |
PG6359 | 48 | 39 | 8 | 1 | |
StMYB80 | A056 | 48 | 35 | 7 | 6 |
PG6359 | 48 | 36 | 6 | 6 | |
StTDF1 | A056 | 48 | 44 | 3 | 1 |
PG6359 | 48 | 45 | 2 | 1 |
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Abstract 386
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