FgGyp8通过调节FgSnc1介导的分泌囊泡与质膜融合影响禾谷镰刀菌的生长发育和致病性
禾谷镰刀菌是一种重要的植物病原真菌，可引起小麦、大麦等多种禾谷类农作物致病及减产。模式真菌酿酒酵母中Gyp8蛋白能水解GTP激活态的Ypt1（Rab1）。然而，在植物病原真菌中Gyp8同源蛋白的功能仍然是未知的。本研究从遗传学和病理学的角度对禾谷镰刀菌中Gyp8同源蛋白FgGyp8的功能进行研究。通过基因敲除和表型分析，我们发现FgGyp8是禾谷镰刀菌营养菌丝生长所必需的。突变体ΔFggyp8的分生孢子产量、大小及隔膜数与野生型PH-1相比都显著下降。进一步发现FgGyp8对禾谷镰刀菌小麦胚芽鞘及麦穗的致病性起重要作用。FgGyp8包含有一个保守TBC（Tre2-Bub2-Cdc16）结构域，结构域缺失结果表明，FgGyp8的TBC结构域、C末端和N末端对其生物学功能均有重要调控作用。体外水解酶活性实验结果显示FgGyp8是FgRab1的GTP酶激活蛋白（GAP，GTPase-activating protein）。此外，FgGyp8对FgSnc1蛋白介导的分泌囊泡与质膜的融合过程是必需的。最后，我们发现FgGyp8与禾谷镰刀菌FgRab1的另一个GAP FgGyp1存在功能冗余。综上所述，本研究表明FgGyp8作为FgRab1的GAP，是禾谷镰刀菌营养菌丝生长、分生孢子形态建成、致病性所必需的。
过氧化物酶体内基质主要包括氧化酶、过氧化氢酶和过氧化物酶等，它们调节细胞氧化稳态和功能，绝大部分的基质含过氧化物酶体靶向信号（PTS）并由PTS受体运输入内。本文研究发现过氧化物酶体靶向信号类型1（PTS1) 受体Pex5的缺失影响了病原真菌轮枝镰刀菌多种生物学功能，结果将有助于阐明 Pex5致病及产毒的分子机制，并为控制病害和减少伏马菌素 B1（FB1）的毒害提供理论依据。同源重组的方法构建FvPEX5敲除突变体（ΔFvpex5），继而构建敲除突变体的互补菌株。通过比较野生型，敲除突变体和互补菌株三者的表型，我们探究并验证FvPex5在轮枝镰刀菌中的生物学功能；进一步通过RNA-Seq 分析ΔFvpex5中表达差异的PTS蛋白，并结合GO和KEEG注释进而解析FvPex5影响生物学功能的原因。研究发现轮枝镰刀菌 PTS1受体 FvPex5 参与 PTS1 的定位、碳源和脂质的利用、消除 ROS、细胞壁应激反应、分生孢子的形成、FB1产生以及致病性。在ΔFvpex5 突变体，RNA-Seq 分析发现差异表达的PTS1、PTS2、 PTS 相关途径中的过氧化物酶体相关基因（PEX）和 FB1 毒素相关基因，并进一步通过RT-PCR 证实这些基因的差异表达。此外，结合GO和KEEG注释，发现ΔFvpex5突变体中差异表达的PTS1、PTS2基因在碳代谢、氮代谢、脂质代谢和氧化平衡等多种生化途径中富集。FvPex5 参与了 PTS 相关基因的调控，从而影响了轮枝镰刀菌的氧化平衡、FB1产量和致病性。本研究首次发现了FvPex5对伏马毒素FB1合成起调节作用，并首次对轮枝镰刀菌中的过氧化物酶体靶向信号(PTS)蛋白进行了预测及功能分析。
由稻瘟病菌引起的稻瘟病，是一种制约世界水稻生产的真菌病害。长期的生产实践表明，将持久广谱的抗性基因导入高产水稻品种，是防治该病害的首选。位于第11号染色体上的抗瘟基因 Pik 基因座，至少含有 Pi-1、Pik-h、Pi-k、Pik-m、Pik-s和Pik-p等6个重要的抗病基因；但由于当前缺乏适用的分子标记，限制了该基因座功能基因在抗病育种中的广泛应用。为了更好地在分子育种中利用该基因座的功能基因，开发Pik 基因座功能基因的特异性标记并用其分型种质资源具有重要意义。基于此，本研究通过对Pi-1、Pik-h、Pi-k、Pik-m、Pik-s、Pik-p等功能基因和非功能基因位点之间的序列广泛比较，获得了一个在这些功能基因启动子区-1015-bp处Pik-p缺失19-bp和一个在这些功能基因末端+6816-bp处Pi-1插入11-bp的的多态性位点，并据此分别开发出两个能精确区分出Pik-p、Pi-1和K型功能等位位点的Pikp-Del和Pi1-In标记；进一步通过结合稻瘟病菌室内接种和已有的dCAPS标记Pi1FNP和dCAPS-795鉴定，对这两个标记鉴定结果的准确性进行了评价。结果显示，我们鉴定的基因型与稻瘟病人工接种抗性表现和两个dCAPS标记的鉴定的结果完全一致。另外，我们还利用Pikp-Del和Pi1-In标记对531份水稻品种和育种材料进行了基因分型，结果表明，5份材料含有Pik-p基因，8份材料含有Pi-1基因，说明这两个基因在我国水稻稻瘟病抗性育种中还没有被充分利用；另外还有256份携带K型等位基因，这些材料可作为抗稻瘟病育种的种质资源。综上，Pikp-Del和Pi1-In标记可以实现对Pik-p、Pi-1和K型功能等位基因的精准检测，结合标记分型的种质资源，将会加速Pik-p 和Pi-1以及Pik 基因座的其它功能基因在抗病育种中的应用。
细胞自噬通过维持细胞内物质与能量的动态平衡，进而调控很多发育过程。已知延伸复合物蛋白Elp3具有多种功能并参与调控自噬，但其在稻瘟病菌中的功能仍不清楚。为此，构建了稻瘟病菌Elp3编码基因PoELP3（MGG_05481）的敲除突变体，对其功能进行研究。表型分析结果显示，PoELP3基因的敲除导致稻瘟病菌菌丝生长受抑制，产孢量下降，对细胞壁胁迫剂和盐胁迫剂的敏感性增强，附着胞膨压和致病性显著下降。这些结果表明稻瘟病菌PoElp3在生长发育、胁迫响应和致病过程中均具有重要作用。亚细胞定位结果表明GFP-PoElp3融合蛋白定位于细胞核和细胞质中。为检测稻瘟病菌Elp3在细胞自噬中的作用，将自噬标记GFP-PoAtg8分别导入野生型和突变体中，并通过计算总蛋白中游离GFP占GFP-PoAtg8和游离GFP总量的比例，评估野生型和突变体中自噬的水平。结果表明，无论是在营养充分还是营养不足的条件下，△Poelp3突变体均呈现较高的自噬水平。这可能是导致菌丝生长缓慢的原因。此外，△Poelp3突变体营养菌丝和侵染菌丝的生长均对雷帕霉素更加敏感，但是PoELP3基因的缺失并不影响雷帕霉素对TOR-信号途径下游基因的转录抑制，暗示其并不参与TOR-信号的传导。综上所述，稻瘟病菌Elp3可以通过调控自噬影响无性发育和致病性。但是PoElp3调控自噬的机制仍有待进一步研究。
