内蒙古白绒山羊,胸腺素β4,皮肤特异性表达载体,稳定转染," />
内蒙古白绒山羊,胸腺素β4,皮肤特异性表达载体,稳定转染,"/>
inner Mongolia Cashmere Goat fetal fibroblast,Thymosin beta 4(Tβ4),skin-follicle-cell-specific expression vector,stable transfection
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中国农业科学 ›› 2010, Vol. 43 ›› Issue (21): 4497-4504 .doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2010.21.020
王彦凤,梁燕,金永,王晓晶,郭旭东,王玮,王潇,王志钢,刘东军#br#
WANG Yan-feng, LIANG Yan, JIN Yong, WANG Xiao-jing, GUO Xu-dong, WANG Wei,WANG Xiao, WANG Zhi-gang, LIU Dong-jun#br#
摘要:
【目的】克隆内蒙古白绒山羊胸腺素β4(thymosin beta 4,Tβ4) 基因,构建皮肤特异性表达载体,转染内蒙古白绒山羊胎儿成纤维细胞,筛选出稳定表达红色荧光蛋白并可用于核移植的转基因细胞克隆。【方法】通过RT-PCR克隆Tβ4基因cDNA序列,然后与KAP6-1基因启动子片段以及红色荧光蛋白表达元件连接构成Tβ皮肤特异性表达载体pCDsRed-KT。外源表达载体以lipofectamineTM 2 000介导转染胎儿成纤维细胞,通过G418筛选获得稳定转染的细胞克隆。PCR鉴定外源基因在细胞基因组中的整合。【结果】 克隆了内蒙古白绒山羊Tβ4基因,cDNA全长142 bp,其中包含135 bp的完整ORF,编码44个氨基酸残基,氨基酸序列与已报道的牛胸腺素β4(XM002706880.1)同源性为100%。测序显示构建的表达载体pCDsRed-KT中,Tβ4基因正确连接在皮肤特异性启动子KAP6-1下游,顺序连接CMV启动子和红色荧光蛋白基因,载体构建正确。PCR检测显示外源KAP6-1启动子和Tβ4基因整合到细胞基因组中,筛选出的转基因细胞高效表达红色荧光蛋白。【结论】克隆得到内蒙古白绒山羊Tβ4基因并构建成功其真核表达载体,可稳定转染绒山羊胎儿成纤维细胞,为下一步通过核移植方法获得转胸腺素β4基因绒山羊提供了条件。